酸與堿處理對(duì)海帶多糖提取及其抗氧化活性的影響

陳文寧， 鄭娟霞， 月金玲， 楊 莉， 王琤韋華

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌330013）

海帶是我國(guó)一種高產(chǎn)的海藻類作物， 其含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、多糖類物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，其中海帶多糖是重要的功能性物質(zhì) （葉竹秋，2001）。 研究發(fā)現(xiàn)，海帶多糖具有抗氧化、抗病毒、抗癌等多種生理活性 （Chen 等，2010；Shuai 等，2010；Li 等，2008；Wang 等，2008；Athukorala 等，2007），是目前的研究熱點(diǎn)之一。 海帶多糖可用作動(dòng)物生產(chǎn)中的飼料添加劑， 但商品海帶多糖的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本高，因此，尋找一種簡(jiǎn)單提取海帶粗多糖的方法， 可以推進(jìn)其在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用。 本試驗(yàn)通過(guò)檸檬酸提取法和堿提取法分別提取海帶粗多糖， 比較二者的多糖得率和抗氧化活性，為海帶多糖更好地應(yīng)用于畜牧業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料 干海帶購(gòu)于江西省南昌市市場(chǎng)，粉碎待用。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚、檸檬酸、碳酸鈉、七水合硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、鹽酸、氯化鐵、 葡萄糖、 鄰菲咯啉、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ），均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 本試驗(yàn)所使用儀器規(guī)格見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)所需儀器

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海帶多糖提取工藝流程

1.2.1.1 檸檬酸提取法工藝流程 本試驗(yàn)參考盧茳虹等（2012）研究得到的試驗(yàn)方法進(jìn)行提取，將干海帶粉碎，檸檬酸溶液（pH=2）浸取，抽濾，合并濾液，加入氫氧化鉀調(diào)節(jié)中性pH，濃縮，在4 ℃靜置8 h 進(jìn)行3 次醇沉（乙醇最終濃度為80%），再進(jìn)行抽濾得到沉淀物，用無(wú)水乙醇洗滌脫水，用干燥箱烘干得到海帶粗多糖。

1.2.1.2 堿提取法工藝流程 本試驗(yàn)參考原澤知等（2010）研究得到的試驗(yàn)方法進(jìn)行提取，將干海帶粉碎，5% Na2CO3溶液浸取，抽濾，合并濾液濃縮，在4 ℃靜置8 h 進(jìn)行3 次醇沉（乙醇最終濃度為80%），再進(jìn)行抽濾得到沉淀物，用無(wú)水乙醇洗滌脫水，用干燥箱烘干得到海帶粗多糖。

1.2.2 粗多糖提取率的計(jì)算 多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法（周德慶，1986）。 精密稱取烘干后的葡萄糖100 mg，加入適量水定容至1 L，配制成濃度為100 mg/L 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。 分別吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于試管中，用蒸餾水將溶液補(bǔ)至2 mL，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液，迅速加入濃硫酸5 mL，充分搖勻再靜置20 min， 在波長(zhǎng)490 nm 下測(cè)定OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 各取酸提和堿提得到的海帶粗多糖樣品0.5 g，定容到100 mL，然后取稀釋溶液2 mL 加入測(cè)定管中，重復(fù)上述操作5 次。 空白管以超純水代替待測(cè)樣本， 依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算海帶粗多糖樣品的多糖得率。

多糖得率/%=提取液中多糖含量/所用海帶總量×100。

1.2.3 鐵還原抗氧化能力（FRAP）測(cè)定 準(zhǔn)確稱取七水合硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）0.0278 g，溶于超純水定容至1 L，配成濃度0.1 mol/L 的FeSO4·7H2O 標(biāo)準(zhǔn)母液。取FeSO4·7H2O 標(biāo)準(zhǔn)母液0.1 mL，用超純水稀釋至濃度為0.1 mmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。 用0.1 mmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液配制FeSO4溶液的濃度梯度， 包括濃度為0.01、0.03、0.05、0.07、0.1 mmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.2 mL，加入1.8 mL TPTZ 工作液，混勻，于37 ℃水浴保溫10 min，593 nm 測(cè)定吸光值， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 依據(jù)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算海帶多糖樣品總抗氧化能力，重復(fù)5 次?？瞻坠芤猿兯娲郎y(cè)樣本，其他相同。依據(jù)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算海帶多糖樣品總抗氧化能力。 樣品的抗氧化能力以FRAP 值表示（1 FRAP=1 mmol/L FeSO4）。

1.2.4 羥自由基的清除能力 取1 mL 0.75 mmol/L的鄰菲咯啉溶液于試管中，分別加入2 mL 的pH

7.4 磷酸鹽緩沖液和1 mL 的純水， 充分混勻后，加0.75 mol/L 硫酸亞鐵1 mL 混勻， 加0.01%的過(guò)氧化氫1 mL， 于37 ℃恒溫水浴60 min，于536 nm 下分別測(cè)其吸光度（Ap）；再用30%的乙醇1 mL 代替1 mL 過(guò)氧化氫，測(cè)得吸光度（Ag）。將酸提和堿提得到的海帶粗多糖樣品配成1.0 mg/mL 的溶液， 取1 mL 代替1 mL 蒸餾水，測(cè)得吸光度（As），重復(fù)5 次。 羥自由基清除能力的計(jì)算公式為：

·OH 清除率/%=[（As-Ap）/（Ag-Ap）]×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)選用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0 進(jìn)行分析處理，采用多重比較的LSD 法檢驗(yàn)不同提取方法下多糖得率和抗氧化活性的差異水平。 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶多糖的多糖得率 由表2 可知，檸檬酸提取法得到的粗多糖得率為（15.92±2.36）%，堿提取法得到的粗多糖得率為（6.05±0.81）%，二者之間的多糖得率差異顯著（P ＜0.05），經(jīng)檸檬酸提取法提取的粗多糖含量高于堿提取法。

表2 海帶多糖的多糖得率 %

2.2 海帶多糖的抗氧化能力 如表3 所示，檸檬酸提取法和堿提取法提取的粗海帶多糖的總抗氧化能力FRAP 值分別為0.048±0.004 和0.022±0.012， 且二者之間的多糖得率差異顯著（P ＜0.05），說(shuō)明檸檬酸提取法提取的粗多糖總抗氧化能力強(qiáng)于堿提取法提取的粗多糖總抗氧化能力。

表3 海帶多糖的FRAP 值

2.3 海帶多糖的羥自由基清除率 如表4 所示，當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL 時(shí)， 酸提的海帶多糖對(duì)·OH 清除率為42.67%，堿提的海帶多糖對(duì)·OH 清除率為32.03%，說(shuō)明海帶多糖對(duì)·OH 有一定清除能力，酸提的海帶多糖對(duì)·OH 的清除能力顯著高于堿提的海帶多糖。

表4 海帶多糖的羥自由基清除率%

3 討論

3.1 酸提和堿提的多糖得率 目前， 提取海帶多糖的常用方法有水提法、酶提法、酸提法、堿提法等， 使用水提法提取海帶多糖時(shí)可達(dá)10.49%（余華，2006）；使用酶提法可達(dá)11.62%；使用酸提法時(shí)可達(dá)35.10%（周裔杉，2006）； 使用堿提法時(shí)可達(dá)76.88%（劉秀河等，1999），由此表明，酸提取法和堿提取法的產(chǎn)率相對(duì)較高，故本試驗(yàn)選擇堿提取法和酸提取法提取海帶多糖并對(duì)其多糖得率和抗氧化活性進(jìn)行比較。 結(jié)果表明，檸檬酸提取法得到的多糖得率為 （15.92±2.36）%， 這一結(jié)果與盧茳虹等（2012）提取得到的多糖得率[（13.19±0.06）%]差異不大。王智榮等（2016）研究了幾種常見(jiàn)的酸以及水等提取溶劑提取海帶多糖，確定了檸檬酸提取海帶多糖的效果最佳，多糖得率最高為12.95%，也與本試驗(yàn)結(jié)果相近。而本試驗(yàn)堿提取法提取到的多糖得率為（6.05±0.81）%，與原澤知等（2010）的海帶多糖產(chǎn)率2.13%存在差異， 可能由于所取海帶部位不同，海帶多糖含量有所差異。此外，閔玉濤（2015）比較了水提和醇提兩種方法提取海藻多糖的效果，分別為6.00%和7.80%；蔡彬新等（2012）用水提法提取海帶多糖，提取率達(dá)7.90%；張換等（2013）用纖維素酶提取海帶多糖的產(chǎn)率為11.62%； 任狀等（2018） 采用超聲波協(xié)同酶法提取的海帶多糖產(chǎn)率為19.40%。 上述方法的提取效果大多弱于檸檬酸提取法，強(qiáng)于或相近于堿提法。因此，檸檬酸提取法較堿提法具有更好提取效果。

3.2 海帶粗多糖的抗氧化力 自由基是機(jī)體代謝產(chǎn)生的一類氧化性極強(qiáng)的物質(zhì)，具有攻擊生物分子的功能，較高的氧化水平，會(huì)發(fā)生超氧化化學(xué)反應(yīng)，從而破壞細(xì)胞作用及其組織。多數(shù)自由基可以誘導(dǎo)DNA 及染色體結(jié)構(gòu)損壞、干擾細(xì)胞代謝、破壞蛋白質(zhì)活性和酶體系，可直接或間接引起慢性疾病及衰老效應(yīng)（魏夢(mèng)濤等，2018）。 自由基易與還原性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，還原性越強(qiáng)的物質(zhì)越容易與自由基的強(qiáng)氧化性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，清除的自由基越多，其抗氧化活性也就越高，常用FRAP 法測(cè)定。 FRAP 值越大，多糖抗氧化能力越強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，檸檬酸提法和堿提法的海帶粗多糖的還原力分別為（0.048±0.004）和（0.022±0.012）。葉文斌等（2016）提取拐棗多糖， 其濃度為2.0 mg/mL 時(shí)，F(xiàn)RAP 值為0.94；李秋瑩等（2016）研究四種淫羊藿多糖的抗氧化活性，F(xiàn)RAP 值分別為0.166、0.411、0.237、0.236。本試驗(yàn)的結(jié)果與此相比，檸檬酸提法和堿提法的海帶粗多糖的還原力較弱，但檸檬酸提取法的還原力比堿提法的效果好。

3.3 海帶粗多糖的·OH 清除率 ·OH 是機(jī)體在新陳代謝中由過(guò)氧化氫釋放出的破壞性強(qiáng)、 危害較大的一種自由基，其可以直接與糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)和磷脂等生物大分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)， 導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞大面積凋亡（Xu 等，2011；Shen等，2001），也可以通過(guò)氧化堿基，使細(xì)胞DNA 結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或突變（樊岫珊，2017）。 因此，清除體內(nèi)代謝產(chǎn)生的過(guò)多累積的自由基，有助于維持細(xì)胞活性和氧化代謝平衡 （樓蘭花等，2003）。 本試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時(shí)，檸檬酸提法提取的海帶粗多糖的·OH 清除率為42.67%，堿提法提取的海帶粗多糖的·OH 清除率為32.03%，而賈彥明等（2010）通過(guò)堿提取法分離純化得到海帶多糖的多糖濃度為2 mg/mL 時(shí)，·OH 清除率為46%， 說(shuō)明檸檬酸提法和堿提取得到的粗多糖具有一定的抗氧化活性， 都能有效清除·OH。 魏碧娜（2016）提取的海帶粗多糖濃度為1 mg/mL 時(shí)·OH 清除率為43%， 與本試驗(yàn)酸提的結(jié)果相近。 因此，兩種提取方法相比較，檸檬酸提取法提取得到的海帶多糖的·OH 清除率強(qiáng)于堿提取得到的海帶多糖。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，檸檬酸提取法提取海帶多糖和其抗氧化活性均優(yōu)于堿提取法。 因此，檸檬酸提取法更適合于工業(yè)生產(chǎn)粗多糖，降低養(yǎng)殖成本。