發(fā)酵法生產(chǎn)利普司他汀的研究進(jìn)展

李玲，于泳，胡永紅

（1 東南大學(xué)成賢學(xué)院制藥與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇南京210088；2 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211816）

利普司他汀，分子式為C29H49NO5，分子量491.708，CAS 編號96829-59-3，化學(xué)名為(2S,3S,5S,7Z,10Z)-5-[(S)-2-甲酰胺基-4-甲基戊酰氧基]-2-己基-3-羥基-7,10-十六二烯酸內(nèi)酯，淡黃色油狀液體，幾乎不溶于水，易溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷。該化合物含一個(gè)β-內(nèi)酯環(huán)、兩個(gè)鏈長為6 個(gè)碳和13 個(gè)碳的脂肪族側(cè)鏈，13 個(gè)碳側(cè)鏈包含兩個(gè)獨(dú)立的雙鍵和一個(gè)羥基酯化成N-甲酰亮氨酸（結(jié)構(gòu)如圖1）[1-2]。

圖1 利普司他汀和THL的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 利普司他汀及其四氫衍生物臨床應(yīng)用概述

利普司他汀能選擇性抑制腸道中的胰脂肪酶活性，減少脂肪的水解和吸收，其活性中心為化合物結(jié)構(gòu)中的β-內(nèi)酯環(huán)[2]，但其結(jié)構(gòu)中13碳原子的長鏈含有兩個(gè)獨(dú)立雙鍵，該雙鍵的存在導(dǎo)致其穩(wěn)定性較差。瑞士羅氏（Roche）公司將利普司他汀中兩個(gè)雙鍵催化加氫， 得到四氫利普司他?。╰etrahydrolipstatin，THL，結(jié)構(gòu)式如圖1），即奧利司他（orlistat），于1998 年被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)作為治療肥胖癥藥物上市，是目前上市的唯一非中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物[3-4]，現(xiàn)在全球主要地區(qū)都已上市。該藥物不同于作用于神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)的傳統(tǒng)減肥藥，無頭暈、心悸等不良反應(yīng)。在膽汁鹽的參與下，利普司他汀和胰脂肪酶結(jié)合，通過活性部位絲氨酸殘基酰化來抑制胰脂肪酶的催化活性，從而降低消化道中脂肪的消化和吸收，該情況下腸道內(nèi)持續(xù)處于油相狀態(tài)，膽固醇同時(shí)也被隔離出來，阻斷食物中約30%脂肪的水解和吸收，從而達(dá)到控制體重的目的[5-6]。

奧利司他在降“三高”（降血脂、降血糖、降血壓）方面療效顯著。臨床研究表明，服用奧利司他能有效降低血液中總膽固醇、降低LDL/HDL（低密度脂蛋白膽固醇/高密度脂蛋白膽固醇）比例以及LDL、甘油三酯的水平，還可以降低空腹時(shí)的血糖和胰島素水平，改善血糖耐受性，增加胰島素敏感性，減少低血糖治療的需求，另外還可以降低血壓，縮小腰圍[7-8]，能較好地控制或預(yù)防高脂血癥、代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病[9]。

奧利司他為抗腫瘤治療提供了新思路。脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）是脂肪酸合成中的關(guān)鍵酶，同時(shí)在胚胎發(fā)育、肥胖癥和癌癥生物學(xué)等領(lǐng)域具有重要功能[10]。Agostini 等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、前列腺癌、口腔癌、肝細(xì)胞癌、軟組織肉瘤等多種惡性腫瘤中都具有FAS過度表達(dá)，這種高度表達(dá)與腫瘤的產(chǎn)生、惡化相關(guān)。故如能選擇性抑制該酶的活性，將會(huì)有效遏制惡性腫瘤細(xì)胞的蔓延。Knowles 等[13]利用奧利司他抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-435 和前列腺癌PC-3、LNCaP細(xì)胞中FAS 活性，效果顯著，導(dǎo)致caspase-8 介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。Kant等[14]研究發(fā)現(xiàn)奧利司他能強(qiáng)效抑制T 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中Bcl-2、HSP-70 表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞中活性氧、細(xì)胞色素等代謝異常，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。國內(nèi)學(xué)者臨床研究發(fā)現(xiàn)奧利司他能誘導(dǎo)口腔癌HSC-3 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯[15]，還有報(bào)道顯示對非酒精性脂肪性肝病相關(guān)的肝細(xì)胞癌的治療效果顯著[16]。

其他應(yīng)用，如Hahn等[17]研究發(fā)現(xiàn)服用奧利司他能抑制寄生蟲脂肪酶的代謝，如抑制賈第鞭毛蟲，腸道里面的寄生蟲。吳寶等[18]將奧利司他與瑞舒伐他汀聯(lián)合治療單純性肥胖伴高脂血癥患者安全有效，其減輕體重和改善血脂的效果優(yōu)于瑞舒伐他汀，且不增加肝腎功能損傷、肌痛風(fēng)險(xiǎn)。近日有學(xué)者研究表明，奧利司他除了具有減肥的藥理作用外，還可以抑制睪丸氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡[19]。

奧利司他不良反應(yīng)表現(xiàn)為可抑制某些需要羧基酯酶完成的脂溶性維生素（維生素A、D、E、K）的水解和吸收，因此建議在服藥時(shí)補(bǔ)充脂溶性維生素[20]。在長達(dá)兩年、數(shù)千名患者多項(xiàng)隨機(jī)、雙盲和安慰劑對照臨床試驗(yàn)的結(jié)果表明，奧利司他除一些胃腸道的不良反應(yīng)外，總體耐受性良好。常見胃腸道反應(yīng)發(fā)生率約26%，主要表現(xiàn)為胃腸道排氣增多、脂肪(油)性大便、大便次數(shù)增多和大便失禁[21]。

2 發(fā)酵法生產(chǎn)利普司他汀的現(xiàn)狀

近年來國內(nèi)外主要選用毒三素鏈毒菌（S. toxytricini）生產(chǎn)利普司他汀。Paul 等[22]的專利最早公布了利普司他汀的發(fā)酵生產(chǎn)工藝、提取方法，S.toxytriciniNRRL 15443最高發(fā)酵效價(jià)為6.23mg/L。瑞士羅氏（Roche）公司對毒三素鏈毒菌進(jìn)行了誘變選育，隨后對利普司他汀進(jìn)行催化加氫生成四氫衍生物奧利司他，優(yōu)化了發(fā)酵、提取、精制工藝[1-2]，同時(shí)臨床研究取得成功，實(shí)現(xiàn)了奧利司他工業(yè)化生產(chǎn)[4]。利普司他汀生產(chǎn)效率的提高主要取決于高產(chǎn)菌株的選育和發(fā)酵工藝條件優(yōu)化（含培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件），這兩方面是相輔相成。Varga等[23]優(yōu)化了毒三素鏈毒菌CCM7349 發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的工藝過程，該工藝采用70L 發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵，約34h時(shí)開始補(bǔ)加亞油酸、L-亮氨酸混合溶液，發(fā)酵終止效價(jià)達(dá)3290mg/L。Gasparic 等[24]改良了種子培養(yǎng)基發(fā)酵工藝，補(bǔ)料培養(yǎng)基中添加0.3%亞油酸、1%豆油，最優(yōu)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)144h，效價(jià)由未補(bǔ)料時(shí)的556mg/L 提升至4773mg/L。Fujs 等[25]公布了毒三素鏈霉菌突變菌株補(bǔ)料發(fā)酵工藝，接種20h后補(bǔ)加亞油酸和L-亮氨酸，控制亞油酸體積分?jǐn)?shù)0.3%～0.5%，發(fā)酵結(jié)束時(shí)利普司他汀的發(fā)酵效價(jià)達(dá)4400mg/L。實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化協(xié)同數(shù)學(xué)相關(guān)軟件工具能顯著提高實(shí)驗(yàn)效率，如Kumar 等[26]對菌株S. toxytriciniNRRL 15443 的發(fā)酵培養(yǎng)基采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)優(yōu)化提高利普司他汀效價(jià)至1980mg/L。Luthra 團(tuán)隊(duì)[27-28]對菌株S.toxytriciniATCC 19813 進(jìn)行UV 和NTG 聯(lián)合誘變，隨后采用全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，發(fā)酵培養(yǎng)添加大豆粉35g/L 和豆油25g/L 的條件下利普司他汀效價(jià)高達(dá)3290mg/L。Kumar 等[29-30]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加非常規(guī)碳源和調(diào)節(jié)利普司他汀三羧酸循環(huán)（TCA）促進(jìn)產(chǎn)物合成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)碳氮比2∶3時(shí)，添加豆粉40g/L、芝麻油30mL/L、亮氨酸、煙酸、硫胺酸、TCA 循環(huán)中間產(chǎn)物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和琥珀酸均能有效提高利普司他汀效價(jià)，驗(yàn)證試驗(yàn)最終效價(jià)提升了2.45 倍，高達(dá)2242.63mg/L；同時(shí)對毒三素鏈霉菌菌絲球形成影響因素，發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了研究；該研究團(tuán)隊(duì)還采用紫外、甲磺酸乙酯、甲基甲烷磺酸鹽和NTG 復(fù)合誘變技術(shù)結(jié)合前體物補(bǔ)充，提升效價(jià)至2387mg/L[31]。Khushboo等[32]采用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（NTG）和γ射線復(fù)合誘變選育并對發(fā)酵條件、脂肪酸前體添加進(jìn)行優(yōu)化，利普司他汀最高產(chǎn)量為5886mg/L。

上海師范大學(xué)王棟海[33]最早通過紫外和微波復(fù)合誘變處理毒三素鏈霉菌菌株，并對其進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化研究，發(fā)酵效價(jià)達(dá)663mg/L。浙江工業(yè)大學(xué)韓俊茹等[34]通過相同的誘變手段得到毒三素鏈霉菌突變菌株XC-lp-69，并對其進(jìn)行條件優(yōu)化確定了補(bǔ)料發(fā)酵工藝，效價(jià)達(dá)1400mg/L；隨后該團(tuán)隊(duì)對誘變菌株zjut011 采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)L-亮氨酸是最適合lipstatin生物合成的前體，并首次發(fā)現(xiàn)二價(jià)陽離子Mg2+、Co2+和Zn2+對提高lipstatin 發(fā)酵效價(jià)有顯著作用，確定了最佳工藝條件為：L-亮氨酸45.72mmol/L，辛酸31.1985mmol/L （第6 天添加），Mg2+12mmol/L，Co2+1mmol/L，Zn2+0.25mmol/L，優(yōu)化后效價(jià)高達(dá)4208mg/L[35]。王永青[36]采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了培養(yǎng)條件，并確定了補(bǔ)料培養(yǎng)工藝，于發(fā)酵培養(yǎng)36h開始補(bǔ)料，控制亞油酸/辛酸（2∶1）0.35g/(L·h)、L-亮氨酸（8%）0.4g/(L·h)；發(fā)酵培養(yǎng)72h補(bǔ)加4%的豆油。孫菲[37]研究了溶氧和剪切力對毒三素鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生利普司他汀的影響，采用10L發(fā)酵罐補(bǔ)料工藝發(fā)酵效價(jià)達(dá)到6446mg/L。上海醫(yī)藥工業(yè)研究院黃娟等[38]通過紫外-微波復(fù)合誘變，突變菌株效價(jià)比原始菌株提高3.25倍。劉順娜等[39]采用紫外和亞硝基胍誘變，獲得一株高產(chǎn)突變株，選用葵花籽油作為前體和碳源，并對其進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，最終發(fā)酵效價(jià)高達(dá)8122.9mg/L。福建省微生物研究所陳洲琴等[40]采用單因素-正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，優(yōu)化S.toxytriciniFIM-17-16 發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵參數(shù)，發(fā)酵周期短產(chǎn)量高，最高效價(jià)達(dá)9667mg/L。

以上研究表明，紫外、γ射線、NTG等誘變手段結(jié)合數(shù)學(xué)軟件指導(dǎo)的培養(yǎng)條件優(yōu)化能大幅提升利普司他汀的產(chǎn)量，前體化合物L(fēng)-亮氨酸、長鏈不飽和脂肪酸亞油酸的添加也能顯著提高利普司他汀效價(jià)，另外還發(fā)現(xiàn)二價(jià)金屬陽離子影響效果顯著，如表1所示。

3 利普司他汀代謝途徑和生物合成機(jī)制

鏈霉菌具有完善的代謝和分泌系統(tǒng)，最為顯著的特征是具有豐富的次生代謝途徑，而初生代謝和次生代謝之間具有嚴(yán)密的調(diào)控體系，目前臨床上比較有價(jià)值的抗生素幾乎都來源于鏈霉菌屬。毒三素鏈霉菌合成利普司他汀確切的代謝途徑和分子機(jī)制至今仍未完全闡釋清楚。Eisenreich 等[41]研究了毒三素鏈霉菌合成利普司他汀，起始于C8和C14脂肪酸的Claisen 縮合反應(yīng)。德國科技大學(xué)和羅氏公司對利普司他汀的生物合成機(jī)理做了大量研究。Adelbert 等[43-44]運(yùn)用同位素示綜法，用13C 標(biāo)記培養(yǎng)基中的油脂，采用核磁共振（NMR）法檢測，結(jié)果排除了利用乙酸等小分子合成利普司他汀烴基鏈，而是由長鏈油脂代謝轉(zhuǎn)化而得到[42]。C14部分的唯一來源是培養(yǎng)基中的不飽和脂肪酸，而氫化后的飽和13C-油脂代謝得到C8碳部分和亮氨酸部分，故亞油酸在利普司他汀C14烴基前體的生成過程中有非常重要的作用?；谝陨衔墨I(xiàn)結(jié)果，推測利普司他汀生物合成路徑如圖2，亞油酸活化生成亞油酸輔酶A，經(jīng)過兩次β氧化（每次降解2 個(gè)碳原子）得到十四烷-5,8-二甲酰輔酶A，和辛酸路徑形成的己基丙二酰輔酶A Claisen 縮合形成3-氧代中間體，該中間體經(jīng)過羥基化與N-甲酰-L-亮氨酸反應(yīng)合成利普司他汀。Demirev 等[45-46]通過分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)?；o酶A 羧化酶（ACCase）復(fù)合物（圖3）通過催化活化有機(jī)酸參與脂肪酸和聚酮類化合物參與了利普司他汀的生物合成，并報(bào)道了毒三素鏈霉菌中酰基輔酶A 羧化酶（ACCase）復(fù)合物的兩個(gè)基因簇，一個(gè)基因簇accA1編碼乙酰輔酶A 羧化酶復(fù)合物（ACC）的α亞基和β亞基，另一個(gè)基因簇pccB編碼丙酰輔酶A羧化酶（PCC）復(fù)合物的α亞基、β亞基、ε 亞基和生物素蛋白連接酶（Bpl）結(jié)構(gòu)域。劉文團(tuán)隊(duì)最早研究闡明了利用基因工程技術(shù)推測了參與利普司他汀合成的基因[47]，近期又報(bào)道了一個(gè)在利普司他汀生物合成中觀察到的例外情況，β-酮酰基載體蛋白合成酶Ⅲ（KAS-Ⅲ）的同系物L(fēng)stA 和LstB，通過形成一種不尋常的異二聚體來催化C8和C14脂肪酰基CoA 底物的非脫羧Claisen縮合建立利普司他汀的C22脂肪族骨架[48]。

表1 國內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)研究概況

4 結(jié)語

近二十年來，全球超重和肥胖的發(fā)生率大幅增加，但在發(fā)現(xiàn)和開發(fā)高效、副作用小的新型抗肥胖藥物方面進(jìn)展不夠。藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)因嚴(yán)重的不良反應(yīng)已經(jīng)撤銷了許多減肥藥（如Sibutramine,Rimonabant,Contrive,Phentermine）[10]。奧利司他在減肥藥市場中所占比例最大，全球市場2019 年銷售規(guī)模超30 億美元，未來五年將會(huì)達(dá)到60 億美元。毒三素鏈霉菌是生產(chǎn)利普他汀的主要菌株，目前科研工作者主要通過誘變育種、優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)、培養(yǎng)基組成和改變上下游加工因素，將利普司他汀產(chǎn)量提高到9667mg/L。如需進(jìn)一步增加利普司他汀的產(chǎn)量對研究人員來說是相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性的。目前已對利普司他汀生物合成代謝途徑、分子機(jī)理進(jìn)行了初步研究，絕大部分研究局限于高產(chǎn)菌株的誘變選育和培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的優(yōu)化等方面，后續(xù)可從以下幾個(gè)方面展開研究。①代謝路徑優(yōu)化，鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物代謝途徑復(fù)雜、通路多，可選擇性敲除代謝支路，強(qiáng)化目標(biāo)產(chǎn)物代謝途徑，使前體高通量流向目標(biāo)產(chǎn)物。②基因工程定向改造，利用定向進(jìn)化的基因工程方法對前體有效性和菌株發(fā)展進(jìn)行研究，結(jié)合特異性位點(diǎn)突變和組合突變，通過單獨(dú)或組合優(yōu)化關(guān)鍵酶的活性對合成機(jī)理進(jìn)行研究。③數(shù)學(xué)模型高效調(diào)控，對利普司他汀發(fā)酵過程進(jìn)行數(shù)學(xué)模型描述，精準(zhǔn)控制工藝流程；改變鏈霉菌菌絲體細(xì)胞膜通透性，減輕胞內(nèi)產(chǎn)物的反饋抑制，進(jìn)一步提高生產(chǎn)水平及產(chǎn)品純度。

圖2 利普司他汀生物合成路徑

圖3 ?；o酶A羧化酶（ACCase）復(fù)合物