不同檢測(cè)方法在羊水細(xì)胞性染色體嵌合產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用比較

周 靜,周 冉,王玉國(guó),李 璃,劉 安,季修慶,王 艷,許爭(zhēng)峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院，南京 210004)

染色體嵌合體，即兩個(gè)或兩個(gè)以上不同細(xì)胞系同時(shí)存在于同一個(gè)體，在人類囊胚植入前后普遍存在，可能導(dǎo)致遺傳異常、流產(chǎn)、死產(chǎn)[1]。羊水細(xì)胞性染色體嵌合體是指同一個(gè)羊水細(xì)胞標(biāo)本中出現(xiàn)兩種或兩種以上的性染色體核型[2]。性染色體嵌合是由多種機(jī)制產(chǎn)生的，主要是體細(xì)胞合子后突變的結(jié)果，受精后在滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)分化之前發(fā)生細(xì)胞分裂中、后期同源染色體或姐妹染色體單體不分離，或在細(xì)胞分裂后期發(fā)生染色體丟失，這種嵌合發(fā)生在胎盤和胎兒組織，稱之為一般的嵌合現(xiàn)象，于卵裂期或囊胚期進(jìn)行著床前出現(xiàn)，在人類胚胎生長(zhǎng)過程中常見;另一種是局限的嵌合體，發(fā)生在妊娠后期(胎兒和胎盤分隔后)，異常細(xì)胞可能局限于胎兒或者胎盤(局限性胎盤嵌合，CPM)，或者在大腦、性腺以及其他部位[3]。

羊水中性染色體嵌合，特別是胎兒真性嵌合的發(fā)生率較低。羊水細(xì)胞性染色體嵌合的診斷在分子診斷技術(shù)興起之前，主要依賴于羊水細(xì)胞培養(yǎng)后的核型分析。隨著技術(shù)更新，分子技術(shù)在產(chǎn)前診斷技術(shù)應(yīng)用中常規(guī)化后，為了得到更真實(shí)的羊水細(xì)胞中性染色體的比例，其中一些技術(shù)根據(jù)臨床需要對(duì)未培養(yǎng)的羊水標(biāo)本進(jìn)行直接檢測(cè)，而因各個(gè)技術(shù)本身存在的一些局限性，得到的信息需與經(jīng)典的核型結(jié)果相結(jié)合，為產(chǎn)前診斷咨詢服務(wù)，更有助于科學(xué)地指導(dǎo)和服務(wù)臨床。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2019年12月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷門診就診的孕婦。孕婦有明確的產(chǎn)前診斷指征，對(duì)各種羊水細(xì)胞檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)知情，同意行羊膜腔穿刺術(shù)獲取羊水進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。孕婦年齡18～46歲，孕周19～24周，共5085例羊水標(biāo)本。

1.2 研究方法 超聲定位后無菌鋪巾，進(jìn)行羊膜腔穿刺，為了防止母體污染，先抽取2ml淡黃色羊水棄去，再抽取30ml淡黃色羊水。將20ml分別注入2個(gè)無菌離心管離心，置2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶37℃、5%CO2孵育1周，換羊水培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～48h，倒置顯微鏡觀察收獲，G顯帶，核型分析。取10ml羊水提取羊水細(xì)胞DNA，行MLPA檢測(cè)。對(duì)G顯帶提示為性染色體嵌合體的孕婦，比較其MLPA和(或)CMA結(jié)果，或距上次穿刺間隔2周以上重新抽取羊水進(jìn)行FISH檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 羊水細(xì)胞染色體核型分析技術(shù) 取兩份10ml羊水細(xì)胞，1800r/min離心10min。早期標(biāo)本(2019年前)保留2ml羊水，重懸后移至有4ml羊水培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。近期標(biāo)本(2019年后)棄上清，分別用1ml新鮮羊水細(xì)胞培養(yǎng)基重懸后，移至原位培養(yǎng)玻片上進(jìn)行培養(yǎng)。5.5%CO2、37℃培養(yǎng)8天，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況收獲，G顯帶后分析(參照ISCN2013和2016)。

1.3.2 羊水細(xì)胞DNA提取 10ml羊水細(xì)胞1800r/min離心10min，棄上清。使用MagCore Genome DNA Tissue Kit(CONCETBio)按操作說明在MagCore Nucleic Acid Extractor提取基因組DNA。在Nanodrop測(cè)定DNA濃度。

1.3.3 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù) 按多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)試劑盒(MRC)操作說明對(duì)基因組DNA進(jìn)行變性、雜交、連接、擴(kuò)增，于3500測(cè)序儀(ABI)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 染色體微陣列檢測(cè) 染色體微陣列檢測(cè)(chromosome microarray,CMA)按Affymetrix?RCytoScanTM操作說明對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行消化、連接、PCR、純化、片段化、標(biāo)記、雜交，最后洗脫、染色、掃描，數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 熒光原位雜交技術(shù) 取5ml羊水，進(jìn)行消化、低滲、固定、制片、變性、孵育、洗脫，DAPI復(fù)染，最后鏡檢。

2 結(jié) 果

2.1 MLPA、CMA及FISH檢測(cè)結(jié)果 5085例羊水標(biāo)本中，共有22例孕婦的胎兒性染色體為嵌合體(表1)。22例孕婦的23例胎兒的羊水標(biāo)本中，20例進(jìn)行MLPA檢測(cè)，其中10例未提示異常，1例為Xp缺失，2例為45，XO，1例性染色體異常(Y信號(hào)減半)，1例45，XO(但有微弱Y信號(hào))，1例47，XYY,1例48,XXY,+21,1例46,XX，疑Xq23區(qū)段微缺失嵌合，1例47,XX,+21,1例疑似XO/XY嵌合;9例進(jìn)行CMA檢測(cè)，其中3例45,XO，1例47,XXX，2例46,XX，1例45,XO[33.3%]/46,XX[66.7%],1例45,XO[90%]/46,XY[10%]，1例45,XO[50%]/46,XY[50%];4例進(jìn)行FISH檢測(cè)，1例孕婦的雙胞胎因外院超聲提示：?jiǎn)谓q雙胎，先選擇一個(gè)胎兒進(jìn)行羊膜腔穿刺，因核型提示為嵌合體，后對(duì)兩個(gè)胎兒重新抽羊水培養(yǎng)核型分析并進(jìn)行了未培養(yǎng)羊水的FISH檢測(cè)，分別為XYY[89%]/XX[5.5%]/XY[5.5%]和XYY[69%]/XO[23%]/XX[3%]/XY[5%]，l例45,XO[10%]/46,XX[90%]，1例為外院結(jié)果提示47,XXY[>60%]/46,XY[<40%]。見表1。

2.2 隨訪 22例孕婦對(duì)不同檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果和意義充分知情后，16例選擇終止妊娠，6例選擇繼續(xù)妊娠。新生兒出生體重2450～4500g，身長(zhǎng)50～51cm，出生時(shí)1min Apgar評(píng)分均為10分，外生殖器發(fā)育暫無異常，拒絕出生時(shí)行外周血染色體檢查。見表1。

表1 23例胎兒性染色體核型為嵌合體病例的檢測(cè)適應(yīng)證、核型、MLPA、CMA、FISH檢測(cè)結(jié)果及隨訪

3 討 論

羊水中的細(xì)胞來源比較多樣[3]，為各個(gè)胚層脫落細(xì)胞的混合物。其中胎兒皮膚脫落細(xì)胞為主要成分，來源于外胚層;泌尿系統(tǒng)和臍帶脫落細(xì)胞來源于中胚層;呼吸系統(tǒng)和消化道脫落細(xì)胞來源于內(nèi)胚層;此外，還有胎膜等脫落細(xì)胞。染色體核型嵌合體的形成，可能由于父系因素、母系因素或外源性因素(如培養(yǎng)基)而導(dǎo)致。嵌合現(xiàn)象的臨床后果取決于涉及到哪條染色體，何時(shí)發(fā)生的錯(cuò)誤。減數(shù)分裂的錯(cuò)誤或者極早期有絲分裂的錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致一般的嵌合現(xiàn)象，特定細(xì)胞系的有絲分裂錯(cuò)誤通常導(dǎo)致局限的嵌合。由于孕中期羊水取材，核型嵌合體的羊水細(xì)胞標(biāo)本只能反映胎兒不同胚層的細(xì)胞核型存在差異，但無法區(qū)分胚層來源和各個(gè)組織器官真實(shí)的嵌合比例，難以評(píng)估表型嚴(yán)重程度。但一般而言，正常細(xì)胞比例越低，胎兒出現(xiàn)相應(yīng)染色體疾病的可能性越大，表型也就更明顯[4]。

對(duì)羊水細(xì)胞性染色體運(yùn)用細(xì)胞或分子生物學(xué)方法檢測(cè)時(shí)，大多數(shù)情況，胎兒各個(gè)胚層及胎盤的各種方法的檢測(cè)結(jié)果是一致的。但是出現(xiàn)染色體性嵌合體時(shí)，嵌合現(xiàn)象的臨床診斷依賴于許多方面。因培養(yǎng)后的核型結(jié)果存在克隆的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)和細(xì)胞株變異的可能，MLPA對(duì)低比例嵌合的檢出率低，CMA對(duì)性染色同源區(qū)域特別是Y染色體的不敏感性和對(duì)低比例嵌合檢出率較低，F(xiàn)ISH探針的假陰性或者假陽(yáng)性信號(hào)等[5]，需結(jié)合技術(shù)特點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

本研究中，為了避免母源性污染，首先對(duì)提取的羊水DNA標(biāo)本聯(lián)合父母外周血基因組DNA進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列(Trios-STR)分析，確認(rèn)無母體標(biāo)本污染后再進(jìn)行檢測(cè)。本研究早期病例因可選擇的技術(shù)有限，有些結(jié)論可能相對(duì)失真;后期越來越多的病例用不同方法檢測(cè)得到的結(jié)果不同，考慮可能與不同檢測(cè)方法的偏向性有關(guān)。如2號(hào)病例MLPA結(jié)果與超聲軟指標(biāo)相符，核型中的46,XX可能是培養(yǎng)造成的優(yōu)勢(shì)克隆生長(zhǎng)，綜合超聲情況和MLPA檢測(cè)結(jié)果，夫婦直接選擇了終止妊娠。4號(hào)病例因MLPA(能檢查30%以上的嵌合)結(jié)果未提示異常，這也提示胎兒47,XXY的嵌合比例實(shí)際可能比核型檢測(cè)的比例低，經(jīng)遺傳咨詢，夫婦選擇繼續(xù)妊娠。5、7、15號(hào)的CMA結(jié)果可能是CMA對(duì)X染色體檢測(cè)敏感性不高，對(duì)X信號(hào)減少的XO判斷不準(zhǔn)確導(dǎo)致的，而MLPA對(duì)低比例的檢出率較低，這也在一定程度上提示胎兒的實(shí)際XO的核型比例可能更低。8、13、16號(hào)病例中，可能因胎兒的45,XO的實(shí)際比例低，MLPA或CMA檢測(cè)時(shí)未提示異常。18號(hào)病例的48,XXX,+21可能實(shí)際為低比例，在培養(yǎng)中出現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)。9號(hào)病例外院的復(fù)檢結(jié)果與本院MLPA的結(jié)果一致，推測(cè)核型的結(jié)果可能為優(yōu)勢(shì)克隆的培養(yǎng)偏差，在羊水細(xì)胞中低比例的45,XO出現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，這種情況可能也出現(xiàn)在了14號(hào)病例中。12號(hào)病例因早期超聲提示為單絨雙胎而選擇了1個(gè)胎兒穿刺，嵌合的核型及其與MLPA結(jié)果不一致，提示對(duì)2個(gè)胎兒分別進(jìn)行培養(yǎng)和FISH檢測(cè)，而再次穿刺的結(jié)果又出現(xiàn)了變化，檢測(cè)結(jié)果提示在培養(yǎng)過程中XYY細(xì)胞系丟失，正常的XY細(xì)胞成為優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)細(xì)胞，細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過程中可能發(fā)生不正常分裂和增殖從而導(dǎo)致嵌合體的類型和比例出現(xiàn)失真。其余病例的羊水核型結(jié)果與MLPA結(jié)果基本相符，染色體核型分析具備明確染色體嵌合類型的優(yōu)勢(shì)。MLPA、CMA、FISH都是進(jìn)行的未培養(yǎng)標(biāo)本的檢測(cè)，其優(yōu)點(diǎn)在于更能反映細(xì)胞或拷貝數(shù)的真實(shí)狀態(tài)[6-7]，但因各項(xiàng)技術(shù)的局限性，未培養(yǎng)標(biāo)本可能不能很好地反映性別染色體嵌合體的真實(shí)核型[8]。以上分析的各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果，是根據(jù)技術(shù)本身的特點(diǎn)得出的結(jié)論，具體機(jī)制需進(jìn)一步去驗(yàn)證。

僅根據(jù)一種檢測(cè)方法得出結(jié)論遠(yuǎn)遠(yuǎn)不符合性染色體嵌合的診斷要求，易在產(chǎn)前診斷咨詢中誤導(dǎo)就診者，導(dǎo)致錯(cuò)誤的妊娠結(jié)局。在核型提示為嵌合體的情況下，應(yīng)盡可能采用有助于診斷的各種方法，同時(shí)減少取樣次數(shù)。經(jīng)長(zhǎng)期的類似病例的經(jīng)驗(yàn)積累和技術(shù)積累，綜合考量核型分析在分析染色體結(jié)構(gòu)和嵌合體方面有較為明顯的優(yōu)勢(shì)，F(xiàn)ISH對(duì)于性染色體數(shù)目檢測(cè)的相對(duì)準(zhǔn)確性，MLPA對(duì)性染色體上目標(biāo)位點(diǎn)的特異性[9]，CMA利于檢測(cè)染色體微缺失微重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)[10]。認(rèn)為在沒有性染色體結(jié)構(gòu)異常的情況下，核型分析結(jié)合FISH和(或)MLPA即可判斷嵌合體比例，MLPA可作為對(duì)原代樣本FISH檢測(cè)的輔助，以防FISH信號(hào)失真;如出現(xiàn)了性染色結(jié)構(gòu)異常染色體的嵌合，核型分析結(jié)合CMA和MLPA和(或)FISH較好，這有助于染色體的微缺失微重復(fù)的明確。

綜上所述，對(duì)性染色體嵌合體進(jìn)行診斷時(shí)，核型檢測(cè)在體外培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)細(xì)胞異常分裂和增長(zhǎng)，以及本身存在的優(yōu)勢(shì)克隆培養(yǎng)的偏向性。因此，應(yīng)對(duì)傳統(tǒng)的以核型培養(yǎng)為“金標(biāo)準(zhǔn)”的觀念進(jìn)行適當(dāng)修正。對(duì)于出現(xiàn)嵌合核型特別是性染色體嵌合的孕婦，要告知各種檢測(cè)方法的優(yōu)劣性，選擇合適的技術(shù)組合進(jìn)行檢測(cè)，綜合評(píng)定出最接近實(shí)際情況的結(jié)論，為孕婦的最終選擇提供最科學(xué)的依據(jù)。