P45斷層塑化技術(shù)在應(yīng)用解剖學(xué)研究中的應(yīng)用

孫詩竹，于勝波，隋鴻錦

大連醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室，遼寧 大連 116044

生物塑化技術(shù)是上世紀(jì)70 年代末德國Hagens[1]發(fā)明的一項(xiàng)組織保存技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于解剖學(xué)、生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和藝術(shù)等相關(guān)領(lǐng)域。生物塑化過程是將生物組織中的水分和脂類用多聚物替代的過程。根據(jù)所用的多聚物不同，分為硅橡膠、多聚化乳膠、聚酯共聚體和環(huán)氧樹脂4種技術(shù)[2]。P45斷層塑化技術(shù)屬于生物塑化中的聚酯樹脂技術(shù)，由隋鴻錦教授[3]于2003 年發(fā)明。運(yùn)用該技術(shù)制作的塑化斷層標(biāo)本具有干燥、無毒、不變形、便于手持觀察等特點(diǎn)，還實(shí)現(xiàn)了透明化，可原位展示切片內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的形態(tài)及其相互關(guān)系，對計(jì)算機(jī)斷層掃描、核磁共振等現(xiàn)代臨床影像學(xué)診斷圖像進(jìn)行更好的解讀。因此，該技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)斷層解剖學(xué)研究方法不足，為應(yīng)用解剖學(xué)提供了新型研究方法。

1 P45 斷層塑化標(biāo)本的制作流程

P45 斷層塑化技術(shù)的基本步驟包括切片、漂白、脫水、真空浸滲、固化和切割打磨等[4]。首先，經(jīng)福爾馬林等防腐處理的標(biāo)本（剔除毛發(fā)）低溫冷凍，之后用聚氨酯發(fā)泡劑包埋，再冰凍2 周，使用大型帶鋸進(jìn)行連續(xù)鋸切。將切好的標(biāo)本放置于耐丙酮金屬網(wǎng)內(nèi)，用流水沖洗，然后浸入5%雙氧水中漂白至預(yù)定效果。在-25 ℃環(huán)境下依次放入由低濃度到高濃度的丙酮中進(jìn)行梯度脫水脫脂。置入二氯甲烷中1～2 d 可達(dá)到更好透明效果。組織切片放到Hoffen P45 平板箱用P45 樹脂浸滲，將平板箱垂直置于常溫真空箱中，將真空箱密封后緩慢抽真空，逐漸調(diào)低壓力直到接近0 mmHg，并維持該壓力至平板箱Hoffen P45 樹脂中不再出現(xiàn)氣泡。將切片連同平板箱放入40 ℃水浴，待其硬化后取出冷卻至室溫，用曲線鋸去除切片組織周邊多余部分，而后沿其邊緣切割打磨，用羊毛輪打磨光滑，即完成P45 斷層塑化標(biāo)本制作。

2 P45 斷層塑化標(biāo)本與福爾馬林保存的斷層解剖標(biāo)本比較

P45 斷層塑化標(biāo)本與福爾馬林保存斷層解剖標(biāo)本相比較具有鮮明的優(yōu)勢（表1）。傳統(tǒng)福爾馬林保存的人體斷層薄層標(biāo)本（簡稱傳統(tǒng)標(biāo)本）經(jīng)冰凍、劃線、鋸切、水洗、保存等步驟制作完成，保存在密封有機(jī)玻璃盒內(nèi)[5]。其標(biāo)本結(jié)構(gòu)容易移位，甚至遺失，不易分清次序，用線縫牽引則可能破壞組織的完整性。標(biāo)本體積大、笨重、易破損，標(biāo)本盒玻璃表面磨損影響觀察效果[6]。一旦出現(xiàn)固定液滲漏，揮發(fā)出來的甲醛有害健康[6]。P45 斷層塑化標(biāo)本（簡稱P45 標(biāo)本）用樹脂代替固定液可避免甲醛對人體的刺激和危害，其保存不需標(biāo)本盒及固定液，標(biāo)本體積小，重量輕。塑化切片更易存放、長久保存，后期維護(hù)簡單。P45 斷層塑化標(biāo)本整體干燥輕巧，有利于科研及教學(xué)使用，方便在學(xué)習(xí)和學(xué)術(shù)交流現(xiàn)場展示。

P45 標(biāo)本相對于傳統(tǒng)標(biāo)本，切片更薄，有助于在更多層面觀察。而且P45 標(biāo)本切片透明化，透光性好，標(biāo)本內(nèi)部各解剖結(jié)構(gòu)顯示清晰，可放在X 線閱片燈上觀察，也可拿在手里對著光源直接觀察。這是傳統(tǒng)不透明標(biāo)本無法實(shí)現(xiàn)的。在觀察結(jié)果記錄方面，傳統(tǒng)標(biāo)本在有機(jī)玻璃盒中保存無法獲得清晰照片，取出后由于是濕的標(biāo)本液體反光而影響照片質(zhì)量。另外，斷層標(biāo)本內(nèi)結(jié)構(gòu)因搬動(dòng)而易發(fā)生移位，也影響觀察結(jié)果的準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)標(biāo)本不利于反復(fù)觀察研究和拍照。而P45 標(biāo)本實(shí)現(xiàn)原位透明觀察，可將切片置于X 線閱片燈，用相機(jī)拍照，可獲得清晰斷層標(biāo)本照片和可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。切片透光度好，結(jié)構(gòu)間無明顯陰影和遮擋，切片內(nèi)部的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)均能有效呈現(xiàn)和記錄，標(biāo)本可反復(fù)觀察和拍照，既方便，又能不斷豐富實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果。

3 P45 斷層塑化標(biāo)本對MRI、CT 影像的指導(dǎo)意義

MRI 和CT 是臨床常用的斷層影像檢查方法[7]。CT 檢查掃描時(shí)間短、后處理技術(shù)強(qiáng)大，是臨床骨組織的常用檢查方法。CT 圖像可觀察到骨組織呈現(xiàn)高信號，肌肉韌帶等軟組織呈低信號；因分辨率所限，不能區(qū)分骨皮質(zhì)和松質(zhì)的邊界，對于一些微細(xì)結(jié)構(gòu)顯示不清。MRI 成像分辨力高，多用于軟組織檢查[8,9]。MR 序列T1 和T2 信號長短由組織內(nèi)含水量決定，如患者出現(xiàn)炎癥或損傷，則其呈現(xiàn)高信號，而部分損傷可能會表現(xiàn)出分層現(xiàn)象。由于骨組織含水量少，MR 對該組織顯示敏感度低。臨床上多層螺旋CT 與MR 聯(lián)合可提高診斷率[10]。但目前CT 和MR 均無法清晰顯示精細(xì)解剖結(jié)構(gòu)，尤其是軟組織。運(yùn)用P45 標(biāo)本可行連續(xù)觀察每個(gè)斷層精細(xì)結(jié)構(gòu)，如骨松質(zhì)形態(tài)和分布、肌和韌帶在骨皮質(zhì)上的附著情況等（圖1[11]）?；诖?，可運(yùn)用P45 技術(shù)制作符合臨床診斷需要層面的斷層標(biāo)本，指導(dǎo)CT 與MR 信號的解讀[12]。

4 P45 斷層塑化技術(shù)在科研中的應(yīng)用

表1 福爾馬林保存的斷層解剖標(biāo)本與P45 斷層塑化標(biāo)本的比較Tab.1 Comparison between formalin sectional specimens and P45 plastinated slices

圖1 足矢狀位P45 斷層塑化切片[11]相較于MR 與CT 信號強(qiáng)度受組織敏感性的影響，P45 切片可大范圍清晰準(zhǔn)確地觀察到筋膜、肌、韌帶等軟組織和骨密質(zhì)、骨松質(zhì)的形態(tài)Fig.1 Sagittal P45 plastinated section of the footMR and CT images subject to limitations of gray value.The soft tissue such as fascia,muscle,and ligament,and bony tissue such as compact and spongy bone are showed clearly in P45 plastinated section.The picture quoted from‘P45 technology reveals bow-and-arrow sign in human ankle[11]

4.1 在肌硬膜橋復(fù)合體研究中的應(yīng)用

P45 技術(shù)在肌硬膜橋研究方面發(fā)揮了重要作用[13]。Zheng 等[14]運(yùn)用頭頸部P45 斷層塑化切片研究枕下區(qū)域復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)并命名了2 種新韌帶，即待命名韌帶（TBNL，圖2[14]）和椎硬膜韌帶，并提出“肌硬膜橋復(fù)合體”概念和肌硬膜橋給腦脊液循環(huán)提供動(dòng)力的功能假說，顯著推進(jìn)了肌硬膜橋研究[15～19]。P45 切片作為原位透明塑化保存的斷層標(biāo)本，它在原位顯示筋膜、韌帶、纖維結(jié)締組織和肌纖維等結(jié)構(gòu)具有顯著優(yōu)勢[3,20]。大體解剖技術(shù)是破壞性顯示手段，同時(shí)受解剖操作者主觀判斷影響，其客觀性受到限制。組織學(xué)觀察比較客觀，但觀察范圍局限，很難大范圍觀察組織結(jié)構(gòu)的走形，延續(xù)和相互關(guān)系。而P45 切片能夠原位客觀保存和展示標(biāo)本內(nèi)部精細(xì)解剖信息，尤其是纖維性結(jié)構(gòu)的空間分布、走形和附著等特征。該技術(shù)在觀察尺度上填補(bǔ)了大體解剖和顯微切片觀察之間的“技術(shù)空白區(qū)”，是“巨微解剖學(xué)”觀察和新結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)的技術(shù)創(chuàng)新。

4.2 P45 斷層塑化技術(shù)在面部整形解剖學(xué)研究中的應(yīng)用

近年來，隨著創(chuàng)傷修復(fù)和整形外科的迅速發(fā)展，尤其是微整形技術(shù)的推廣應(yīng)用，迫切需要面部淺層軟組織結(jié)構(gòu)的精細(xì)解剖學(xué)支持。傳統(tǒng)標(biāo)本技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)顯示過程中不可避免地會損壞細(xì)微結(jié)構(gòu)，且無法實(shí)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)的客觀完整顯示。獲得高質(zhì)量大體解剖標(biāo)本對于解剖技術(shù)要求很高，其準(zhǔn)確性會受到人為因素影響。組織學(xué)切片技術(shù)可用于觀察細(xì)微結(jié)構(gòu)，但其范圍局限。而P45 技術(shù)的優(yōu)勢在于既保持了組織結(jié)構(gòu)完整性，也可在較大范圍內(nèi)以高清晰度顯示細(xì)微結(jié)構(gòu)[21]。應(yīng)用于面部解剖結(jié)構(gòu)研究可原位從皮膚、皮下脂肪、淺肌腱膜系統(tǒng)（SMAS）和SMAS 下間隙等逐層顯示各結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，及各層間的毗鄰關(guān)系。淳璞等[22]用P45 技術(shù)對上瞼結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，層次顯示清晰，脂肪間隙明確，脂肪間隔的整體分布特征明顯，其通過眶P45 標(biāo)本系統(tǒng)展示了上瞼的脂肪組織分布：眶隔前區(qū)域的眼輪匝肌后脂肪、穿插走形在眶隔前脂肪的肌下纖維組織、眶隔脂肪，位于眉毛后方的眉脂肪墊；清晰闡明了上瞼脂肪的分布類型（圖3）[23]。

圖2 枕頸部正中矢狀位P45 斷層塑化切片與同部位大體解剖對照[14]P45 切片可清晰顯示待命名韌帶（TBNL）的分布,P45 切片相對于大體解剖標(biāo)本能夠清晰、原位展現(xiàn)標(biāo)本內(nèi)部結(jié)構(gòu)精細(xì)解剖信息。Occi.枕骨 RCPma.頭后大直肌 RCPmi.頭后小直肌 NL.項(xiàng)韌帶 TBNL.待命名韌帶AF.TBNL 弓狀纖維 RF. TBNL 輻射狀纖維 SC.頭夾肌Fig.2 Comparission of the median sagittal P45 plastinated section of the occipitusneck and the dissected specimensP45 sheets clearly showed the To Be Named Ligaments.P45 sheets maintain the tissue structure insitu and shows internal precise structure higher clarity.Occi, occipital bone; RCPma, rectus capitis posterior major; RCPmi, rectus capitis posterior minor; NL, nuchal ligament; TBNL, To Be Named Ligament; AF, arcuate fibers of TBNL;RF,radial fibers of TBNL;SC,splenus capitis

圖3 上瞼矢狀位P45 斷層塑化切片[23]P45 切片清晰展示上瞼結(jié)構(gòu)層次及其形態(tài)特點(diǎn)FB.額骨 BF.眉脂肪墊 SF.肌下纖維組織 FM.額肌 OM.眼輪匝肌S.皮膚EL.睫毛T.瞼板OS.眶隔PF.眶隔前脂肪OF.眶隔后脂肪LA. 提上瞼肌MM. Muller 肌Fig.3 Sagittal P45 plastinated section of the upper eyelidP45 slice clearly showed the structural layers of the upper eyelid and their morphological featuresFB, frontal bone; BF, eyebrow fat; SF, Subfrontal fibrous;FM, frontal muscle; OM, orbicularis oculi muscle; S, skin;EL, eyelash; T, tarsus; OS, orbital septum; PF, preseptal fat;OF,preaponeurotic fat; LA,levator aponeurosis; MM,muller's muscle

4.3 P45 斷層塑化技術(shù)在科普中的應(yīng)用

生物塑化技術(shù)可使標(biāo)本內(nèi)部結(jié)構(gòu)得到充分顯示，尤其斷層塑化標(biāo)本可在透明光學(xué)狀態(tài)下觀察較大區(qū)域標(biāo)本細(xì)微結(jié)構(gòu)，為生物標(biāo)本的科普展示開辟了全新的境界，同時(shí)還為生命科學(xué)普及提供嶄新的視角和豐富的素材。隋鴻錦等[24～26]主編的生命奧秘叢書（《達(dá)爾文的證據(jù)》、《深海魚影》和《人體的奧秘》）以達(dá)爾文進(jìn)化論為導(dǎo)引，利用生物塑化技術(shù)制作大量海洋、陸地脊椎動(dòng)物和人體標(biāo)本生動(dòng)地呈現(xiàn)給廣大讀者。書中大量應(yīng)用P45 斷層塑化標(biāo)本圖片，精美而細(xì)致展現(xiàn)人和動(dòng)物身體內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)，從比較解剖學(xué)的角度，揭示了生物多樣性、變異性與統(tǒng)一性。該叢書所實(shí)現(xiàn)的創(chuàng)造性生命科普成就獲得國家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。

5 小結(jié)和展望

基于P35、P40 技術(shù)的P45 塑化斷層技術(shù)改進(jìn)了前二者的缺陷[27,28]，是組織切片保存新技術(shù)，P45 標(biāo)本除具有塑化標(biāo)本的干燥無味、方便耐用等優(yōu)勢[29]，還減輕了材料變形縮水難題，使標(biāo)本更接近自然狀態(tài)。該技術(shù)對標(biāo)本進(jìn)行脫水脫脂使其更加清晰透明[30]，可更加真實(shí)客觀地觀察肌肉和纖維結(jié)締組織的“起止-走徑”及各個(gè)組織結(jié)構(gòu)間的連結(jié)與毗鄰關(guān)系，尤其適用于對纖維組織從“大體”到“微觀”的形態(tài)學(xué)觀察，是將組織學(xué)與解剖學(xué)緊密結(jié)合的新型觀察方法[4]。CT、MR 等臨床影像檢查法因各組織成像敏感度不同，呈現(xiàn)低信號組織的形態(tài)可能顯示不完全，而使圖像無法整體性地顯示各組織層次。而相同平面的P45 標(biāo)本可作為CT、MR 信號解讀的解剖學(xué)依據(jù)，更好地理解解剖部位及周圍組織連系，提高診斷準(zhǔn)確度。

總之，P45 斷層塑化標(biāo)本是斷層標(biāo)本本質(zhì)的變革，完成了斷層標(biāo)本與CT、MR 斷層掃描的有機(jī)統(tǒng)一，實(shí)現(xiàn)了生命科學(xué)研究“死-活統(tǒng)一”、“宏-微統(tǒng)一”和“2D-3D 統(tǒng)一”的3 統(tǒng)一特征和技術(shù)優(yōu)勢，開啟了臨床解剖學(xué)研究的新時(shí)代。