高效液相色譜法測(cè)定青貯飼料桑中的乳酸、乙酸和丙酸含量條件探討

王彥平， 劉公言#， 梁 萌， 朱良智， 趙雪艷，呼紅梅， 唐偉靜， 王繼英， 王 誠(chéng)*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南250100； 2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100；3.山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南250022）

飼料桑也叫蛋白桑， 是通過(guò)雜交選育的富含蛋白質(zhì)的草本桑新品系， 其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高， 適口性好，并且含有多種生物活性物質(zhì)，是一種不可多得的動(dòng)物非常規(guī)飼料，具有極大的開(kāi)發(fā)潛力（林國(guó)強(qiáng)等，2020；王誠(chéng)等，2019）。 但是由于飼料桑中含有抗?fàn)I養(yǎng)因子，例如單寧、植酸等，限制了其在畜禽養(yǎng)殖中的添加量，目前常用青貯來(lái)解決這一問(wèn)題。青貯飼料的發(fā)酵過(guò)程即乳酸菌及其他微生物大量繁殖的過(guò)程， 因而研究其產(chǎn)物乳酸和揮發(fā)性脂肪酸的含量和組成比例是評(píng)價(jià)青貯飼料發(fā)酵特性及飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)（張養(yǎng)東等，2016）。

對(duì)青貯飼料中乳酸和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測(cè)定一般采用羥基聯(lián)苯比色法、 酶法、 氣相色譜法、離子色譜法、液相色譜法等（陳松輝等，2018；宋凡等，2016； 高曉松，2012； 王洪麗等，2008；任清，2002）。比色法每次只能測(cè)定單個(gè)酸，不能幾個(gè)酸同時(shí)測(cè)定，處理過(guò)程繁瑣；氣相色譜法可以實(shí)現(xiàn)VFA 和乳酸的同時(shí)測(cè)定，但需要提前對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化或芐酯化， 操作過(guò)程較繁瑣， 處理時(shí)間較長(zhǎng)，不適宜于大批量樣品的測(cè)定分析。乳酸脫氫酶法準(zhǔn)確性好，測(cè)定快速，但測(cè)定成本較高。 目前通過(guò)液相色譜法檢測(cè)有機(jī)酸的研究已有報(bào)道（鄧虹等，2018；趙艷等，2015），但對(duì)青貯飼料中乳酸、乙酸等同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道并不多， 本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)大量試驗(yàn)， 優(yōu)化檢測(cè)條件， 旨在建立一種結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)青貯飼料桑中主要酸成分乳酸、乙酸和丙酸的同步檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 青貯飼料取自本實(shí)驗(yàn)室2019年制作的青貯飼料桑樣品；乳酸、乙酸、丙酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.95%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈為色譜純，磷酸、磷酸二氫鈉為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備 Waters E2695 型高效液相色譜儀，配備紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)器，沃特世科技（上海）有限公司；電子天平；超聲波振蕩器等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取3 種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水溶解并定容于容量瓶中，配制成混合母液，然后準(zhǔn)確量取0.625、1.25、2.5、5 mL 標(biāo)準(zhǔn)混合母液用超純水定容于10 mL容量瓶中， 即為梯度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 流動(dòng)相配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取磷酸二氫鈉0.02 mmol（3.0900 g）用去離子水溶解，用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH 至2.7， 并定容于1000 mL 的容量瓶中，然后用0.45 μm 水相濾膜過(guò)濾， 超聲波振蕩器中脫氣30 min 后使用。色譜級(jí)乙腈用0.45 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，超聲波振蕩器中脫氣30 min 后使用。

1.3.3 高效液相色譜分析條件 XSelect HSS T3-C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鈉 （pH 為2.7）=2.5:97.5（V/V）；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器波長(zhǎng)：210 nm。

1.3.4 樣品處理 準(zhǔn)確稱(chēng)取青貯飼料樣品2.50 g，溶解于250 mL 具塞三角瓶中， 加入去離子水200 mL 并混勻。 在4 ℃冰箱中放置24 h（每間隔一段時(shí)間混勻一次），然后過(guò)濾，并清洗濾渣，定容于250 mL 容量瓶中。 取濾液適量用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，即為待測(cè)樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜檢測(cè)方法的建立

2.1.1 色譜柱、 流動(dòng)相及流速的確定 實(shí)驗(yàn)室具有兩種色譜柱，一種為通用C18 柱，一種為XSelect HSS T3-C18 柱，同樣條件下，通用C18 柱乳酸與乙酸無(wú)法分離， 而XSelect HSS T3-C18 柱可以將二者分開(kāi)，確定選擇XSelect HSS T3-C18 柱。

流動(dòng)相比較了0.02 mol/L 磷酸二氫鈉（pH 為2.7）和乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鈉（pH 為2.7）=2.5:97.5（V/V）作為流動(dòng)性，各組分可以較好的分離，但僅用0.02 mol/L 磷酸二氫鈉（pH 為2.7）作為流動(dòng)相時(shí)，峰形稍差，且流動(dòng)相易變質(zhì)，故選擇在0.02 mol/L 磷酸二氫鈉中加入乙腈。

不同流速（1.0、0.8、0.6 mL/min）下分離實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著流速的增加，保留時(shí)間縮短，分離度降低，流速過(guò)低時(shí)分離效果較好，但洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，綜合考慮，確定流動(dòng)相為乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鈉（pH 為2.7）=2.5:97.5（V/V），流速為0.8 mL/min?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖見(jiàn)圖1， 樣品液相色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖

圖2 青貯飼料桑樣品液相色譜圖

2.1.2 線(xiàn)性回歸分析 取1.3.1 中配制的梯度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以峰面積（響應(yīng)值，Y，AU）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制3種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到保留時(shí)間、線(xiàn)性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限信息，結(jié)果見(jiàn)表1。 3種標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999， 表明線(xiàn)性關(guān)系良好，可滿(mǎn)足分析檢測(cè)要求。

表1 3 種標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間、回歸方程和檢出限

2.1.3 回收率 將方法1.3.1 中配制的已知濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，添加一定量的不同濃度的乳酸、乙酸和丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液后混勻，進(jìn)樣，分別測(cè)定其中各物質(zhì)的濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。 3 種物質(zhì)的平均回收率為101.20% ～104.24%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為0.01% ～0.49%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確性較好。

表2 3 種物質(zhì)的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.1.4 精密度 將方法1.3.1 中配制的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次檢測(cè)3 種物質(zhì)的濃度，6 次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。 3 種物質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果的RSD 為0.06% ～0.58%， 符合定量檢測(cè)要求，說(shuō)明該方法測(cè)定結(jié)果精密度良好。

表3 3 種物質(zhì)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.2 樣品處理方法及加標(biāo)實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取5 份青貯飼料桑各2.50 g， 放入250 mL 具塞三角瓶中，加入去離子水200 mL 并混勻。 具體處理方法見(jiàn)表4。 處理之后過(guò)濾并清洗濾渣，定容于250 mL容量瓶中。 取濾液適量用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，測(cè)定。由表4 可見(jiàn)，室溫條件下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，乳酸和乙酸的含量小幅度升高。 35 ℃條件下超聲波振蕩30 min，乳酸含量提高，但乙酸含量略有降低。4 ℃冰箱中放置24 h 測(cè)定乳酸和乙酸含量，發(fā)現(xiàn)兩種成分含量最高， 故本實(shí)驗(yàn)選擇4 ℃冰箱中放置24 h 制備待測(cè)樣品。

表4 樣品不同處理方法及3 種物質(zhì)含量測(cè)定

另取4 份浸提液，其中一份直接上樣檢測(cè)，其余三份分別加入不同濃度的混合酸標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定回收率， 結(jié)果見(jiàn)表5。 樣品中加標(biāo)回收率為98.35% ～102.08%，適于檢測(cè)該樣品。

表5 青貯飼料桑樣品測(cè)定及加標(biāo)回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

在液相和氣相色譜分析中， 精密度和回收率是評(píng)價(jià)檢測(cè)體系穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性常用的兩個(gè)指標(biāo)。 精密度指在規(guī)定的測(cè)定條件下， 用同一個(gè)樣品，經(jīng)過(guò)多次測(cè)定所得各個(gè)結(jié)果之間的接近程度。由此可見(jiàn)精密度越高檢測(cè)方法越穩(wěn)定。 而回收率是加標(biāo)實(shí)測(cè)的結(jié)果減去未加標(biāo)所測(cè)的結(jié)果， 其差值同加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)之比即為樣品加標(biāo)回收率。 乙腈是高效液相色譜分析中常用的流動(dòng)相溶劑，具有洗脫能力強(qiáng)，不易與待測(cè)物反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)（潘惠慧等，2008）。 流動(dòng)相的pH 是影響待分析物分離效果的另一個(gè)重要因素。 趙景嬋等（2012）認(rèn)為流動(dòng)相pH 直接決定了VFA 以何種形態(tài)存在，在檢測(cè)中只有使流動(dòng)相pH 控制在一定范圍內(nèi)， 才能抑制溶質(zhì)的離子化，減少譜帶拖尾、改善峰形，提高分離的選擇性。 趙建軍等 （1993） 應(yīng)用C18 柱以KH2PO4緩沖液作流動(dòng)相，對(duì)黃牛瘤胃內(nèi)容物揮發(fā)性脂肪酸和乳酸進(jìn)行了測(cè)定， 結(jié)果表明瘤胃內(nèi)容物乙酸、丙酸、丁酸和乳酸的平均回收率和變異系數(shù)均在可信線(xiàn)范圍之內(nèi)，表明該方法穩(wěn)定性較好，精確度較高。 本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)流動(dòng)相、 流速和提取條件進(jìn)行優(yōu)化， 建立了以XSelect HSS T3-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 為色譜柱， 流動(dòng)相為乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鈉 （pH 為2.7）=2.5:97.5（V/V），流速為0.8 mL/min 的高效液相色譜法，可以同時(shí)測(cè)定青貯飼料桑中的乳酸、乙酸和丙酸，該方法操作簡(jiǎn)單，且具有較高的精密度和準(zhǔn)確性，適用于飼料桑類(lèi)青貯飼料中乳酸、 乙酸和丙酸同時(shí)進(jìn)行定量檢測(cè)。