黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的系統(tǒng)藥理學(xué)分析

董書偉　樊靈芝　李磊　王海峰　朱海鯨　翟軍軍　屈雷　王勝義

董書偉（1980-），博士，副教授，主要從事牛羊疾病防治及中獸藥研究工作，曾赴德國(guó)、愛(ài)爾蘭、匈牙利和肯尼亞等國(guó)家開(kāi)展牛病科研合作學(xué)術(shù)交流活動(dòng)。先后主持國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、甘肅省科技計(jì)劃項(xiàng)目及榆林市科技計(jì)劃項(xiàng)目等科研項(xiàng)目4項(xiàng);作為主要完成人參與國(guó)家級(jí)或省部級(jí)科研項(xiàng)目8項(xiàng)。以第一作者或通訊作者在《BMC Veterinary Research》《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)》《畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》等國(guó)內(nèi)外核心期刊上發(fā)表學(xué)術(shù)論文20篇，參編出版著作2部，申請(qǐng)國(guó)家專利20項(xiàng)，成功研制出國(guó)家三類新獸藥3個(gè);獲農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)牧漁業(yè)豐收獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)1項(xiàng)、甘肅省科技進(jìn)步獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)1項(xiàng);被中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)評(píng)為2015年度優(yōu)秀牛病科研工作者。

摘要：【目的】利用系統(tǒng)藥理學(xué)構(gòu)建黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的活性化合物—靶點(diǎn)—通路—疾病相關(guān)蛋白的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)模型，闡述黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的分子機(jī)制，為犢牛腹瀉防治藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。【方法】根據(jù)口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）檢索黃白雙花口服液中每味中藥（黃連、白頭翁、金銀花、黃芩、地榆和烏梅）的活性化合物及與其相對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape繪圖軟件中建立活性化合物與其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的互作網(wǎng)絡(luò)圖;通過(guò)基因數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Cards）檢索犢牛腹瀉的有關(guān)靶點(diǎn)基因，使用維恩圖求取二者的交集，得到犢牛腹瀉與黃白雙花口服液共同的靶點(diǎn)基因組合，然后導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)中以獲得相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖;將黃白雙花口服液作用于犢牛腹瀉的靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(kù)中，分別進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。【結(jié)果】從黃白雙花口服液中篩選出43種活性化合物，分別對(duì)應(yīng)131個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)基因。黃白雙花口服液與犢牛腹瀉交集的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖包括128個(gè)節(jié)點(diǎn)及205條相互關(guān)系，其中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白介素2（IL-2）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、促分裂素原活化蛋白激酶1（MAPK1）及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）的出現(xiàn)頻率較高。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)黃白雙花口服液與犢牛腹瀉交集靶點(diǎn)的蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，最終富集到204條GO功能條目（FDR<10-2），其中細(xì)胞組成條目8條、分子功能條目12條、生物過(guò)程條目184條;黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的相關(guān)蛋白主要富集于19條信號(hào)通路上（FDR<10-2）?！窘Y(jié)論】黃白雙花口服液主要以黃連、白頭翁、金銀花、黃芩、地榆和烏梅中的槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇及山奈酚等活性化合物成分，通過(guò)ATK1、MAPK1、IL-2、IL-6和IL-8等靶點(diǎn)，經(jīng)Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和B細(xì)胞受體信號(hào)通路等，發(fā)揮抗菌消炎、抑制細(xì)胞損傷及調(diào)節(jié)免疫力等作用，以達(dá)到治療犢牛腹瀉的目的。

關(guān)鍵詞： 黃白雙花口服液;系統(tǒng)藥理學(xué);犢牛腹瀉;活性化合物;靶點(diǎn);信號(hào)通路

中圖分類號(hào)： S858.23? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）01-0001-10

Abstract：【Objective】Based on systematic pharmacology， a network of active compound， target， pathway and di-sease-related protein of Huangbaishuanghua oral liquid was established to elucidate the molecular mechanism of treatingdiarrhea in calves， and to provide the theoretical basis for research and development of drugs for the prevention and treatment of diarrhea in calves. 【Method】According to oral utilization（OB）≥30%? and drug-likeness（DL）≥0.18， using traditional Chinese medicine pharmacology （TCMSP） database retrieval and double liquid medium every taste traditional Chinese medicine（Coptidis Rhizoma，Pulsatilliae Radix，Lonicerae Japonicae Flos，Scutellariae Radix，Radix Sanguisorbae and Mume Fructus） of the active compounds and corresponding targets， imported into Cytoscape drawing software to establish active compounds and their corresponding targets interactions network diagram. The target genes of calf diarrhea were retrieved through Gene Cards database， and the intersection of the two was obtained by Venn diagram. The target gene combination of calf diarrhea and Huangbaishuanghua oral liquid was obtained， and then imported into the String database to obtain the network diagram of the interaction of related proteins. The target genes of Huangbaishuanghua oral liquid on diarrhea of calves were imported into DAVID database for GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis， respectively. 【Result】Forty-three active compounds were screened from Huangbaishuanghua oral Liquid， corresponding to 131 related target genes， respectively.Huangbai Shuanghua Oral Liquid and calf diarrhea intersection protein-protein intera-ction network diagram includded 128 nodes and 205 relationship， among them， serine/threonine protein kinase 1（AKT1）， interleukin 2（IL-2） and interleukin 6（IL-6） and interleukin 8（IL-8）， promote the mitogen activated protein kinase 1 （MAPK1） and aspartic acid with cysteine proteinase 3（CASP3） had high occurrence frequency. The GO function enrichment analysis of the proteins at the intersection target of Huangbaishuanghua oral liquid and diarrhea of calfs was conducted using DAVID database. Finally， 204 GO functional items（FDR<10-2） were enriched， including 8 cell composition items， 12 molecular function items and 184 biological process items. The related proteins of Huangbaishuanghua oral liquid in the treatment of diarrhea in calves were mainly enriched in 19 signaling pathways（FDR<10-2）. 【Conclusion】Huangbaishuanghua oral liquid mainly use quercetin， β-phytosterol， stigstanol and kaempferol from Coptidis Rhizoma，Pulsatilliae Radix，Lonicerae Japonicae Flos，Scutellariae Radix，Radix Sanguisorbae and Mume Fructus. Through ATK1， MAPK1， IL-2， IL-6 and IL-8 and other targets， it can play antibacterial and anti-inflammatory roles， inhibit cell damage and regulate immunity through Toll-like receptor signaling pathway， NOD receptor signaling pathway， T cell receptor signaling pathway and B cell receptor signaling pathway， to achieve the purpose of treating calf diarrhea.

Key words： Huangbaishuanghua oral liquid; systematic pharmacology; calf diarrhea; active compound; target; signal pathway

Foundation item： Youth Fund Project of Natural Science Foundation of China（31502113）; Yulin University High Level Talents Research Project （18GK10）

0 引言

【研究意義】犢牛腹瀉是由病原微生物感染、消化不良及飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)榷喾N復(fù)雜因素引發(fā)的一種常見(jiàn)疾病（Lee et al.，2019），其主要臨床表現(xiàn)為排稀薄或水樣糞便，呈黃色或白色，有惡臭，甚至含有黏膜或便血等（武瑞萍，2017），且傳染性強(qiáng)（楊保軍，2010），通常發(fā)病率高達(dá)68.6%、死亡率為8.89%（田密，2019），給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究犢牛腹瀉防治技術(shù)對(duì)保障養(yǎng)牛業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】引起犢牛腹瀉的主要病原有輪狀病毒（Rotavirus）、牛諾如病毒（Bovine norovirus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、隱孢子蟲（Cryptosporidium）和籃氏賈第鞭毛蟲（Giardia lamblia）（Chae et al.，2019;師志海等，2020），其中又以隱孢子蟲感染最嚴(yán)重（Riggs and Schaefer，2020）。目前，抗生素仍是臨床獸醫(yī)治療動(dòng)物疾病的常用藥物（Kr?mker and Leimbach，2017），但長(zhǎng)期使用抗生素極易導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)及動(dòng)物體內(nèi)抗生素殘留（Gudiol，2010），進(jìn)而危及動(dòng)物和人類的健康。中藥不僅具備抗菌消炎及調(diào)控機(jī)體自身免疫等作用，還具有療效好、低毒、低殘留、環(huán)保和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)（王文曉等，2020）。焦桂蘭等（2001）將川黃連、紫花地丁、灶心土、白術(shù)、藕節(jié)、澤夕和茯苓配成方劑，研成細(xì)末后用溫水沖服，在36例犢牛腹瀉中的治愈率達(dá)97.2%。江偉等（2010）選用成藥白頭翁散及白頭翁、黃連、秦皮、板藍(lán)根、蒲公英、石榴皮和訶子等7味中藥提取物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示白頭翁散的抑菌效果明顯，是治療犢牛腹瀉穩(wěn)定性較高的藥劑。李繼昌等（2011）采用烏梅、黃梅和白術(shù)等中藥制備而成的烏連顆粒劑治療細(xì)菌性犢牛腹瀉，結(jié)果顯示其治愈率為88.46%，具有良好的治療效果。倫艷霞等（2013）將金銀花、黃芩、連翹、烏梅和白術(shù)等9味中藥組成復(fù)方治療犢牛腹瀉，結(jié)果表明該中藥復(fù)方制劑對(duì)犢牛腹瀉的療效要優(yōu)于西藥乙酰甲喹。根據(jù)中獸醫(yī)基礎(chǔ)理論和辨證施治原則，可將犢牛腹瀉分為熱痢和寒痢。針對(duì)熱痢，以白頭翁和黃連為君藥、金銀花和黃芩為臣藥、烏梅和地榆為佐藥、葛根為使藥，諸藥合用，能達(dá)到清熱燥濕、涼血止痢、澀腸止瀉及健脾和胃的功效，制備成口服液，臨床治療犢牛腹瀉的治愈率達(dá)83.6%，有效率為96.4%（董書偉等，2010）。經(jīng)藥效學(xué)研究證實(shí)，該中藥制劑具有抗炎、鎮(zhèn)痛、止瀉和調(diào)節(jié)免疫等作用（王勝義等，2011）;經(jīng)毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該中藥制劑為實(shí)際無(wú)毒，且對(duì)其主要有效活性成分進(jìn)行定性和定量分析，制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及篩選出最佳制備工藝（王勝義，2010），最終成功研制出防治犢牛腹瀉的純中藥制劑——黃白雙花口服液，并榮獲國(guó)家三類新獸藥證書（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告 第1959號(hào)）。黃白雙花口服液的臨床應(yīng)用效果顯著，市場(chǎng)反應(yīng)良好，但發(fā)揮作用的分子機(jī)理尚不清楚，進(jìn)而影響其推廣應(yīng)用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】系統(tǒng)藥理學(xué)是綜合系統(tǒng)生物學(xué)與中藥藥理學(xué)的新方法和新理論（Yu et al.，2017;王艷艷等，2019），通過(guò)生物信息學(xué)分析中藥有效成分與藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)間的關(guān)系，并建立相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，以闡明中藥在疾病治療過(guò)程中發(fā)揮作用的分子機(jī)制。系統(tǒng)藥理學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)，與中醫(yī)藥辨證論治的整體思想不謀而合，能在詮釋中藥活性化合物和作用靶點(diǎn)、闡明作用機(jī)制、預(yù)測(cè)新的并發(fā)癥、發(fā)現(xiàn)中藥組效關(guān)系及尋找新藥等方面發(fā)揮重要作用（Zhang et al.，2013;趙雨靚等，2020）。因此，通過(guò)系統(tǒng)藥理學(xué)分析可闡明黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的作用機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以黃白雙花口服液和犢牛腹瀉為研究對(duì)象，利用系統(tǒng)藥理學(xué)構(gòu)建黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的活性化合物—靶點(diǎn)—通路—疾病相關(guān)蛋白的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)模型，進(jìn)一步闡述其發(fā)揮作用的分子機(jī)制，也為犢牛腹瀉防治新藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

黃白雙花口服液主要原料包括黃連、白頭翁、金銀花、黃芩、地榆和烏梅等，在蘭州黃河中藥材市場(chǎng)購(gòu)買原材料后，按一定比例混合，加水浸泡，煎熬3次后濃縮至每毫升含1 g原材料，然后灌入備好的安瓿瓶中，每瓶100 mL，置于陰涼處封存?zhèn)溆?，并根?jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)（王勝義，2010）。

1. 2 所用數(shù)據(jù)庫(kù)

利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)軟件進(jìn)行系統(tǒng)藥理學(xué)分析，主要包括系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcmspw.com，TCMSP）、Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（String）、基因數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Cards）、中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)（Wanfang Data）及Cytoscape繪圖軟件。

1. 3 復(fù)方中藥活性化合物—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索黃白雙花口服液中每味中藥（黃連、白頭翁、金銀花、黃芩、地榆和烏梅）的所有活性化合物，并篩選出與活性化合物相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，參數(shù)設(shè)置為口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18。將符合條件的每味中藥活性化合物及其所對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)下載后，導(dǎo)入Cytoscape繪圖軟件，建立活性化合物與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的互作網(wǎng)絡(luò)圖。OB是藥物篩選非常重要的要素，活性化合物的OB越高，說(shuō)明其越具有進(jìn)一步治療疾病的可能性（黃超，2015）;DL是判斷成藥可能性的重要依據(jù)（Vinotha and Sundar，2019）。

1. 4 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將上述篩選到的藥物靶點(diǎn)上傳至Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇為Bos Taurus，得到中藥活性化合物作用于犢牛體內(nèi)的所有靶點(diǎn)，并利用Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索犢牛腹瀉的有關(guān)靶點(diǎn)基因。將Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的黃白雙花口服液相關(guān)活性化合物靶點(diǎn)與Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的犢牛腹瀉相關(guān)基因，使用維恩圖求取二者的交集，以獲得犢牛腹瀉與黃白雙花口服液共同的靶點(diǎn)基因集。將得到的相關(guān)靶點(diǎn)基因?qū)隨tring軟件，物種選擇為Bos Taurus，即得到黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉相關(guān)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1. 5 靶點(diǎn)基因GO功能富集及KEGG通路富集分析

將黃白雙花口服液作用于犢牛腹瀉的靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(kù)中，物種選擇為Bos Taurus，分別進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析，篩選結(jié)果后導(dǎo)出（FDR<10-2）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 復(fù)方中藥活性化合物—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出43種符合條件的活性化合物，并得到其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape繪圖軟件，建立化合物與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)間的網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），共發(fā)現(xiàn)32種活性化合物節(jié)點(diǎn)、229個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)和679條邊，每種活性化合物平均與21.2個(gè)靶點(diǎn)存在互作關(guān)系，每個(gè)靶點(diǎn)平均與7種活性化合物存在互作關(guān)系，說(shuō)明黃白雙花口服液在治療犢牛腹瀉過(guò)程中存在多成分、多靶點(diǎn)的特征，連接較多靶點(diǎn)及活性化合物的節(jié)點(diǎn)分子在治療犢牛腹瀉疾病中發(fā)揮重要作用;也存在多個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)1種活性化合物，體現(xiàn)了復(fù)方中藥多途徑的作用機(jī)制。從活性化合物的角度來(lái)看， Degree>10的活性化合物有11種，靶點(diǎn)Degree>50的活性化合物有3種（表1）。其中，槲皮素的連接度最高，能與342個(gè)靶點(diǎn)相連接，其次是β-谷甾醇和豆甾醇等。從靶點(diǎn)的角度來(lái)看，連接活性化合物Degree>5的靶點(diǎn)有32個(gè)，分別是雌激素受體（ESR1）、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體（SLC6A2）、一氧化氮合酶2（NOS2）及α1腎上腺素（ADRA1B）等（表2）。

2. 2 復(fù)方中藥成分作用于犢牛腹瀉的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

將通過(guò)Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到與犢牛腹瀉相關(guān)的2804個(gè)靶點(diǎn)基因與Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)中黃白雙花口服液的200個(gè)相關(guān)活性化合物靶點(diǎn)，使用維恩圖求取二者的交集，共得到131個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)基因（圖2）。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)建立復(fù)方中藥各活性化合物靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（分值大于0.9），結(jié)果（圖3）顯示該網(wǎng)絡(luò)圖包括128個(gè)節(jié)點(diǎn)和205條相互關(guān)系，其中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白介素2（IL-2）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、促分裂素原活化蛋白激酶1（MAPK1）及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）的出現(xiàn)頻率較高，故推測(cè)這些蛋白在黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

為了更直觀地反映黃白雙花口服液與犢牛腹瀉的交集靶點(diǎn)與活性化合物間的關(guān)系，將其在String數(shù)據(jù)庫(kù)和TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)與復(fù)方中藥活性化合物的相互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape繪圖軟件，即得到活性化合物與交集靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。

2. 3 GO功能富集分析結(jié)果

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶點(diǎn)的蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，得到204條GO功能條目（FDR<10-2）。其中，細(xì)胞組成條目8條（圖5），包括細(xì)胞外區(qū)域部分（Extracellular region part）、細(xì)胞外空間（Extracellular space）、細(xì)胞質(zhì)（Cytosol）和細(xì)胞成分（Cell fraction）等;分子功能條目12條（圖6），包括配體依賴性核受體活性、類固醇激素受體活性、藥物結(jié)合、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)構(gòu)結(jié)合、同一蛋白質(zhì)結(jié)合（Identical protein binding）、酶結(jié)合（Enzyme binding）、脂質(zhì)結(jié)合（Lipid binding）和蛋白質(zhì)聚合活性（Protein dimerization activity）等;生物過(guò)程條目184條，具體為細(xì)胞增殖（Regulation of cell proliferation）、細(xì)胞程序化死亡調(diào)控（Regulation of programmed cell death）、細(xì)胞死亡調(diào)控（Regulation of cell death）、對(duì)有機(jī)物質(zhì)的響應(yīng)（Response to organic substance）及對(duì)細(xì)胞程序死亡的負(fù)調(diào)控（Negative regulation of programmed cell death）等，圖7是前10種生物過(guò)程條目。

2. 4 KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG通路富集分析結(jié)果（表3）表明，黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的相關(guān)蛋白主要富集在19條信號(hào)通路上（FDR<10-2），包括膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌和p53等癌癥相關(guān)通路（Pathways in cancer），還涉及炎癥相關(guān)的Toll樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway）、NOD樣受體信號(hào)通路（NOD-like receptor signaling pathway）、免疫相關(guān)的T細(xì)胞受體信號(hào)通路（T cell receptor signaling pathway）及B細(xì)胞受體信號(hào)通路（B cell receptor signaling pathway）等。

3 討論

本研究利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)OB和DL篩選出黃白雙花口服液中6味中藥活性化合物的作用靶點(diǎn)，并通過(guò)String、Cytoscape和DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建黃白雙花口服液活性化合物—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖及復(fù)方中藥成分與犢牛腹瀉的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，解析黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的作用分子機(jī)制，也進(jìn)一步印證中藥復(fù)方“多成分—多靶點(diǎn)—多通路”治療疾病的理論。

黃連和白頭翁是黃白雙花口服液中的君藥，治腹瀉的主證。黃連含有槲皮素、氫化小檗堿和黃連素，其中，槲皮素具有抗氧化、抗細(xì)胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)等作用（Li et al.，2016;Mlcek et al.，2016），氫化小檗堿能有效抑制大腸桿菌和腸球菌類病原菌的生長(zhǎng)，同時(shí)具有抗腫瘤等多種藥理活性作用（黃祖良等，2002;Zou et al.，2017）;黃連素的主要作用是抗炎、降血糖和降血脂（Ma et al.，2017）。白頭翁含有β-谷甾醇和豆甾醇，均屬于類固醇，類似于甾體類激素，具有良好的抗炎作用，還可降低血液膽固醇、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及促生長(zhǎng)等（Antwi et al.，2018;汪帥等，2019）。此外，黃白雙花口服液中的金銀花、黃芩、地榆和烏梅等原料含有山奈酚、異鼠李素和黃芩素等活性化合物。山奈酚不僅能抑制凋亡相關(guān)蛋白及信號(hào)通路蛋白的表達(dá)（Wu et al.，2018），還具有抗癌、治療糖尿病和骨質(zhì)疏松等藥理作用（趙妍，2013）;異鼠李素具有抗氧化、抗炎及抗腫瘤等作用（Gao et al.，2017）?？梢?jiàn)，黃白雙花口服液主要是利用上述各種化合物的活性作用，通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮抗菌消炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用，以達(dá)到治療犢牛腹瀉的目的。

本研究通過(guò)分析黃白雙花口服液中與腹瀉相關(guān)基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AKT1、MAPK1、IL-2、IL-6和IL-8為關(guān)鍵蛋白，故推測(cè)黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉是通過(guò)這些蛋白發(fā)揮作用。AKT1可通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)以抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖（Yamashita et al.，2001）;MAPK1為MAPK信號(hào)通路中重要的蛋白家族成員，對(duì)細(xì)胞增殖與分化均起關(guān)鍵作用（Yoon and Seger，2006）。因此，推測(cè)黃白雙花口服液可能是通過(guò)調(diào)控AKT1和MAPK1蛋白表達(dá)，抑制胃腸道黏膜上皮細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)其增殖，從而修復(fù)黏膜損傷。IL-2、IL-6和IL-8是炎癥過(guò)程的趨化因子，是機(jī)體抵御炎癥的調(diào)節(jié)因子。本研究中的KEGG通路富集分析結(jié)果也表明，黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的相關(guān)基因主要富集在Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路和癌癥相關(guān)通路上，推測(cè)黃白雙花口服液也參與調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)。Toll樣受體是一類模式識(shí)別受體，可對(duì)相應(yīng)的病原體進(jìn)行識(shí)別和結(jié)合，并向胞內(nèi)傳遞信號(hào)，誘導(dǎo)IL-6、IL-8、TNF-α及IFN-γ等多種炎癥因子表達(dá)，在病原體入侵早期階段即啟動(dòng)天然免疫;在感染后期階段，還可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的分化，啟動(dòng)獲得性免疫，共同參與抗感染過(guò)程（徐?；ê蛯O蓬明，2020）。T細(xì)胞受體能特異性識(shí)別MHC細(xì)胞表面提呈的抗原肽，并向細(xì)胞內(nèi)部傳遞信號(hào)，誘導(dǎo)酪氨酸激酶活化，促進(jìn)信號(hào)傳遞復(fù)合物組裝，活化下游MAPK、PKC及鈣離子等信號(hào)途徑，最終調(diào)控效應(yīng)蛋白分子表達(dá)，激活機(jī)體的天然免疫（梁靜靜等，2016）。B細(xì)胞受體介導(dǎo)B細(xì)胞的活化，激活機(jī)體的體液免疫及分泌特異性抗體，從而中和病原微生物。因此，在黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉過(guò)程中，T細(xì)胞受體信號(hào)通路和B細(xì)胞受體信號(hào)通路分別參與機(jī)體天然免疫及體液免疫的激活過(guò)程。

綜上所述，黃白雙花口服液中的活性化合物是通過(guò)抑制胃腸道黏膜損傷，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和調(diào)控免疫機(jī)能等生物學(xué)過(guò)程，從而達(dá)到治療犢牛腹瀉的目的，即黃白雙花口服液是通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路來(lái)發(fā)揮藥理作用，與前期的藥理學(xué)研究結(jié)果（王勝義等，2011）相吻合。

4 結(jié)論

黃白雙花口服液主要以黃連、白頭翁、金銀花、黃芩、地榆和烏梅中的槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇及山奈酚等活性化合物成分，通過(guò)ATK1、MAPK1、IL-2、IL-6和IL-8等靶點(diǎn)，經(jīng)Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和B細(xì)胞受體信號(hào)通路等，發(fā)揮抗菌消炎、抑制細(xì)胞損傷及調(diào)節(jié)免疫力等作用，以達(dá)到治療犢牛腹瀉的目的。

參考文獻(xiàn)：

董書偉，劉永明，齊志明，荔霞，劉世祥，王勝義. 2010. 中藥新復(fù)方治療犢牛腹瀉臨床試驗(yàn)[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，（23）：116-117. [Dong S W，Liu Y M，Qi Z M，Li X，Liu S X，Wang S Y. 2010. Clinical trial of new compound Chinese herbal medicine for treating calf diarrhea[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，（23）：116-117.]

黃超. 2015. 藥物口服生物利用度預(yù)測(cè)及在中藥歸經(jīng)研究上的應(yīng)用[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué). [Huang C. 2015. Drug oral bioavailability prediction and application in the meridian tropism theory of traditional Chinese medicine[D]. Yangling：Northwest A & F University.]

黃祖良，韋啟后，湯春榮，李紅蕾. 2002. 氫化小檗堿鎮(zhèn)痛和消炎作用的研究[J]. 江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，14（1）：33-34. [Huang Z L，Wei Q H，Tang C R，Li H L. 2002. Experimental study on anti-inflammatory and analgesia effects of tetrahydraoberberine[J]. Journal of Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine，14（1）：33-34.]

江偉，王洪海，王文有，王國(guó)卿. 2010. 白頭翁散等中藥抑制犢牛腹瀉致病菌的效果[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，（6）：91-92. [Jiang W，Wang H H，Wang W Y，Wang G Q. 2010. The effect of Baitouwengsan and other traditional Chinese medicines on inhibiting the pathogenic bacteria of calf diarrhea[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，（6）：91-92.]

焦桂蘭，譚忠田，孫利國(guó)，于麗麗，郝友珍. 2001. 中藥治療犢牛腹瀉的報(bào)告[J]. 內(nèi)蒙古獸醫(yī)，（4）：39. [Jiao G L，Tan Z T，Sun L G，Yu L L，Hao Y Z. 2001. Report on the treatment of calf diarrhea with traditional Chinese medicine[J]. Inner Mongolia Veterinary Medicine，（4）：39.]

李繼昌，于文會(huì)，張秀英，侯振中，徐利，姜曉文，徐丹丹. 2011. 烏連顆粒劑對(duì)細(xì)菌性犢牛腹瀉的臨床療效觀察[J]. 中國(guó)奶牛，（8）：46-48. [Li J C，Yu W H，Zhang X Y，Hou Z Z，Xu L，Jiang X W，Xu D D. 2011. Clinical effect observation of Wulian granules in treating bacte-rial diarrhea in calves[J]. China Dairy Cows，（8）：46-48.]

梁靜靜，呂俊，魯林榮. 2016. T細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)傳遞的調(diào)控及其功能[J]. 生命科學(xué)，28（2）：153-161. [Liang J J，Lü J，Lu L R. 2016. The regulation and function of TCR signaling pathway[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences，28（2）：153-161.]

倫艷霞，王學(xué)靜，樊愛(ài)麗. 2013. 中藥復(fù)方制劑治療犢牛腹瀉的臨床效果觀察[J]. 中國(guó)奶牛，（10）：65-66. [Lun Y X，Wang X J，F(xiàn)an A L. 2013. Observation on the clinical effect of Chinese herbal compound preparation on calf diarrhea[J]. China Dairy Cows，（10）：65-66.]

師志海，徐照學(xué)，蘭亞莉，王文佳. 2020. 牛諾如病毒及牛嵴病毒雙重PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，28（1）：28-32. [Shi Z H，Xu Z X，Lan Y L，Wang W J. 2020. Development and preliminary application of a duplex PCR method for simult detection of bovine norovirus and bovine kobuvirus[J]. Chinese Journal of Animal Infectious Diseases，28（1）：28-32.]

田密. 2019. 犢牛腹瀉的發(fā)病原因及防治措施[J]. 當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，（8）：24-25. [Tian M. 2019. Cause of calf diarrhea and prevention measures[J]. Modern Animal Husbandry，（8）：24-25.]

汪帥，孫宇，李春梅，盧群. 2019. 豆甾醇的研究進(jìn)展概述[J]. 中國(guó)藥業(yè)，28（23）：96-98. [Wang S，Sun Y，Li C M，Lu Q. 2019. Research progress of stigmasterol[J]. China Pharmaceuticals，28（23）：96-98.]

王勝義，劉永明，齊志明，荔霞，董書偉，劉世祥. 2011. 熱痢凈口服液藥效學(xué)試驗(yàn)[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，47（2）：65-67. [Wang S Y，Liu Y M，Qi Z M，Li X，Dong S W，Liu S X. 2011. Pharmacodynamics test of Reshijing oral liquid[J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine，47（2）：65-67.]

王勝義. 2010. 中獸藥黃白口服液的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與藥效學(xué)研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院. [Wang S Y. 2010. Study on the production method，quality control and pharmacodynamics of traditional Chinese veterinary medicine Huangbai liquid[D]. Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences.]

王文曉，樂(lè)世俊，劉娟，馮五文，陳艷琰，鄢丹，唐于平. 2020. 基于腸道菌群的中藥改善胰島素抵抗的作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中草藥，51（1）：216-228. [Wang W X，Yue S J，Liu J，F(xiàn)eng W W，Chen Y Y，Yan D，Tang Y P. 2020. Research progress on insulin resistance-attenuating mechanisms of Chinese materia medica based on gut microbiota[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，51（1）：216-228.]

王艷艷，王團(tuán)結(jié)，丁琳琳. 2019. 基于系統(tǒng)藥理學(xué)的厚樸藥理作用機(jī)制探究[J]. 中草藥，50（24）：6024-6031. [Wang Y Y，Wang T J，Ding L L. 2019. Exploring pharmacological mechanism of Magnoliae Officinalis Cortex based on systems pharmacology[J]. Chinese Traditional and Her-bal Drugs，50（24）：6024-6031.]

武瑞萍. 2017. 犢牛腹瀉病因及治療措施探析[J]. 畜牧獸醫(yī)科學(xué)（電子版），（12）：48. [Wu R P. 2017. Analysis of the causes and treatment of calf diarrhea[J]. Graziery Veterinary Sciences（Electronic Version），（12）：48.]

徐?；ǎ瑢O蓬明. 2020. Toll樣受體與輸卵管疾病[J]. 中國(guó)生育健康雜志，31（3）：289-291. [Xu H H，Sun P M. 2020. Toll-like receptors and fallopian tube diseases[J]. Chinese Journal of Reproductive Health，31（3）：289-291.]

楊保軍. 2010. 中獸醫(yī)理論指導(dǎo)防治犢牛腹瀉[J]. 中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，36（1）：92-94. [Yang B J. 2010. Theoretical gui-dance of Chinese veterinary medicine to prevent and cure calf diarrhea[J]. China Cattle Science，36（1）：92-94.]

趙妍. 2013. 山奈酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué). [Zhao Y. 2013. Protective effects of kaempferol on the acute lung injury in mice[D]. Harbin：Northeast Agricultural University.]

趙雨靚，李豐，石彬彬，李燕. 2020. 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)Ⅱ：在藥物開(kāi)發(fā)和復(fù)方研究領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 遼寧中醫(yī)雜志，47（3）：92-94. [Zhao Y L，Li F，Shi B B，Li Y. 2020. Chinese medicine systems pharmacology：Progress in drug discovery and formula study[J]. Liaoning Journal of Traditional Chinese Medicine，47（3）：92-94.]

Antwi A O，Obiri D D，Osafo N，Essel L B，F(xiàn)orkuo A D，Atobiga C. 2018. Stigmasterol alleviates cutaneous allergic responses in rodents[J]. BioMed Research Internation，2018：3984068. doi：10.1155/2018/3984068.

Chae J B，Park J，Jung S H，Kang J H，Chae J S，Choi K S. 2019. Acute phase response in bovine coronavirus positive post-weaned calves with diarrhea[J]. Acta Veterinaria Scandinavica，61（1）：36. doi：10.1186/s13028-019-0471-3.

Gao L，Yao R，Liu Y Z，Wang Z，Huang Z，Du B B，Zhang D H，Wu L M，Xiao L L，Zhang Y Z. 2017. Isorhamnetin protects against cardiac hypertrophy through blocking PI3K-AKT pathway[J]. Molecular and Cellular Bioche-mistry，429（1-2）：167-177.

Gudiol F. 2010. Prudent use of antibiotics and suggestions for improvement in long-term-care facilities[J]. Enfermedades Infecciosasy Microbiologia Clinica，28（S4）：32-35.

Kr?mker V，Leimbach S. 2017. Mastitis treatment-reduction in antibiotic usage in dairy cows[J]. Reproduction in Domestic Animals，52（S3）：21-29.

Lee S H，Kim H Y，Choi E W，Kim D. 2019. Causative agents and epidemiology of diarrhea in Korean native calves[J]. Journal of Veterinary Science，20（6）：e64. doi：10.4142/jvs.2019.20.e64.

Li Y，Yao J Y，Han C Y，Yang J X，Chaudhry M T，Wang S N，Liu H N，Yin Y L. 2016. Quercetin，inflammation and immunity[J]. Nutrients，8（3）：167. doi：10.3390/nu8030167.

Ma Y G，Liang L，Zhang Y B，Wang B F，Bai Y G，Dai Z J，Xie M J，Wang Z W. 2017. Berberine reduced blood pressure and improved vasodilation in diabetic rats[J]. Journal of Molecular Endocrinology，59（3）：191-204.

Mlcek J，Jurikova T，Skrovankova S，Sochor J. 2016. Quercetin and its anti-allergic immune response[J]. Molecules，21（5）：623. doi：10.3390/molecules21050623.

Riggs M W，Schaefer D A. 2020. Calf clinical model of cryptosporidiosis for efficacy evaluation of therapeutics[J]. Methods in Molecular Biology，2052：253-282.

Vinotha G，Sundar T V. 2019. Drug likeness prediction using structure based molecular descriptors and support vector machines[J]. Materials Today：Proceedings，18（4）：1658-1669.

Wu P，Meng X F，Zheng H D，Zeng Q，Chen T F，Wang W，Zhang X，Su J Y. 2018. Kaempferol attenuates ROS-induced hemolysis and the molecular mechanism of its induction of apoptosis on bladder cancer[J]. Molecules，23（10）：2592. doi：10.3390/molecules23102592.

Yamashita K，Kajstura J，Discher D J，Wasserlauf B J，Bishopric N H，Anversa P，Webster K A. 2001. Reperfusion-activated Akt kinase prevents apoptosis in transgenic mouse hearts overexpressing insulin-like growth factor-1[J]. Circulation Research，88（6）：609-614.

Yoon S，Seger R. 2006. The extracellular signal-regulated kinase：Multiple substrates regulate diverse cellular functions[J]. Growth Factors，24（1）：21-44.

Yu G H，Zhang Y Q，Ren W Q，Dong L，Li J F，Geng Y，Zhang Y，Li D F，Xu H Y，Yang H J. 2017. Network pharmacology-based identification of key pharmacological pathways of Yin-Huang-Qing-Fei capsule acting on chronic bronchitis[J]. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，12：85-94.

Zhang G B，Li Q Y，Chen Q L，Su S B. 2013. Network pharmacology：A new approach for chinese herbal medicine research[J]. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine，2013：621423. doi：10.1155/2013/621423.

Zou K，Li Z，Zhang Y，Zhang H Y，Li B，Zhu W L，Shi J Y，Jia Q，Li Y M. 2017. Advances in the study of berberine and its derivatives：A focus on anti-inflammatory and anti-tumor effects in the digestive system[J]. Acta Pharmacologica Sinica，38（2）：157-167.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）