miR-206靶向Cx43調(diào)控ERK1/2通路在兔激素性股骨頭壞死中的作用

席源，羅高斌，魏桂清，覃文濤，薄占東

1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，南寧 530021；2.中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院骨科醫(yī)院，廣州 510010

股骨頭壞死是臨床常見(jiàn)的難治性疾病，后期可導(dǎo)致股骨頭塌陷并繼發(fā)嚴(yán)重的功能障礙，致殘率極高，多數(shù)患者最終需選擇關(guān)節(jié)置換等外科治療。近年來(lái)由于激素的廣泛運(yùn)用，糖皮質(zhì)激素已成為非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的重要致病因素[1,2]，且口服皮質(zhì)類固醇對(duì)股骨頭缺血性壞死的病理發(fā)展有持續(xù)性影響[3]。但其確切機(jī)制尚不明確，多種治療方法的療效不盡人意。探索激素性股骨頭壞死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）發(fā)病機(jī)理，對(duì)SANFH 的診治有重要意義。本組前期研究證實(shí)，SANFH 患者股骨頭內(nèi)微小RNA（MicroRNA，miR）-206 表達(dá)上調(diào)，同時(shí)縫隙連接蛋白（connexin，Cx）43 表達(dá)下調(diào)，提示Cx43/miR-206 參與SANFH 的發(fā)生發(fā)展[4]。據(jù)載，Cx43高表達(dá)可激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2 信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化[5]。本研究檢測(cè)兔SANFH 模型中miR-206、Cx43、ERK1/2 及Runx2表達(dá)變化，探討Cx43/miRNA-206 及其下游ERK1/2 通路在SANFH 中的作用，初步闡明其機(jī)制，期為SANFH 診治提供新的理論支持。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康新西蘭大白兔（廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并代為飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK 桂2014-0003），質(zhì)量（2.5±0.3）kg。

1.1.2 主要試劑及儀器 注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（輝瑞制藥，比利時(shí)），大腸桿菌內(nèi)毒素（sigma，美國(guó)）；miRNA 原位雜交試劑盒（EXIQON，丹麥）；鼠抗-Cx43（Santa，美國(guó)）、兔抗-ERK1/2、兔抗-P-ERK1/2、鼠抗-βtubulin（CST，美國(guó)），鼠抗-Runx2（Abnova，中國(guó)臺(tái)灣）；IRDye 800CW goat anti-mouse IgG（H+L）、IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG（H+L）二抗（Licor，美國(guó)）；磷酸酶抑制劑PhosSTOP（Roche，瑞士），RIPA 裂解液（強(qiáng)）、Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（生工生物，中國(guó)），免疫組織化學(xué)試劑盒（博士德，中國(guó)）；總RNA 小量制備試劑盒（Corning，美國(guó)）、PrimeScript ?RT reagent Kit 和TB Green?Premix Ex Taq?II（Takara，日本）。TDH-500 原位雜交儀（奧盛，中國(guó)），Mini-PROTEAN3 電泳槽和Mini Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad，美國(guó)），ABI 7500 Fast 熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems，美國(guó)）；Gyroscan T5-NT 磁共振成像儀（Philips，荷蘭）。

1.2 方法

1.2.1 激素性股骨頭壞死模型構(gòu)建與分組 成年新西蘭大白兔60 只，均分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組；替補(bǔ)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)只。實(shí)驗(yàn)組兔耳緣靜脈注射內(nèi)毒素（10 mg/kg），24 h 后重復(fù)1 次，隨即臀肌注射甲強(qiáng)龍（20 mg/kg），共4 次，每次間隔24 h；注射內(nèi)毒素前1 d 肌注青霉素鈉（8×104U）+蘭索拉唑（10 mg），1 次/d，共7 次。對(duì)照組兔注射等量生理鹽水。注射后第2 周、8 周和16 周，行核磁共振（MRI）檢查。檢查后隨機(jī)取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10 只動(dòng)物予以空氣栓塞處死，取出雙側(cè)股骨頭，按冠狀面切為薄片，PBS 溶液沖洗，一半置于4%多聚甲醛溶液固定，10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脫鈣，梯度酒精脫水，石蠟包埋，5 mm 切片，HE 染色，應(yīng)用Image-Pro-Plus 軟件計(jì)數(shù)空骨陷窩，計(jì)算各組空骨陷窩率。T1 加權(quán)像表現(xiàn)為點(diǎn)狀、細(xì)線狀、片狀低信號(hào)或T2 加權(quán)像表現(xiàn)為點(diǎn)狀、細(xì)線狀、片狀高信號(hào)；骨小梁排列紊亂、變細(xì)或斷裂，骨小梁內(nèi)出現(xiàn)彌漫性空骨陷窩或核皺縮，伴周圍骨髓細(xì)胞壞死診斷為股骨頭壞死。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 按上述方法制備組織切片，60 ℃烘烤30 min，常規(guī)脫蠟至水，10%H2O2溶液處理以滅活內(nèi)源性酶，0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）高壓修復(fù)抗原，滴加5% BSA 室溫封閉20 min。滴加羊抗-Cx43 一抗4 ℃過(guò)夜，PBS（pH 7.2～7.6）洗2 min×3 次，滴加聚合HRP 標(biāo)記抗羊IgG，37 ℃孵育30 min，DAB 顯色，鏡檢。每張切片選取3 個(gè)高倍視野，應(yīng)用Image-Pro-plus 軟件測(cè)量積分光密度值（IOD），并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 miRNA-206 原位雜交 組織切片脫蠟、水化，滴加蛋白酶K 孵育10 min，PBS 洗2 次，梯度酒精脫水；滴加25 ml 雜交混合液于50～60 ℃雜交1 h，1%山羊血清封閉15 min，再加入DIG-AP 抗體（10：800）室溫孵育1 h；PBST 洗3 次，加入AP 底物，30 ℃避光孵育2 h，水洗2 次；細(xì)胞核染液復(fù)染，鏡下觀察。

1.2.4 熒光定量PCR 檢測(cè)（1）按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣本總RNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)計(jì)算RNA 濃度。（2）按PrimeScript?RT reagent Kit 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。（3）實(shí)時(shí)熒光定量：對(duì)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。通過(guò)計(jì)算2-△△Ct值統(tǒng)計(jì)各組目的基因表達(dá)的差異。各基因引物見(jiàn)表1。1.2.5 Western blot 檢測(cè) 用RIPA+PMSF+磷酸酶抑制劑（體積比100：1：1）提取總蛋白。蛋白定量后，取30 mg 蛋白質(zhì)行SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳后轉(zhuǎn)至NC 膜，5%BSA 室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜（工作濃度Cx43 為1：5000，ERK1/2 為1：1000，P-ERK1/2為1：2000，Runx2 為1：2000，β-Tubulin 為1：10000）。二抗室溫孵育1 h（工作濃度為1：10000），Odyssey 成像系統(tǒng)拍照，IPP 軟件測(cè)定條帶灰度值，采用目的條帶與β-Tubulin 條帶的灰度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平（其中P-ERK1/2 條帶與ERK1/2 條帶相對(duì)比）。

表1 熒光定量PCR 引物序列Tab.1 qPCR-specific primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 激素性股骨頭壞死模型制作結(jié)果

在建模過(guò)程中，2 周和8 周實(shí)驗(yàn)組兔分別死亡3只和2 只，16 周無(wú)死亡，死亡兔予以補(bǔ)足。對(duì)照組無(wú)死亡。MRI 檢查：對(duì)照組兔股骨頭為正常信號(hào)影；實(shí)驗(yàn)組兔股骨頭T1 加權(quán)像顯示股骨頭斑塊狀中度信號(hào)影，T2 加權(quán)像表現(xiàn)為不均勻高信號(hào)影，伴隨關(guān)節(jié)積液（圖1）。HE 染色：對(duì)照組骨小梁完整，空骨陷窩少見(jiàn)（圖2A）；實(shí)驗(yàn)組骨小梁變細(xì)、斷裂，骨小梁內(nèi)空骨陷窩增多，髓腔組織中脂肪細(xì)胞直徑增大（圖2B～D）。股骨頭內(nèi)空骨陷窩率（%）：2 周實(shí)驗(yàn)組（13.91±2.20）、8周實(shí)驗(yàn)組（16.98±1.73）和16 周實(shí)驗(yàn)組（20.74±1.92）明顯高于同期對(duì)照組（7.83±1.25）、（8.71±1.63）和（8.98±1.72），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.599，P=0.000；t=11.002，P=0.000；t=14.427，P=0.000）。

圖1 股骨頭MRI 檢查結(jié)果A：實(shí)驗(yàn)組T1 加權(quán)像 B：實(shí)驗(yàn)組T2 加權(quán)像 C：對(duì)照組T1 加權(quán)像 D：對(duì)照組T2 加權(quán)像藍(lán)色箭頭指斑塊狀信號(hào)影 紅色箭頭指關(guān)節(jié)積液Fig.1 MRI imaging of bilateral femoral headsA：T1WI coronal scan of rabbits in the model group; B：T2WI coronal scan of rabbits in the model group; C：T1WI coronal scan of rabbits in the control group; D：T2WI coronal scan of rabbits in the control groupBlue arrow:plaque signal shadow;Red arrow:joint effusion

經(jīng)MRI 檢查和HE 染色篩選，2 周和8 周實(shí)驗(yàn)組分別有3 只和1 只動(dòng)物股骨頭未出現(xiàn)典型壞死而被剔除。模型成功率為70%。

2.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Cx43 表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性為棕黃色，正常情況下Cx43 陽(yáng)性表達(dá)于成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及髓腔中。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組股骨頭強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)Cx43，2 周、8 周和16周實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組染色明顯減弱。IOD 結(jié)果顯示：2周實(shí)驗(yàn)組IOD（39.43±4.47）較2 周對(duì)照組（59.23±7.90）降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.898，P=0.000）；8 周實(shí)驗(yàn)組IOD（32.34±4.52）較8 周對(duì)照組（61.53±5.65）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.757，P=0.000）；16 周實(shí)驗(yàn)組IOD（27.14±6.50）較16周對(duì)照組（60.77±6.36）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.694，P=0.000），見(jiàn)圖3。

2.3 原位雜交檢測(cè)結(jié)果

原位雜交檢測(cè)，紫藍(lán)色為陽(yáng)性MiR-206，核為粉紅色。實(shí)驗(yàn)組miR-206 強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)于髓腔、成骨細(xì)胞和少量骨細(xì)胞內(nèi)，對(duì)照組miR-206 僅少量表達(dá)于髓腔和成骨細(xì)胞內(nèi)（圖4）。

2.4 qPCR 檢測(cè)結(jié)果

圖2 股骨頭組織病理檢查結(jié)果（HE 染色）A：對(duì)照組 B：2 周實(shí)驗(yàn)組 C：8 周實(shí)驗(yàn)組 D：16 周實(shí)驗(yàn)組藍(lán)色箭頭指脂肪細(xì)胞 黑色箭頭指空骨陷窩 紅色箭頭指斷裂的骨小梁Fig.2 HE staining of the femoral heads in the two groupsA: control group; B：model group of 2 weeks; C：model group of 8 weeks; D：model group of 16 weeks； Blue arrow: fat cells；Black arrow:empty lacuna； Red arrow:fractured trabecular bone

圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Cx43A：對(duì)照組股骨頭Cx43 強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)于骨小梁邊緣成骨細(xì)胞，骨細(xì)胞和髓腔內(nèi) B：2 周實(shí)驗(yàn)組股骨頭Cx43 陽(yáng)性表達(dá)于成骨細(xì)胞和髓腔內(nèi) C：8 周實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)Cx43 弱陽(yáng)性表達(dá)于成骨細(xì)胞和髓腔內(nèi) D：16 周實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)Cx43 弱陽(yáng)性表達(dá)于成骨細(xì)胞和髓腔內(nèi) E：Cx43 免疫組織化學(xué)染色I(xiàn)OD 比較*與同期對(duì)照組比較，P＜0.01Fig.3 Cx43 ISH stainingA:Cx43 of the femoral head of the control group was positively expressed on the trabecular bone marginal osteoblasts,osteocytes and intramedullary cavity;B: Cx43 of the 2 weeks model group was positively expressed on osteoblasts and intramedullary cavity; C: Cx43 of the 8 weeks model group was weak expressed on osteoblasts and intramedullary cavity; D:Cx43 of the 16 weeks model group was weak expressed on osteoblasts and intramedullary cavity; E:IOD comparison of Cx43 ISH staining;*Compared with the control group at corresponding time points,P ＜0.01

圖4 原位雜交檢測(cè)miR-206對(duì)照組（A）股骨頭內(nèi)僅少量miR-206 表達(dá)于髓腔和成骨細(xì)胞內(nèi)，2周（B）、8 周（C）和16 周（D）實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)見(jiàn)大量miR-206 表達(dá)于成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及髓腔Fig.4 ISH of miR-206A: Only a small amount of miR-206 expression was in the medullary cavity and osteoblasts in the femoral head of the control group; B,C and D:A large amount of miR-206 expression was in osteoblasts,osteocytes and medullary cavity in the femoral head of model group at 2、8 and 16 weeks

圖5 qPCR 檢測(cè)2 周、8 周、16 周實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組miR-206（A）、Cx43（B）和Runx2（C）相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖*與對(duì)照組比較，P＜0.05Fig.5 qPCR of miR-206(A)、Cx43(B)and Runx2(C)in model group and control group at different times*Compared with the control group,P＜0.05

qPCR 檢測(cè)顯示，miR-206 在實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)，造模后第2 周、8 周和16 周，實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)miR-206 表達(dá)量與對(duì)照組股骨頭內(nèi)miR-206 表達(dá)量的比值即2-△△ct為（2.85±0.09）、（2.91±0.11）和（3.28±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=45.961，P=0.000；t=38.825，P=0.000 和t=42.484，P=0.000）；Cx43、Runx2 mRNA 在實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)表達(dá)較對(duì)照組均減少，造模后第2 周、8 周和16 周，實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)Cx43 表達(dá)量與對(duì)照組股骨頭內(nèi)Cx43 表達(dá)量的比值即2-△△ct為（0.40±0.06）、（0.33±0.04）和（0.24±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-18.424，P=0.000；t=-37.442，P=0.000 和t=-42.472，P=0.000）；實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)Runx2 表達(dá)量與對(duì)照組股骨頭內(nèi)Runx2 表達(dá)量的比值即2-△△ct為(0.82±0.09)、(0.69±0.04)和(0.51±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.472，P=0.002；t=-17.324，P=0.000和t=-21.909，P=0.000)，見(jiàn)圖5。

2.5 Western blot 檢測(cè)

造模后2 周、8 周和16 周，Western blot 分析顯示，實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)Cx43、Runx2 蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組股骨頭，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模后2 周實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)磷酸化ERK1/2 表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），造模后8 周和16 周，實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)磷酸化ERK1/2 相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖6）。

3 討論

3.1 成骨分化與SANFH

圖6 免疫印跡檢測(cè)2 周、8 周、16 周實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Cx43、ERK1/2 和Runx2 相對(duì)表達(dá)量（A）及其統(tǒng)計(jì)圖（B）*與對(duì)照組比較，P＜0.05Fig.6 Immuno blotting results A:Western blot of Cx43,ERK1/2 and Runx2 in model group and control group at 2,8,16 weeks；B：Relative expression of Cx43,ERK1/2 and Runx2 in model group and control group at 2,8,16 weeks*Compared with the control group,P ＜0.05

骨的發(fā)育塑形由成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞協(xié)同完成，成骨細(xì)胞參與骨基質(zhì)的合成、分泌及礦化等，在骨發(fā)育成熟和修復(fù)重建過(guò)程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，SANFH 模型中成骨細(xì)胞分化能力顯著下降，成骨細(xì)胞數(shù)量減少及功能降低引起成骨分化不足，引發(fā)早期股骨頭壞死修復(fù)障礙[6]。激素可上調(diào)成脂相關(guān)基因（如PPAR-γ），同時(shí)下調(diào)成骨相關(guān)基因（如Runx2/Cbfa1），導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化增加而成骨分化減少，成骨細(xì)胞生成減少[7,8]。自體成骨細(xì)胞移植可有效改善股骨頭壞死后的修復(fù)[9]。Runx2 屬于runt 結(jié)構(gòu)域基因家族，能夠激活并啟動(dòng)MSCs 向成骨細(xì)胞系分化。應(yīng)用地塞米松誘導(dǎo)大鼠SANFH 模型研究發(fā)現(xiàn)，模型鼠股骨頭內(nèi)Runx2 和osterix 基因表達(dá)、蛋白合成均較對(duì)照組減少[10]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用內(nèi)毒素聯(lián)合激素誘導(dǎo)兔SANFH 模型發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組兔股骨頭內(nèi)Runx2 基因及蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，且隨時(shí)間推移有下降趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，成骨分化在早期SANFH 中發(fā)揮重要作用，激素可能通過(guò)抑制成骨分化影響正常骨代謝，參與SANFH 的發(fā)生發(fā)展及修復(fù)過(guò)程。

3.2 miR-206 及其靶蛋白Cx43 在SANFH 中的作用

MicroRNA 是動(dòng)植物中廣泛存在的一類分編碼單鏈小分子RNA，在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞增殖、分化及凋亡方面發(fā)揮重要作用，與骨的正常發(fā)育、塑形和維持密切相關(guān)[11]。早期研究認(rèn)為miR-206 特異性表達(dá)于骨骼肌[12]，而Inose 等[13]、Zhang 等[14]發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞同樣表達(dá)miR-206。在C2C12 細(xì)胞成骨分化過(guò)程中，miR-206 下調(diào)，而過(guò)表達(dá)miR-206 則可抑制成骨細(xì)胞分化。在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)的第7 d 和第14 d，miR-206表達(dá)顯著下調(diào)，miR-206 過(guò)度表達(dá)的BMSCs 堿性磷酸酶（ALP）活性減弱，成骨標(biāo)志物Runx2 和骨橋蛋白（OPN）的mRNA 水平顯著下調(diào)[15]。進(jìn)一步研究表明，骨組織中一個(gè)重要的縫隙連接蛋白Cx43 是miR-206的靶蛋白，Anderson 等[16]研究表明，Cx43 基因的3，非翻譯區(qū)有兩個(gè)可以與miRNA-206 完全互補(bǔ)的序列，從而抑制Cx43 mRNA 的翻譯，減少Cx43 表達(dá)，以減少正在生成的肌纖維間的通訊，進(jìn)而促進(jìn)肌肉細(xì)胞分化。Inose 等[13]研究顯示在成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-206 后，Cx43 蛋白表達(dá)減少，成骨細(xì)胞分化能力減弱，而轉(zhuǎn)染anti-miR-206 后，Cx43 蛋白的表達(dá)增加，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。

Cx43 可通過(guò)調(diào)控骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞功能參與骨的發(fā)生與塑形。在MC3T3-E1 成骨細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)Cx43 會(huì)加強(qiáng)Runx2 的依賴性轉(zhuǎn)錄活性；反之，以siRNA 干擾Cx43 表達(dá)，Runx2 則受到抑制[17]。骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化過(guò)程中Cx43 表達(dá)明顯增加，慢病毒介導(dǎo)的Cx43 表達(dá)下調(diào)后，成骨分化被抑制[18]。本研究顯示，miR-206 表達(dá)定位于股骨頭骨小梁周邊的骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及髓腔內(nèi)，且實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)表達(dá)較對(duì)照組增多；Cx43 及其mRNA 在實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)表達(dá)均低于正常組。推測(cè)miR-206 可能通過(guò)下調(diào)Cx43導(dǎo)致了SANFH 的進(jìn)展。值得一提的是，本研究觀察到實(shí)驗(yàn)組股骨頭Cx43 mRNA 水平也降低，此結(jié)果和Inonse 等[13]研究結(jié)論有所出入，推測(cè)可能存在其他miRNA 或信號(hào)通路在SANFH 病程中對(duì)Cx43 基因轉(zhuǎn)錄具有調(diào)節(jié)作用，這需進(jìn)一步研究。

3.3 ERK1/2 信號(hào)通路在SANFH 中的作用

本研究結(jié)果顯示，各時(shí)期實(shí)驗(yàn)組兔股骨頭內(nèi)ERK1/2 蛋白磷酸化水平均低于對(duì)照組，說(shuō)明ERK1/2信號(hào)通路在SANFH 中被抑制。ERK1/2 通路是絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）系統(tǒng)中最為重要的通路之一，MAPKs 是細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的一種蛋白，可將信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核的重要介質(zhì)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、分裂活化和凋亡等多個(gè)生理過(guò)程。而ERK1/2 通路與成骨細(xì)胞增殖和分化密切相關(guān)[19,20]。細(xì)胞外信號(hào)如生長(zhǎng)因子，與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合促進(jìn)ERK 磷酸化，促進(jìn)成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2 和osterix 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖[21]。Cx43 半通道開(kāi)放可借助激活ERK1/2 信號(hào)通路，抑制促凋亡蛋白Bad，激活CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（C/EBP β）的抗凋亡作用，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞存活[22]。Cx43 高表達(dá)還可激活ERK1/2 信號(hào)通路，促進(jìn)成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2 表達(dá)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組兔股骨頭內(nèi)Cx43、Runx2 基因表達(dá)下調(diào)，Cx43、ERK1/2、Runx2 蛋白表達(dá)也下調(diào)，表明SANFH 兔模型Cx43 下調(diào)，抑制了ERK1/2 信號(hào)通路，導(dǎo)致成骨分化障礙和骨細(xì)胞凋亡增加，參與SANFH 的發(fā)生發(fā)展。

據(jù)此推測(cè)，miR-206 可通過(guò)調(diào)低Cx43 水平，導(dǎo)致骨細(xì)胞間通訊“故障”，進(jìn)而成骨障礙，最終引發(fā)SANFH；更進(jìn)一步，Cx43 低表達(dá)可影響其下游ERK1/2 通路，引起成骨細(xì)胞分化障礙，參與SANFH 的發(fā)展過(guò)程。miR-206 和其目的蛋白Cx43、ERK1/2 或許是SANFH 診療新的切入點(diǎn)，miR-206 抑制劑可能對(duì)SANFH 的防治有正面效果。