當(dāng)歸湯多糖對潰瘍性結(jié)腸炎的改善作用及機制初步研究*

郭子右，劉葭，余玲，蘭海，劉玉娟，吳清

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種腸道非特異性炎性疾病，發(fā)病多與遺傳、環(huán)境及免疫反應(yīng)異常有關(guān)，病因和發(fā)病機制至今尚未被完全闡明[1]。UC臨床表現(xiàn)為腹痛腹瀉和黏液膿血便，常反復(fù)發(fā)作[2]。目前普遍認為UC是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的重要危險因素[3-4]。近年來，越來越多的研究表明，中醫(yī)藥在緩解UC患者的病情、改善生活質(zhì)量、減少毒副作用等方面有明顯優(yōu)勢[5-6]。

當(dāng)歸湯為中醫(yī)治療結(jié)腸炎的經(jīng)典方，首載于《外臺秘要·卷第二十五·數(shù)十年痢方一十一首》，文中記載“當(dāng)歸湯，療三十年下痢，止諸痛方”[7]。當(dāng)歸湯由當(dāng)歸、大棗、生姜組成，3藥合用，溫中止瀉、補脾益氣、和血止痛，且現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，3藥對UC具有改善作用[8-10]。多糖類成分是當(dāng)歸湯中的主要化學(xué)成分，且具有抗炎抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[11-12]，其是否是改善UC的有效物質(zhì)有待研究。

RAW264.7細胞和脾細胞是免疫相關(guān)的藥物活性評價常用細胞模型[13]。TNBS模型于1984年由Morris等首次成功建立[14]，該法操作簡單，持續(xù)時間長且組織學(xué)變化與人類UC相似，是目前常用的UC模型之一[15]。因此，文章旨在通過體內(nèi)外藥理學(xué)研究手段，探討當(dāng)歸湯多糖對UC的作用及其機制，以期為UC的藥物研發(fā)和臨床治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品及試劑 紅細胞裂解液、青鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、刀豆蛋白A（Con-A，美國Corning公司）；大鼠白細胞介素（IL）-2、干擾素-γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（美國Raybiotech公司）；胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries公司）；脂多糖（LPS）、二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；NO檢測試劑盒（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，P2297-10 mL，美國Sigma-Aldrich公司）；艾迪莎美沙拉秦緩釋顆粒（中國上海愛的發(fā)制藥有限公司，批號：1810106）；髓過氧化物酶（MPO）試劑盒（A044-1-1）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（WST-1法，A001-3-2）、丙二醛（MDA）試劑盒（A003-1-2，南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白含量檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；其余試劑為分析純。

1.2 實驗動物及細胞 SPF級雄性SD大鼠（體質(zhì)量180～200 g），購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。實驗動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，溫度為（25±2）℃，濕度50%±10%，12 h循環(huán)光照。小鼠單核巨噬細胞RAW264．7（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心）。

1.3 實驗儀器 BJ-2CD型凈化工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；311型二氧化碳培養(yǎng)箱、ST8R高速冷凍離心機（美國Thermo公司）；SPECTROstar Nano全波長酶標儀（德國BMG LABTECH公司）；紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；TS2-S-SM光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；80-2型離心機（鞏義市科瑞儀器有限公司）。

2 方法

2.1 當(dāng)歸湯多糖的提取 采用實驗室前期優(yōu)化的提取工藝制備：30倍量水回流提取3次，每次1 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1．15～1．20（60 ℃），加乙醇使醇濃度為 70%，冷藏 12 h，4 000 r/min 離心 15 min（r=7．9 cm，下同），取沉淀，干燥備用。經(jīng)苯酚-硫酸法檢測，當(dāng)歸湯多糖含量為（634．79±3．10）mg/g。

2.2 動物實驗

2.2.1 模型建立與實驗分組 36只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機分為 6組，對照組（Control）、模型組（TNBS）、美沙拉嗪組（Mesalazine）、當(dāng)歸湯多糖低劑量組、中劑量組和高劑量組。采用TNBS單次灌腸法制備大鼠UC模型：SD大鼠10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，取石蠟潤滑的灌胃針插入肛門約8 cm，灌注TNBS溶液，灌腸后倒立3 min，對照組采用相同操作方法灌注生理鹽水。造模第2天開始給藥，連續(xù)給藥7 d。美沙拉嗪組灌胃美沙拉嗪（400 mg/kg），當(dāng)歸湯多糖低、中、高劑量組灌胃給藥的劑量分別為0．5、1、2 g/kg，對照組與模型組均灌胃去離子水。實驗結(jié)束后，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，取脾臟置于無菌PBS緩沖液中備用；取出肛門至盲腸末端的整個腸段，測量長度；沿縱軸剖開結(jié)直腸，觀察大體形態(tài)并進行評分；結(jié)直腸組織分段后部分用10%中性福爾馬林固定液固定，其余置于-80℃保存，用于后續(xù)指標檢測。

2.2.2 一般狀態(tài)觀察與疾病活動指數(shù)（DAI） 實驗期間，每天對大鼠的一般情況進行觀察，包括體質(zhì)量、大便性狀與便血情況，進行DAI評分，評分標準參考文獻[16]標準。

2.2.3 結(jié)直腸宏觀損傷評分 沿縱軸剪開結(jié)直腸，冰生理鹽水洗凈后，立即肉眼觀察結(jié)直腸組織大體形態(tài)，并進行宏觀損傷評分，評分標準參考文獻[17]標準。

2.2.4 蘇木精-伊紅（HE）染色及結(jié)直腸組織病理學(xué)分析 取結(jié)直腸組織固定于10%中性福爾馬林固定液中，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察結(jié)直腸組織的病理變化，進行組織病理學(xué)評分，評分標準參考[18]的標準。

2.2.5 氧化應(yīng)激指標的測定 取結(jié)直腸組織加入生理鹽水制備組織勻漿，使用BCA試劑盒測量組織勻漿蛋白濃度，參照試劑盒說明書檢測并計算結(jié)直腸組織中SOD活力、MDA含量和MPO活力。

2.2.6 Con-A刺激下脾細胞增殖檢測及IL-2與IFN-γ的測定 脾細胞懸液按2．4．1項下方法制備，將各組大鼠的脾細胞懸浮于RPMI1640完全培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h后，除去貼壁細胞，臺盼藍染色計數(shù)后以5×105個/mL的密度接種于96孔板中，每孔加入Con-A使終濃度為5 μg/mL刺激細胞，孵育24 h。同時設(shè)置不加Con-A的對照組。收集每孔的細胞懸液，1 000 r/min離心3 min，收集上清液用于細胞因子IL-2和IFN-γ檢測，細胞重新添加含MTT的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h。1 000 r/min離心 3 min，棄去上清液，加入 150 μL DMSO，振搖溶解后，轉(zhuǎn)移至96孔板中，550 nm處測量OD值，按公式1計算刺激指數(shù)。取與Con-A共孵育24 h的脾細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測上清液中的IL-2和IFN-γ。

2.3 當(dāng)歸湯多糖對RAW264．7細胞一氧化氮（NO）生成的影響

2.3.1 細胞存活率檢測 取對數(shù)生長期的RAW264．7細胞以1×105個/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，棄上清液，加入不同濃度（50、100、200、400、800 μg/mL）當(dāng)歸湯多糖的DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個復(fù)孔。設(shè)置溶劑對照組（0.5% DMSO的培養(yǎng)基）和空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，避光條件下每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入 100 μL DMSO，搖床搖晃10 min，酶標儀490 nm處測量OD值，按公式2計算細胞存活率（%）。

2.3.2 NO測定 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞以1×105個/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng) 24 h 后，棄上清液，加入不同濃度（50、100、200、400、800 μg/mL）當(dāng)歸湯多糖的 DMEM 培養(yǎng)基，每組3個復(fù)孔。設(shè)置空白對照組和陽性對照組（1 μg/mL LPS刺激）。培養(yǎng)24 h。收集細胞上清液，按NO試劑盒測定方法檢測，計算NO抑制率（%）。

2.4 當(dāng)歸湯多糖對Con-A刺激下正常和UC大鼠脾細胞增殖的影響

2.4.1 脾細胞懸液的制備 采用如下方法制備[19]：犧牲SD大鼠，無菌條件下取脾臟，用RPMI1640培養(yǎng)基漂洗后，采用200目篩網(wǎng)研磨制備組織勻漿，經(jīng)紅細胞裂解液裂解并用PBS清洗后，RPMI1640培養(yǎng)液重懸，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h后除去貼壁細胞，即得脾細胞懸液，使用臺盼藍染色，活細胞數(shù)高于95%方可用于后續(xù)實驗。

UC大鼠脾細胞：造模方法同2.2.1，造模后飼養(yǎng)7 d，期間自由飲水?dāng)z食。大鼠犧牲后，脾細胞懸液的制備方法同上。

2.4.2 當(dāng)歸湯多糖給藥范圍篩選 取按2.3.1項下制備的脾細胞懸液，以5×106個/mL接種于96孔板，每孔 100 μL，加入不同濃度（50、100、200、400、800 μg/mL）當(dāng)歸湯多糖的RPMI1640培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個復(fù)孔，給藥后培養(yǎng)48 h。并設(shè)置空白對照組。收集每孔的細胞懸液，以1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，細胞重新添加含MTT的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。再次以1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，加入150 μL DMSO，振搖溶解后，轉(zhuǎn)移至96孔板中，在550 nm處測量OD值，計算細胞存活率（%）。

2.4.3 Con-A刺激下的脾細胞增殖檢測 取按2.4.1項下制備的脾細胞懸液，以5×106個/mL接種于96孔板，每孔100 μL。每孔加入Con-A使終濃度為 5 μg/mL。加入不同濃度（200、400、800 μg/mL）當(dāng)歸湯多糖的RPMI1640培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個復(fù)孔，給藥后培養(yǎng)48 h。同時設(shè)置僅加Con-A的模型組（Con-A組）。檢測方法同2.4.2。當(dāng)給藥組OD大于模型組時按公式3計算；當(dāng)給藥組OD小于模型組時按公式4計算。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用Graphpad 6.0進行分極及繪圖，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較采用Dunnett檢驗。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 當(dāng)歸湯多糖對TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠模型的干預(yù)研究

3.1.1 大鼠體質(zhì)量及DAI評分 實驗期間的體質(zhì)量變化與對照組相比，模型組體質(zhì)量明顯下降。經(jīng)當(dāng)歸湯多糖治療后，大鼠體質(zhì)量逐漸升高。見圖1。實驗第8天，與對照組相比，模型組DAI評分顯著升高；與模型組相比，美沙拉嗪組與當(dāng)歸湯多糖高劑量組的DAI評分顯著降低（P<0.05或P<0.01）。見表1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化曲線（n=6）Fig.1 Weight change curves of rats in each group（n=6）

表1 各組大鼠第8天DAI評分（±s）Tab.1 DAI scores of rats in each group on the 8th day（±s） 分

表1 各組大鼠第8天DAI評分（±s）Tab.1 DAI scores of rats in each group on the 8th day（±s） 分

注：與模型組相比，**P＜0．01。

組別 動物數(shù) DAI空白對照組 6 0．11±0．27**模型組 6 1．83±0．59美沙拉嗪組 6 0．89±0．34**當(dāng)歸湯多糖低劑量組 6 1．56±0．34當(dāng)歸湯多糖中劑量組 6 1．33±0．42當(dāng)歸湯多糖高劑量組 6 1．11±0．54**

3.1.2 大鼠結(jié)直腸長度與宏觀損傷評分 與對照組相比，模型組大鼠結(jié)直腸顯著縮短（P<0.01）。與模型組相比，美沙拉嗪組大鼠的結(jié)直腸長度顯著增加（P<0.01）。當(dāng)歸湯多糖低、中、高劑量組大鼠的結(jié)直腸長度雖然有所恢復(fù)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

宏觀損傷評分結(jié)果中，對照組大鼠的結(jié)直腸形態(tài)完好，可見清晰紋理，腸壁厚度均勻，無肉眼可見潰瘍和壞死。模型組大鼠的結(jié)直腸有水腫和充血現(xiàn)象，腸壁明顯增厚，有大面積潰瘍和黑色壞死。與對照組相比，模型組的宏觀評分顯著升高。與模型組相比，美沙拉嗪組和當(dāng)歸湯多糖高劑量組大鼠的宏觀評分顯著降低（P＜0．01）。見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸長度、宏觀損傷評分和組織病理學(xué)評分（±s）Tab.2 Colorectal length，macroscopic scores and histopathological scores of colorectal injury of rats in each group on the 8th day（±s）

表2 各組大鼠結(jié)腸長度、宏觀損傷評分和組織病理學(xué)評分（±s）Tab.2 Colorectal length，macroscopic scores and histopathological scores of colorectal injury of rats in each group on the 8th day（±s）

注：與模型組相比，**P＜0．01。

組織病理學(xué)評分（分）空白對照組 6 21．63±1．84**1．33±0．52**0．67±0．52**模型組 6 13．33±1．23 7．17±1．83 9．33±0．82美沙拉嗪組 6 17．48±0．97**3．17±1．17**3．00±0．89**當(dāng)歸湯多糖低劑量組 6 14．52±1．94 6．17±1．33 7．16±1．60當(dāng)歸湯多糖中劑量組 6 14．63±2．72 5．67±1．86 6．33±2．34**當(dāng)歸湯多糖高劑量組 6 15．65±0．81 4．33±1．03**3．83±1．17**組別 動物數(shù) 結(jié)直腸長度（cm）宏觀損傷評分（分）

3.1.3 大鼠結(jié)直腸組織病理學(xué)分析 對照組大鼠的結(jié)直腸組織結(jié)構(gòu)完整，細胞及腺體排列有序。模型組大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)紊亂，腺體受到破壞，炎癥細胞浸潤明顯，與對照組相比，組織病理學(xué)評分顯著提高。美沙拉嗪組和當(dāng)歸湯多糖中、高劑量組大鼠結(jié)直腸上皮組織較模型組顯著改善，組織病理學(xué)評分顯著降低（P＜0．01）。見圖2、表2。

圖2 各組大鼠結(jié)直腸組織HE染色切片圖像（×100）Fig.2 Images of HE staining slices from colorectal tissues（×100）of rats in each group

3.1.4 大鼠結(jié)直腸組織氧化應(yīng)激指標 與對照組比較，模型組大鼠結(jié)直腸組織SOD活力顯著減弱，MDA 含量明顯升高，MPO 活力顯著增強（P＜0．01）。與模型組相比，美沙拉嗪組和當(dāng)歸湯多糖高劑量組SOD 活力均顯著增強（P＜0．01）；與模型組相比，美沙拉嗪組和當(dāng)歸湯多糖低、中、高劑量組MDA含量顯著下降（P＜0．05 或 P＜0．01）；與模型組相比，美沙拉嗪組和當(dāng)歸湯多糖中、高劑量組MPO活力顯著減弱（P＜0．05）。見表3。

表3 各組大鼠結(jié)直腸組織氧化應(yīng)激指標（±s）Tab.3 Colorectal length and macroscopic scores of colorectal injury of rats in each group on the 8th day（±s）

表3 各組大鼠結(jié)直腸組織氧化應(yīng)激指標（±s）Tab.3 Colorectal length and macroscopic scores of colorectal injury of rats in each group on the 8th day（±s）

注：與模型組相比，*P＜0．05，**P＜0．01。

MDA含量（nmol/mg）空白對照組 6 95．87±15．18**0．33±0．10**0．41±0．12**模型組 6 67．63± 6．30 0．65±0．14 0．93±0．12美沙拉嗪組 6 85．33±12．49*0．44±0．10**0．46±0．07*當(dāng)歸湯多糖低劑量組 6 78．82± 7．91 0．54±0．15* 0．62±0．23當(dāng)歸湯多糖中劑量組 6 76．26± 8．97 0．46±0．10**0．58±0．25*當(dāng)歸湯多糖高劑量組 6 86．28± 9．42*0．44±0．10**0．48±0．12*組別 動物數(shù) SOD含量（U/g）MPO含量（U/g）

3.1.5 Con-A刺激下大鼠脾細胞刺激指數(shù)與IL-2、IFN-γ水平 與對照組比較，模型組脾細胞刺激指數(shù)顯著升高（P＜0．01）。各給藥組脾細胞刺激指數(shù)與模型組相比顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。見表4。采用ELISA法檢測Con-A刺激下脾細胞上清液中免疫相關(guān)細胞因子IL-2和IFN-γ。與對照組相比，模型組 IL-2 和IFN-γ 濃度顯著升高（P＜0．01）；當(dāng)歸湯多糖能夠劑量依賴地抑制IL-2和IFN-γ生成，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05 或 P＜0．01）。見表4。

表4 各組大鼠Con-A誘導(dǎo)下脾細胞增殖情況及脾細胞上清液IL-2和IFN-γ（±s）Tab.4 Proliferation of splenocytes，IL-2 and IFN-γ in supernatant of splenocytes induced by Con-A of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠Con-A誘導(dǎo)下脾細胞增殖情況及脾細胞上清液IL-2和IFN-γ（±s）Tab.4 Proliferation of splenocytes，IL-2 and IFN-γ in supernatant of splenocytes induced by Con-A of rats in each group（±s）

注：與模型組比較，*P＜0．05，**P＜0．01。

組別 動物數(shù) 刺激指數(shù) IL-2含量（pg/mL） IFN-γ含量（pg/mL）空白對照組 6 1．35±0．13** 601．88±133．25** 1 081．77±445．21**模型組 6 2．08±0．09 1 508．98±213．93 3 916．69±593．89美沙拉嗪組 6 1．41±0．11** 699．39±123．39** 1 898．06±234．82**當(dāng)歸湯多糖低劑量組 6 1．86±0．22* 1 220．87±243．29* 3 095．51±341．65*當(dāng)歸湯多糖中劑量組 6 1．65±0．11** 1 015．29± 97．47** 2 789．24±678．35**當(dāng)歸湯多糖高劑量組 6 1．42±0．17** 760．20±100．11** 2 260．54± 0．17**

3.2 當(dāng)歸湯多糖對RAW264．7細胞NO生成的影響

3.2.1 當(dāng)歸湯多糖對RAW264．7細胞活力的影響當(dāng)歸湯多糖在 0～800 μg/mL 范圍內(nèi)對 RAW264．7 細胞的增殖無明顯抑制作用，說明在實驗濃度下沒有細胞毒性，可以用于后續(xù)研究。見表5。

表5 當(dāng)歸湯多糖對RAW264.7細胞活力和NO產(chǎn)生的影響（±s，n=3）Tab.5 Effects of DGDPE on cell viability and NO production of RAW264.7 cells（±s，n=3）

表5 當(dāng)歸湯多糖對RAW264.7細胞活力和NO產(chǎn)生的影響（±s，n=3）Tab.5 Effects of DGDPE on cell viability and NO production of RAW264.7 cells（±s，n=3）

注：數(shù)據(jù)以3次獨立重復(fù)實驗的（±s）表示。與陽性對照組比較，**P＜0．01。

濃度（μg/mL） 細胞存活率（%） NO含量（μmol）空白對照組 100．00 2．71±1．72**陽性對照組 — 53．53±3．80 50 96．15±15．92 7．28±2．74**100 95．81± 3．93 13．34±3．69**200 97．03± 3．42 21．31±3．91**400 115．78±16．15 26．41±4．58**800 107．93±14．37 33．69±2．60**

3.2.2 當(dāng)歸湯多糖對RAW264．7細胞NO產(chǎn)生的影響 隨著當(dāng)歸湯多糖濃度的增大，RAW264．7細胞的NO水平劑量依賴性地增加，但顯著低于陽性對照組（P＜0．01）。見表5。

3.3 當(dāng)歸湯多糖對Con-A刺激下正常和UC大鼠脾細胞增殖的影響

3.3.1 當(dāng)歸湯多糖給藥濃度范圍 當(dāng)歸湯多糖在0～800 μg/mL范圍內(nèi)對正常和UC大鼠脾細胞的增殖沒有明顯抑制作用，說明在實驗濃度下沒有細胞毒性，可以用于后續(xù)研究。見表6。

表6 當(dāng)歸湯多糖對正常大鼠和UC大鼠脾細胞活力的影響（±s，n=6）Tab.6 Effects of DGDPE on cell viability of splenocytes of normal rats and ulcerative colitis rats（±s，n=6）

表6 當(dāng)歸湯多糖對正常大鼠和UC大鼠脾細胞活力的影響（±s，n=6）Tab.6 Effects of DGDPE on cell viability of splenocytes of normal rats and ulcerative colitis rats（±s，n=6）

濃度（μg/mL） 脾細胞存活率（%）正常大鼠 UC大鼠空白對照組 100．00± 1．05 100．00±3．05 50 88．73± 5．74 106．72±8．25 100 97．83± 6．36 91．60±2．38 200 102．89± 8．56 104．20±3．83 400 104．48±18．26 104．01±5．99 800 118．64± 4．70 99．80±5．61

3.3.2 當(dāng)歸湯多糖對Con-A刺激下脾細胞增殖的影響 當(dāng)歸湯多糖對Con-A刺激下正常大鼠脾細胞增殖具有明顯促進作用，表現(xiàn)出劑量依賴性，濃度為 800 μg/mL 時增殖率為 51．40%±2．56%；對 Con-A刺激下UC大鼠的脾細胞增殖表現(xiàn)出輕微的抑制作用，濃度為 800 μg/mL 時抑制率為 16．60%±1．59%。見表7、8。

表7 當(dāng)歸湯多糖對Con-A刺激下正常大鼠脾細胞增殖的影響（n=6）Tab.7 Effects of DGDPE on Con-A induced proliferation of splenocytes of normal rats（n=6）

表8 當(dāng)歸湯多糖對Con-A刺激下UC大鼠脾細胞增殖的影響（n=6）Tab.8 Effects of DGDPE on Con-A induced proliferation of splenocytes of rats withulcerative colitis（n=6）

4 討論

臨床上常采用控制炎癥，抑制自身免疫反應(yīng)，改善腸道粘膜屏障等措施治療UC。研究表明，中藥多糖治療UC可能的作用機制有調(diào)節(jié)免疫失衡、修復(fù)腸黏膜損傷、改善腸道菌群失調(diào)、抗氧化和抗炎等[20]。

多糖普遍具有調(diào)節(jié)免疫的作用。NO由受外界刺激而活化的巨噬細胞所分泌，參與免疫調(diào)節(jié)，能夠殺傷腫瘤細胞、微生物等，起到保護機體的作用[21]。當(dāng)歸湯多糖能夠劑量依賴地促進RAW264.7細胞釋放NO，同時NO水平低于陽性對照組，提示當(dāng)歸湯多糖具有溫和的免疫調(diào)節(jié)能力，適宜作為免疫調(diào)節(jié)劑[22]。同時，當(dāng)歸湯多糖能夠促進Con-A刺激下正常大鼠脾細胞增殖，抑制Con-A刺激下TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠的脾細胞增殖，在一定程度上體現(xiàn)了當(dāng)歸湯多糖雙向免疫調(diào)節(jié)能力。通過動物實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠Con-A刺激下脾細胞刺激指數(shù)顯著高于其他組，且Th1免疫應(yīng)答相關(guān)細胞因子IL-2和IFN-γ呈現(xiàn)高表達，表明TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠免疫異常[23]。當(dāng)歸湯多糖能夠劑量依賴地抑制Con-A刺激下的脾細胞增殖、IL-2和IFN-γ產(chǎn)生，表明對于TNBS誘導(dǎo)UC大鼠，當(dāng)歸湯多糖可能通過調(diào)節(jié)異常的免疫應(yīng)答從而達到改善作用。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是UC發(fā)病的另一個重要因素，MDA、SOD和MPO是反映氧化應(yīng)激水平的重要指標。UC會產(chǎn)生大量的氧自由基，致脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量MDA，其含量升高會引起細胞毒性，MDA水平能夠反映氧化損傷程度[24]。當(dāng)體內(nèi)氧自由基增多時，可產(chǎn)生SOD清除氧自由基，所以，SOD活性間接反映組織損傷程度[25]。氧化應(yīng)激會導(dǎo)致中性粒細胞浸潤，中性粒細胞浸潤是UC最突出的組織學(xué)特征之一[26]，MPO是富含于中性粒細胞中的一種血紅素蛋白，外界刺激下中性粒細胞聚集釋放MPO，因此MPO活性可用于評估中性粒細胞浸潤程度，從而間接反映氧化應(yīng)激和炎癥性腸病的嚴重程度[27]。本研究顯示，給予高劑量的當(dāng)歸湯多糖，UC大鼠MDA含量和MPO活力降低，SOD活力升高，表明當(dāng)歸湯多糖可以抑制UC大鼠氧化應(yīng)激，從而改善UC。

綜上所述，當(dāng)歸湯多糖對TNBS誘導(dǎo)的大鼠UC具有改善作用，其作用機制可能與免疫調(diào)節(jié)，抗氧化有關(guān)。