以石斛為例研究多基原及非藥用目標(biāo)選育品種的質(zhì)量差異△

王秋玲，劉倩倩，袁鳳霞，盧奇奇，丁志鵬，胡宏，魏建和*

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院，咸陽(yáng) 陜西 710026

多基原藥材是指多個(gè)物種同時(shí)作為一種藥材使用，不利于實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量的穩(wěn)定、可控，產(chǎn)生的原因包括地域資源限制、物種區(qū)分困難等。《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2015年版收錄的618種藥材及飲片中，多基原藥材有158種，占總數(shù)的25.6%，涉及的中成藥處方占比可達(dá)85%，可見(jiàn)其影響面巨大[1-2]。與此同時(shí)，還有一種形式的“多基原”一直未能引起人們的重視，即在同一物種層面非藥用目標(biāo)選育獲得的品種，如觀賞用芍藥、油用玫瑰、蔬果用百合及大量茶用菊花種質(zhì)。其中，白芍、牡丹皮、百合等少數(shù)藥材已經(jīng)形成了主流的藥用種質(zhì)，鮮見(jiàn)混用；其余多數(shù)還沒(méi)有明確的藥用種質(zhì)，不同用途種質(zhì)混作藥用，給藥品質(zhì)量帶來(lái)隱患。

石斛類藥材是存在上述隱患的典型代表之一。《中國(guó)藥典》2015年版收載鐵皮石斛和石斛2種藥材。鐵皮石斛基原為鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo，而石斛基原為金釵石斛D.nobileLindl.、霍山石斛D.huoshanenseC.Z.Tang et S.J. Cheng、鼓槌石斛D.chryotooxumLindl.或流蘇石斛D.fimbriatumHook.的栽培品及其同屬植物近似種，數(shù)量眾多。以鐵皮石斛、金釵石斛為代表的藥用石斛自20世紀(jì)90年代才開(kāi)始人工生產(chǎn)；而園藝界石斛產(chǎn)業(yè)起步于19世紀(jì)。在英國(guó)皇家園藝協(xié)會(huì)(RHS)登記的新品種每年超百個(gè)，其親本融合的原生種達(dá)數(shù)十個(gè)，還有大量已經(jīng)流通但尚未登記的品種，形成了根據(jù)開(kāi)花季節(jié)劃分的“春石斛”和“秋石斛”兩大類商品，在東南亞地區(qū)具有較大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)。“春石斛”主要由產(chǎn)自我國(guó)的金釵石斛與亞熱帶地區(qū)其他原生種培育而成。“秋石斛”以原產(chǎn)澳大利亞的蝴蝶石斛D.phalaenopsisFitzg.為主要親本雜交而成。觀賞石斛常以切花的形式被餐飲業(yè)用作擺盤裝飾，取走花葶后的大量老莖則成為廢品而流入了藥用市場(chǎng)。近年來(lái)，石斛類盆花在國(guó)內(nèi)也開(kāi)始受到消費(fèi)者的喜愛(ài)。由于鐵皮石斛提高免疫力的功能已經(jīng)得到普及，普通消費(fèi)者極易誤認(rèn)為石斛均能提高免疫力。關(guān)于不同來(lái)源物種的石斛化學(xué)成分、藥效學(xué)已有報(bào)道[3-9]，但納入非藥用目標(biāo)選育品種一起進(jìn)行比較的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)比石斛屬6個(gè)原生種、12個(gè)觀賞石斛品種及1種石斛類藥材中近緣易混品金石斛Flickingeriacomata(Bl.) Hawkes.間的質(zhì)量差異，為石斛藥用種質(zhì)使用及類似現(xiàn)象藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

全部石斛原生種材料取材于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所本草生態(tài)溫室，觀賞石斛材料由東方迦南蘭花產(chǎn)業(yè)有限公司提供。樣品經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所王秋玲副研究員鑒定，信息見(jiàn)表1。全部樣品為2年生新鮮健壯莖枝，采用50 ℃低溫烘干，期間揉搓多次至葉鞘搓凈，干燥。

表1 石斛樣品信息

1.2 試藥

對(duì)照品無(wú)水葡萄糖(批號(hào)：160207，純度>99%)、石斛堿(批號(hào)：160512，純度>98%)、毛蘭素(批號(hào)：160305，純度>98%)、石斛酚(批號(hào)：160307，純度>95%)、天冬氨酸(批號(hào)：160218，純度>99%)均購(gòu)于上海融合醫(yī)藥有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、三羥甲基氨基甲烷、硫酸慶大霉素(批號(hào)：E003632—10G)均購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司；枯草芽孢桿菌[批號(hào)：CMCC(B)63501-2a22-1]、大腸埃希菌[批號(hào)：CMCC(B)44102-3a24-2]、金黃色葡萄球菌[批號(hào)：CMCC(B)26003-5a29-1]、白色念珠菌[批號(hào)：CMCC(F)98001-2a15-3]購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；改良馬丁培養(yǎng)基(批號(hào)：HB5222)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào)：HB4114-19)購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；SA緩沖液(上海源葉生物有限公司)；2%壓積羊血細(xì)胞(SRBC)、10% SRBC、1%雞紅細(xì)胞(鄭州九龍生物制品有限公司)；文齊試劑(天津市現(xiàn)代高科技研究院中山研究所)；溴甲酚紫(天津市巴斯夫化工有限公司)；Giemsa 染液、Hanks 液、補(bǔ)體(豚鼠血清)均購(gòu)于北京耀威振興科技有限公司；無(wú)支原體小牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；其余試劑為分析純。

1.3 儀器

UV1700PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)；6890N型氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；UltiMate 3000 型高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；1525/2487型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；GZX-GF101-3-BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；AL-204和AL201型分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；LXJ-ⅡB型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HWS26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；UPH-I-20T型優(yōu)普系列超純水器(成都超純科技有限公司)；THC型數(shù)控超聲波提取機(jī)(濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司)；FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋[三洋電機(jī)(中國(guó))]；DL-CJ-2NDI型潔凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；DH-250型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司)；Bio-TekELX800 型光吸收酶標(biāo)儀(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；CX23 型生物顯微鏡(奧林巴斯中國(guó)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠[SPF級(jí)，斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司]84只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證編號(hào)：SYXK(京)2013-0023。

2 方法

2.1 化學(xué)成分分析

選擇石斛屬中已有報(bào)道具有活性的5種主要成分進(jìn)行測(cè)定，分別是多糖、石斛堿、毛蘭素、石斛酚和總氨基酸[10-18]。其中，多糖、石斛堿、毛蘭素的含量測(cè)定分別按照《中國(guó)藥典》2015年版中鐵皮石斛、金釵石斛和鼓槌石斛的含量測(cè)定方法[1]。石斛酚含量測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[19]報(bào)道方法，采用分散液-液微萃取與高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定。總氨基酸含量測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[20]報(bào)道方法，以天冬氨酸為對(duì)照品，采用茚三酮顯色，分光光度法測(cè)定。全部樣品3次重復(fù)。

2.2 體外抗氧化活性

2.2.1供試藥液制備 取每種石斛粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.5 g，加50%乙醇50 mL中加熱回流2 h，冷卻抽濾，重復(fù)提取2次，合并濾液濃縮蒸發(fā)，定容至50 mL；每種石斛樣品重復(fù)3次。

2.3 正常小鼠免疫調(diào)節(jié)活性

2.3.1供試藥液制備 分別精密稱取NS1和ODA3的干燥藥材100 g，剪為約1 cm小段，采用純水熱回流提取3次，濾液濃縮至黏稠，加入80%體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，24 h后抽濾，濾渣進(jìn)行真空冷凍干燥后，分別得石斛多糖粉末34.5、28.2 g備用。

2.3.2動(dòng)物分組及給藥方式 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為7組，包括NS1多糖溶液高、中、低劑量組，ODA3多糖溶液高、中、低劑量組及空白對(duì)照組，每組12只。2種石斛多糖溶液的高、中、低劑量組每日分別給藥0.8、0.4、0.2 g·kg-1，每只小鼠每日灌胃給藥0.2 mL，對(duì)照組小鼠每天按給藥的液體量，進(jìn)行純水灌胃，持續(xù)30 d后，頸椎脫臼處死，取樣。

2.3.3測(cè)定指標(biāo)與方法 按參考文獻(xiàn)[25]中免疫調(diào)節(jié)功能產(chǎn)品檢測(cè)指標(biāo)的建議與方法，測(cè)定小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、體液免疫功能中血清溶血素，單核巨噬細(xì)胞功能中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅血細(xì)胞吞噬率。其中，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀代替分光光度計(jì)進(jìn)行血清溶血素測(cè)定[26]。

2.4 體外抑菌活性

2.4.1供試藥液制備 精密稱取NS1和ODA3粉末(過(guò)四號(hào)篩)，分別以等量水、50%乙醇和85%乙醇為提取溶劑，回流提取得浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮，得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水相部位，冷凍干燥后研磨，得各活性部位粉末，密封冷藏備用。

2.4.2測(cè)定指標(biāo)與方法 采用紙片法測(cè)定2種石斛不同提取物對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的抑菌能力。分別用胰酪大豆胨培養(yǎng)基接種大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌，改良馬丁培養(yǎng)基接種的白色念珠菌，制成帶菌培養(yǎng)皿。臨用前用無(wú)菌水與各干燥粉末分別配成質(zhì)量濃度0.5 mg·mL-1的提取液，其中醇溶性部位在使用前加入去離子水制成混懸液，取6 mm直徑滅菌濾紙圓片30份在各提取物液體中浸泡2 h，晾干后分別平鋪于接種帶菌培養(yǎng)皿中，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，測(cè)定抑菌圈直徑，計(jì)算抑菌率[27]。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同來(lái)源石斛樣品中化學(xué)成分含量

全部樣品的多糖、石斛堿、毛蘭素、石斛酚、氨基酸含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。總體來(lái)看，5種成分在不同來(lái)源石斛樣品之間的差異較大。19個(gè)樣品均檢測(cè)到多糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為1.33%，最高為32.69%，相差超20倍。其中，6個(gè)石斛屬原生種中僅有NS1的多糖含量達(dá)到了《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定限量。觀賞石斛中4種秋石斛(ODA2、ODA3、ODA6、ODA7)中的平均多糖含量也達(dá)到了《中國(guó)藥典》2015年版限量標(biāo)準(zhǔn)，且有2種與鐵皮石斛差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10個(gè)樣品的石斛堿含量均低于檢測(cè)限，其余9個(gè)樣品中最低為0.04%、最高為1.02%，相差26倍。其中，NS2的石斛堿含量與其他8個(gè)樣品(3個(gè)原生種和5個(gè)觀賞石斛)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)為NS5的石斛堿含量高于金釵石斛，其余7個(gè)樣品均顯著低于金釵石斛，且未達(dá)到《中國(guó)藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)。17個(gè)樣品的毛蘭素含量低于檢測(cè)限，1種觀賞石斛(ODS4)中檢測(cè)到微量(0.01%)，另1個(gè)為鼓槌石斛(NS6)達(dá)到1.56%。8個(gè)樣品的石斛酚含量低于檢測(cè)限，其余11個(gè)樣品中最低為0.02%，最高為0.23%，相差超10倍，其中春石斛和秋石斛中分別有1種的石斛酚含量較高，其余均小于0.2%。19個(gè)均檢測(cè)到總氨基酸，最低為0.01%，最高為1.78%，相差超100倍，含量高的前5個(gè)樣品來(lái)自秋石斛類群。

對(duì)比不同類群石斛間的差異，NS1與NS2之間的多糖、石斛堿、石斛酚、總氨基酸含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。金石斛屬易混品(NS7)分別與鐵皮石斛和金釵石斛之間的多糖、石斛堿、石斛酚、總氨基酸含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。金釵石斛與其他4種(NS3～NS6)同樣可作為石斛藥材使用的原生石斛相比，測(cè)定的5種成分中至少有2種成分含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。全部12個(gè)觀賞石斛與NS1或NS2的5種成分比較，存在至少2種成分含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同來(lái)源石斛樣品多糖、石斛堿、毛蘭素、石斛酚、總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

續(xù)表2

3.2 不同來(lái)源石斛樣品體外抗氧化活性

表3 不同來(lái)源石斛樣品體外抗氧化活性

3.3 鐵皮石斛與觀賞石斛免疫調(diào)節(jié)功能對(duì)比

各組小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅血細(xì)胞吞噬率及血清溶血素變化見(jiàn)表4。由表4可知，各組小鼠平均體質(zhì)量與空白對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在對(duì)小鼠免疫器官胸腺和脾臟質(zhì)量的影響方面，NS1高劑量組的脾臟指數(shù)顯著高于空白對(duì)照組，其余均與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在調(diào)節(jié)非特異性免疫功能(巨噬細(xì)胞吞噬活性)和特異性免疫功能半數(shù)溶血值(HC50)方面，NS1和ODA3的活性存在明顯差異，表現(xiàn)為與對(duì)照組相比，NS1高、中劑量組能顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力(P<0.05)，并顯著增加小鼠的HC50(P<0.05)，2種作用均隨劑量加大而增強(qiáng)。ODA3高、中、低劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力均與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高、中劑量可顯著降低小鼠的HC50(P<0.05)。

3.4 鐵皮石斛與觀賞石斛抑菌功能對(duì)比

2種石斛不同提取部位的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，NS1和ODA3對(duì)白色念珠菌、金黃色葡萄球菌均無(wú)抑制作用，對(duì)大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌均具有抑制作用，但都沒(méi)有達(dá)到硫酸慶大霉素對(duì)照的效果。ODA3 50%醇提物的正丁醇部位對(duì)大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用效果較好，抑菌圈直徑分別達(dá)11.67、12.00 mm；NS1 85%醇提物水層對(duì)大腸埃希菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)10.67 mm，50%醇提物的石油醚萃取部位對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用較強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)12.00 mm。

對(duì)比NS1與ODA3之間的差異情況，ODA3全部提取部位對(duì)大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌均具有抑制作用，而NS1分別有2個(gè)提取部位對(duì)大腸埃希菌沒(méi)有抑菌效果，3個(gè)提取部位對(duì)枯草芽孢桿菌沒(méi)有抑菌效果。NS1與ODA3的相同提取部位之間，在分別作用于大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌上分別有5個(gè)部位和4個(gè)部位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，共9個(gè)顯著差異組中8個(gè)為ODA3抑菌效果好于NS1，1個(gè)NS1作用更強(qiáng)。

4 討論

4.1 多基原藥材的質(zhì)量差異問(wèn)題

本研究通過(guò)對(duì)比不同來(lái)源石斛類藥材質(zhì)量可知，單一基原的鐵皮石斛與藥材石斛的多個(gè)基原物種，以及易混偽品金石斛之間均存在差異，支持鐵皮石斛作為獨(dú)立的藥材。但石斛藥材5個(gè)原生基原物種間的化學(xué)成分、體外抗氧化活性方面存在顯著差異，同樣入藥可能對(duì)臨床療效有較大影響。

《中國(guó)藥典》2015年版收載的158種多基原藥材中，約有2/3以上的種類都已經(jīng)解決了人工生產(chǎn)技術(shù)，但大部分都沒(méi)有形成人工生產(chǎn)規(guī)模，栽培資源還沒(méi)有完全取代野生資源。石斛中金釵石斛就是代表，是歷代本草公認(rèn)的物種，也早已實(shí)現(xiàn)了人工生產(chǎn)技術(shù)的突破，貴州赤水地區(qū)還形成了一定的生產(chǎn)規(guī)模。然而，由于標(biāo)準(zhǔn)允許多基原的存在，野生采集、進(jìn)口補(bǔ)充，甚至非藥用品種的低價(jià)沖擊，致使金釵石斛人工生產(chǎn)潛力沒(méi)有得到充分挖掘。與此同時(shí)，《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ、《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(征求意見(jiàn)稿)》已把石斛屬所有物種都列入，迫切需要從資源利用角度建立行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。由此，筆者認(rèn)為，唯有在標(biāo)準(zhǔn)制訂和原料選擇時(shí)，少一些對(duì)資源現(xiàn)狀的妥協(xié)，市場(chǎng)自然會(huì)促進(jìn)最優(yōu)品種的野生變家種生產(chǎn)，人工生產(chǎn)規(guī)模的提升不能等到野生資源無(wú)法供應(yīng)，甚至達(dá)到瀕危時(shí)才進(jìn)行。

表4 2種石斛多糖不同劑量對(duì)小鼠免疫功能指標(biāo)的影響

表5 NS1與ODA3不同萃取部位體外抑菌實(shí)驗(yàn)抑菌圈直徑 mm

4.2 非藥用目標(biāo)選育品種的質(zhì)量差異問(wèn)題

《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(修訂稿)》中提出“禁用人工干預(yù)產(chǎn)生的種間雜交品種”[28]。利用不同物種進(jìn)行雜交育種是園藝、食品育種界常用的方法，但最易帶來(lái)質(zhì)量的改變，特別是發(fā)揮藥效、引起不良反應(yīng)的成分都未充分明確的藥材。如陳皮來(lái)源于橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種，但由于果業(yè)的發(fā)展，市場(chǎng)流通的陳皮常來(lái)源于橘和非《中國(guó)藥典》2015年版物種橙等的雜交品種，如“貢柑”“椪柑”“春見(jiàn)”等，沖擊了陳皮的質(zhì)量[29]。在整個(gè)屬都能作為法定石斛來(lái)源使用的前提下，大部分觀賞石斛均為屬內(nèi)不同種雜交而來(lái)，基原混雜的問(wèn)題較為普遍。

在本研究分析的全部觀賞石斛品種中，至少有1種成分與鐵皮或金釵石斛存在顯著差異。研究選擇多糖含量達(dá)《中國(guó)藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)的秋石斛品種ODA3與鐵皮石斛進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)和體外抑菌活性對(duì)比，結(jié)果顯示，兩者的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力和HC50存在顯著差異，表現(xiàn)為相對(duì)于對(duì)照組鐵皮石斛具有增強(qiáng)免疫功能的作用，而觀賞石斛存在抑制作用。兩者的體外抑菌活性也表現(xiàn)出部分提取部位間存在顯著差異，說(shuō)明觀賞石斛作為鐵皮石斛使用應(yīng)慎重。