亞麻薺CsLEC1 基因家族的鑒定及其在種子發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

王志龍，周雅莉，鄧咪咪，郝月茹，薛應(yīng)紅，薛金愛(ài)，苑麗霞，李潤(rùn)植

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801；2.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西晉中030600）

亞麻薺（Camelina sativa（L.）Crantz）是一種十字花科亞麻薺屬的油料作物，具有耐低溫、耐旱、栽培簡(jiǎn)單且生育期短等特點(diǎn)，因此，其栽培和應(yīng)用日益廣泛[1]。亞麻薺種子中含有多種對(duì)人體有益的不飽和脂肪酸，是一種新型的油料作物，亞麻薺種子含油量高達(dá)52%，含有油酸、亞油酸、亞麻酸等多種不飽和脂肪酸，其中，α- 亞麻酸的含量高達(dá)30%[2-4]。已有研究證明，α- 亞麻酸具有增強(qiáng)人體免疫力、調(diào)節(jié)血脂、降壓降糖、延緩衰老等功效[5-7]。此外，亞麻薺油還可作為航天航空等生物燃油使用，在生物新能源領(lǐng)域具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力[8-9]。迄今為止，亞麻薺種子中的脂肪酸合成代謝機(jī)制還尚未完全解析，因此，對(duì)亞麻薺油脂合成機(jī)制的深入研究具有一定的實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值。

LEC1（Leafy Cotyledon1）是編碼CCAAT-Box結(jié)合因子（CAAT box-binding factors，CBF）HAP3（Heme-activated protein）的一個(gè)亞基，是胚發(fā)育的一個(gè)重要調(diào)控因子，可調(diào)控多個(gè)成熟特異性基因的表達(dá)，增加種子貯藏蛋白的積累[10-11]。近年來(lái)，已有研究發(fā)現(xiàn)，LEC1參與脂肪酸的合成調(diào)控。LEC1過(guò)量表達(dá)可以調(diào)控油脂合成通路中多個(gè)脂肪酸相關(guān)基因的表達(dá)，從而改變脂肪酸的成分和含量。在擬南芥中，過(guò)表達(dá)LEC1可導(dǎo)致TAG 含量的增加，增加種子含油量[12]。玉米ZmLEC1基因過(guò)表達(dá)使突變體的種子含油量增加了48%[13]，通過(guò)基因共表達(dá)分析表明，ZmLEC1直接或間接調(diào)節(jié)ZmWRI1的表達(dá)。TAN 等[14]在油菜種子中特異表達(dá)BnLEC1，使轉(zhuǎn)基因油菜種子含油率提高2%～20%，且對(duì)主要農(nóng)藝性狀無(wú)負(fù)調(diào)控作用。異位表達(dá)LEC1同樣可調(diào)節(jié)與激素響應(yīng)相關(guān)和光響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)[15]。可見(jiàn)，LEC1在植物的油脂合成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，然而，在亞麻薺中還未見(jiàn)LEC1轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)報(bào)道。

基于已經(jīng)公布的亞麻薺基因組數(shù)據(jù)[16]和已知功能的擬南芥AtLEC1 同源蛋白序列[12]，本研究通過(guò)對(duì)亞麻薺CsLEC1基因家族的鑒定、蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析以及CsLEC1基因在種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式分析，旨在揭示CsLEC1 蛋白結(jié)構(gòu)和功能，為闡明亞麻薺CsLEC1基因?qū)ΨN子中油脂的合成調(diào)控機(jī)制和優(yōu)良品種選育提供理論依據(jù)。

近日，中共漳州市委、漳州市人民政府印發(fā)《關(guān)于加強(qiáng)和完善城鄉(xiāng)社區(qū)治理的實(shí)施意見(jiàn)》（漳委發(fā)〔2018〕15號(hào)），明確漳州市將降低門檻，鼓勵(lì)家庭服務(wù)性質(zhì)的創(chuàng)業(yè)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站試驗(yàn)田正常生長(zhǎng)的亞麻薺種子為材料，采集開(kāi)花后10、20、30、40 d 的亞麻薺種子，用液氮冷凍后于-80 ℃下貯存。

1.2 亞麻薺LEC1 基因家族成員鑒定

利用ProtParam 對(duì)亞麻薺CsLEC1編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果如表3 所示，CsLEC1的開(kāi)放閱讀框?yàn)?20～726 bp，編碼239～241 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為25.89～26.10ku；CsLEC1-1 和CsLEC1-3為穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)＜40），CsLEC1-2 為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)＞40）；理論等電點(diǎn)小于7，均為酸性蛋白；親水性指數(shù)為負(fù)值，均為親水性蛋白。3 個(gè)CsLEC1 蛋白均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽存在，且定位于細(xì)胞核，據(jù)此推測(cè)均屬非分泌型蛋白。

采用同源建模對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，以擬南芥組蛋白折疊二聚體“L1L NF-YC3”的晶體結(jié)構(gòu)（5g49.1 蛋白）[20]為模板，對(duì)CsLEC1 蛋白進(jìn)行同源建模，結(jié)果如圖2 所示，亞麻薺3 個(gè)CsLEC1 蛋白與該模板蛋白的序列相似性和覆蓋率均為58%和38%，且3 個(gè)蛋白均以單體形式發(fā)揮作用。在亞麻薺CsLEC1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)可見(jiàn)3 個(gè)α 螺旋和2 個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)，三維模型一樣，說(shuō)明該家族基因功能可能高度一致。

1.3 CsLEC1 基因編碼蛋白理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用Expasy 工具ProtParam（http://www.expasy.org/tools）分析CsLEC1編碼蛋白的理化性質(zhì)；利用TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析CsLEC1 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)CsLEC1 蛋白的信號(hào)肽；使用WoLF PSORT（https://www.genscript.com/wolf-psort.html）預(yù)測(cè)CsLEC1 蛋白的亞細(xì)胞定位。利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html） 預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 CsLEC1 蛋白多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

多序列比對(duì)結(jié)果如圖1 所示，亞麻薺CsLEC1氨基酸序列中均含有3 個(gè)α 螺旋（藍(lán)色橫線標(biāo)注）和2 個(gè)L 環(huán)（紅色橫線標(biāo)注），4 個(gè)LEC1 蛋白中均含有HAP3 亞基中高度保守的B 結(jié)構(gòu)域（灰色區(qū)域標(biāo)出）。其中，α1 螺旋中存在DNA 結(jié)合序列“MPIANVI”，可以與CCAAT 結(jié)合因子相互作用；α2螺旋中存在亞基間相互作用的序列“IQECVSECISFI”[17-18]。在L1 組蛋白折疊基序和α2 螺旋結(jié)構(gòu)之間還存在1 個(gè)天冬氨酸Asp 殘基（紅色區(qū)域標(biāo)出），該氨基酸殘基被證明是LEC1 蛋白中B 結(jié)構(gòu)域內(nèi)的重要功能位點(diǎn)，參與調(diào)控種子胚胎的形成[19]。

表1 其他物種的LEC1 蛋白基本信息

1.5 CsLEC1 基因在種子中的表達(dá)量分析

耳聾篩查在正常聽(tīng)力育齡婦女中可有效檢出大量潛在的耳聾攜帶者，可以有效地避免耳聾患兒的出生，對(duì)于預(yù)防藥物性耳聾也是很有效的檢出手段。隨著耳聾出生缺陷預(yù)防工程在臨床的鋪展，一些檢測(cè)或者遺傳咨詢過(guò)程中遇到的問(wèn)題也在增多，如檢測(cè)假陽(yáng)性、表型-基因型差異性問(wèn)題，對(duì)于檢測(cè)人員及遺傳咨詢醫(yī)生都需要不斷完善自我。

對(duì)獲得的3 個(gè)CsLEC1基因，利用Primer 6.0 軟件設(shè)計(jì)PCR 引物，引物信息如表2 所示。使用艾德萊公司的EASYspin 植物RNA 快速提取試劑盒提取亞麻薺種子的RNA，使用ABM 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 的第1 鏈用于后續(xù)試驗(yàn)。以亞麻薺CsActin基因?yàn)閮?nèi)參，用Genstar 公司的2×增強(qiáng)型染料實(shí)時(shí)熒光定量PCR 預(yù)混液進(jìn)行qRT-PCR 試驗(yàn)，反應(yīng)體系為：正向和反向引物各0.2 μL、cDNA模板0.5 μL、2×RealStar Green Power Mixture 5 μL、RNase-free H2O 4.1 μL，共10 μL。采用3 步法熒光定量反應(yīng)程序：95 ℃10 min；95 ℃15 s，59.9 ℃1 min，72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

表2 試驗(yàn)所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻薺CsLEC1 編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

本試驗(yàn)用擬南芥AtLEC1 蛋白序列（＞NP_173616.2）為檢索序列，在亞麻薺基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.camelinadb.ca/）中BLAST 分析，獲得亞麻薺CsLEC1基因序列，鑒定獲得3 個(gè)亞麻薺CsLEC1基因，分別命名為CsLEC1-1（Csa03g-025850.1）、CsLEC1-2（Csa14g027200.1）、CsLEC1-3（Csa17g028800.1）。

二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果如表4 所示，亞麻薺CsLEC1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α 螺旋、β 轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈4 種結(jié)構(gòu)組成，且4 種結(jié)構(gòu)中，α 螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲所占的比例最大。

表3 CsLEC1 蛋白的基本理化性質(zhì)

2.2 CsLEC1 氨基酸多序列比對(duì)

使用Genedoc 軟件對(duì)CsLEC1 和擬南芥AtLEC1 進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)。用MEGA 7.0 中鄰接法構(gòu)建CsLEC1 蛋白和其他物種LEC1 蛋白（表1）的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.3 CsLEC1 蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

②錨桿布置：錨桿排距1.0 m，每排13根。拱基線位置每側(cè)各打設(shè)一根，拱基線往下各布置5根錨桿，間距0.9 m。

根據(jù)上述分析，產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新速度對(duì)創(chuàng)新效益的影響可能存在非線性關(guān)系，即門檻效應(yīng)。以單門檻為例，如果存在1個(gè)創(chuàng)新速度門檻水平τ，當(dāng)S≤τ以及S＞τ時(shí)，產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新速度對(duì)創(chuàng)新效益的彈性系數(shù)并不一致，并呈現(xiàn)出顯著的差異，為此引入虛擬變量Di:

表4 CsLEC1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 %

長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)的傳統(tǒng)金融業(yè)無(wú)法滿足居民的投資需求。股票市場(chǎng)波動(dòng)較大風(fēng)險(xiǎn)高，銀行存款收益率低，收益率和風(fēng)險(xiǎn)無(wú)法同時(shí)滿足投資者的需求。個(gè)人理財(cái)產(chǎn)品的出現(xiàn)很好的解決了這一矛盾，雖然存在一定風(fēng)險(xiǎn)，但是相比于股市，個(gè)人理財(cái)產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)要小很多，與此同時(shí)個(gè)人理財(cái)產(chǎn)品的收益有遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于銀行的固定存款。因此在很大程度上滿足了市場(chǎng)上大部分風(fēng)險(xiǎn)厭惡型的投資者。

2.4 CsLEC1 蛋白與其他物種LEC1 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEGA 7.0 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)如圖3 所示，LEC1 同源蛋白分為2 個(gè)亞族，即亞麻薺CsLEC1蛋白與擬南芥AtLEC1 蛋白、甘藍(lán)型油菜BnLEC1蛋白聚為一族，分析發(fā)現(xiàn)，這3 種植物均屬于十字花科植物，可能其有共同的進(jìn)化來(lái)源和發(fā)揮相同的功能。該結(jié)果為后續(xù)解析亞麻薺CsLEC1基因的功能提供了重要的參考信息。

2.5 CsLEC1 基因的表達(dá)模式分析

通過(guò)對(duì)亞麻薺的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[21]分析得知，CsLEC1基因僅在種子中有轉(zhuǎn)錄表達(dá)，亞麻薺種子是油脂的主要儲(chǔ)存器官，為探究亞麻薺CsLEC1基因在不同發(fā)育時(shí)期種子中的表達(dá)情況，以亞麻薺CsActin作為內(nèi)參基因，通過(guò)qRT-PCR 分析亞麻薺不同發(fā)育時(shí)期種子中CsLEC1基因的表達(dá)模式，結(jié)果如圖4 所示，在開(kāi)花后10 ～20 d 的種子中，亞麻薺3 個(gè)CsLEC1基因表達(dá)量均逐漸升高，且在開(kāi)花后20 d 表達(dá)量達(dá)到最大；隨著種子的發(fā)育成熟，3 個(gè)基因表達(dá)量逐漸降低。

3 結(jié)論與討論

本研究以擬南芥AtLEC1 蛋白序列為同源序列，在亞麻薺基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST 得到3 個(gè)CsLEC1 蛋白編碼基因，分別命名為CsLEC1-1、CsLEC1-2和CsLEC1-3。經(jīng)過(guò)理化性質(zhì)分析表明，亞麻薺CsLEC1 蛋白定位于細(xì)胞核中，為不含有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽的酸性、親水性蛋白，與擬南芥AtLEC1 的氨基酸理化性質(zhì)相似。蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，亞麻薺CsLEC1 蛋白中含有3 個(gè)α 螺旋結(jié)構(gòu)和2 個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)，為HAP3 高度保守的B 結(jié)構(gòu)域，證明這3 個(gè)CsLEC1 蛋白都屬于LEC1 家族。HAP3 亞基由A、B、C 共3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成[19]，其中，B 結(jié)構(gòu)域中具有5 個(gè)組蛋白折疊基序，3 個(gè)α 螺旋（α1、α2、α3）和2 個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)（L1、L2），α1 螺旋中存在DNA 結(jié)合序列MPIANVI，可與CCAAT 結(jié)合因子相互作用；α2 螺旋中存在亞基間相互作用的序列IQECVSECISFI[17-18]。CsLEC1 蛋白中α1 螺旋結(jié)構(gòu)中存在DNA 結(jié)合序列（MPIANVI），證明CsLEC1 可以起到轉(zhuǎn)錄激活作用。LEE 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥AtLEC1 的氨基酸序列中第55 位是天冬氨酸，該殘基被證明是LEC1蛋白中B 結(jié)構(gòu)域內(nèi)的重要功能位點(diǎn)，參與調(diào)控種子胚胎發(fā)育過(guò)程。從多序列比對(duì)結(jié)果可以看出，亞麻薺CsLEC1 在對(duì)應(yīng)位置也存在天冬氨酸殘基，推測(cè)這3 個(gè)CsLEC1 蛋白具有與擬南芥AtLEC1 蛋白有相似的功能。亞麻薺CsLEC1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)均與擬南芥AtLEC1 蛋白相似，三級(jí)結(jié)構(gòu)中還可以明顯地看到與多序列比對(duì)結(jié)果相同的5 個(gè)組蛋白折疊基序。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，亞麻薺CsLEC1與擬南芥AtLEC2、甘藍(lán)型油菜BnLEC1 同源性較高，可能其具有相同的功能。

LOTAN 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtLEC1基因在種子中特異表達(dá)。文冠果XsLEC1基因在文冠果的根、莖、葉及花中均無(wú)表達(dá)，在種子中具有較高的表達(dá)，且是在種胚發(fā)育的前期表達(dá)量最高[23]。本研究表明，實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，亞麻薺CsLEC1在開(kāi)花后10～20 d 的種子中高表達(dá)，在開(kāi)花后20 d的表達(dá)量達(dá)到最高；隨著種子發(fā)育成熟，CsLEC1表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，至種子發(fā)育晚期停止表達(dá)。因此，推測(cè)CsLEC1基因參與了亞麻薺種子的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。研究表明，擬南芥中過(guò)表達(dá)LEC1可以激活油脂相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FUS3、ABI3、WRI1的表達(dá)[12]。為此，推測(cè)該基因在種子發(fā)育早期過(guò)程中參與了種子油脂的合成，在CsLEC1高表達(dá)的同時(shí)激活了下游基因的表達(dá)，并參與種子油脂的合成。在擬南芥中，過(guò)表達(dá)LEC1基因可以使TAG 的含量增加，同時(shí)也會(huì)上調(diào)FAD2基因的表達(dá)量[24]。FAD2可以將油酸合成亞油酸，是亞油酸合成的關(guān)鍵酶[25]。而亞油酸是合成α- 亞麻酸的重要底物，因此，通過(guò)對(duì)CsLEC1基因的深入研究將有助于提高亞麻薺中α- 亞麻酸的含量。

本研究鑒定得到3 個(gè)CsLEC1基因，編碼蛋白均含有“α1-L1-Asp-α2-L2-α3”結(jié)構(gòu)域，為HAP3亞基的B 結(jié)構(gòu)域，Asp 是LEC1 的功能位點(diǎn)；在開(kāi)花后20 d 的種子中表達(dá)量最高。說(shuō)明CsLEC1基因可能參與調(diào)控胚胎發(fā)育，而其與脂肪酸成分和含量的相關(guān)性以及油脂合成通路中的具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。