酶與微生態(tài)復合組劑對小鼠生長性能、血液指標及腸道MUC2 表達的影響

裴 婷，孔佳美，白培鈿，楊逢清，李 濤，張瑞杰，任玉紅

（山西農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西太谷030801）

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，抗生素被作為飼料添加劑廣泛應用于疾病防治、營養(yǎng)水平提升、養(yǎng)殖改善等各個方面[1]，但是由于經濟效益的驅使和監(jiān)督管理不嚴，出現了抗生素、喹乙醇、喹諾酮等藥物的濫用，造成大腸桿菌、沙門氏菌等細菌產生耐藥性，使得藥物療效大大降低甚至沒有效果，這些藥物也會在畜禽產品中大量殘留，會直接影響食品安全和危害人類健康，因此，無抗養(yǎng)殖的呼聲越來越高[2]。我國農業(yè)農村部于2017 年6 月發(fā)布《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃（2017—2020 年）》的通知，要求我國于2020 年起全面禁止人獸共用抗菌藥物或易產生交叉耐藥性的抗菌藥物作為動物促生長劑應用于動物生產中[3]。找到抗生素替代品、控制抗生素的使用量成為當前要解決的重要課題。酶制劑[4]、益生菌[5]、復方中草藥[6]等抗生素替代品在養(yǎng)殖場的應用，已成為禽畜養(yǎng)殖的發(fā)展趨勢。大量試驗表明，酶制劑具有降解抗營養(yǎng)因子、補充內源酶、解離金屬元素、增強機體免疫力等作用[7]；益生菌則能夠調節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡、增強機體免疫力等功能[8]。二者聯合使用時能夠進一步改善動物機體健康，提高飼料利用率，從而達到更加理想的生產應用效果[9]。

腸道黏膜免疫系統(tǒng)是腸道屏障的重要組成部分，與腸道上皮細胞相互作用、相互影響，保護小腸不受細菌、病毒等微生物的侵襲和侵害，防止小腸對外來有害物質的吸收，起到機體第一道防線的作用[10]。腸道MUC2 是構成腸道黏液層的主要成分，主要是由杯狀細胞分泌的高分子糖蛋白，在組織和血液中還有細胞粘附、參與淋巴細胞循環(huán)、參與細胞間通訊和信息傳遞、維持細胞的極性、參與抗原呈遞和淋巴細胞活化作用等[11-12]。檢測腸道黏膜MUC2 的表達量能評估機體的腸道黏膜免疫功能。

山西農業(yè)大學動物醫(yī)學學院微生物實驗室科研團隊自主研發(fā)的酶與微生態(tài)制劑復合組劑由中性蛋白酶、纖維素酶、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌、嗜酸乳桿菌組成。本試驗通過對小鼠灌胃不同劑量的復合組劑，觀察試驗小鼠的生長性能，了解酶與微生態(tài)制劑復合組劑對小鼠生長狀況的影響；測定血液指標，評估酶與微生態(tài)制劑復合組劑對小鼠健康狀況的影響；采用免疫組化和熒光定量PCR 法測定小鼠空腸和回腸黏膜MUC2 表達量和表達水平，了解復合組劑對腸道黏膜免疫的影響，為酶與微生態(tài)制劑復合組劑在畜禽生產中的應用提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

BALB/C 小鼠，購自太谷青牧養(yǎng)殖有限公司，許可證號：SCXK（晉）2019—0005。酶與微生態(tài)制劑的復合組劑由山西農業(yè)大學動物醫(yī)學學院實驗室自行研制（未申請專利）。

MRS 固體培養(yǎng)基、LB 固體培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基（索萊寶）；Trizol（美國life）；反轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒（TAKARA），MUC2 抗體（武漢三鷹）；免疫組化試劑盒（康為世紀）等。

1.2 設備

Chemray 800 全自動生化分析儀為深圳雷杜生命科技產品；BC-2800vet 全自動血液細胞分析儀為邁瑞產品；石蠟切片機、石蠟包埋機、攤片機、顯微鏡為德國Leica 公司產品；定量PCR 檢測儀。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與飼養(yǎng) 選取48 只的28 日齡BALB/C 小鼠，雌雄各半，體質量為（16±2）g，適應性飼養(yǎng)7 d 后，按照隨機分組原則分為4 組，每組雌雄各6 只，分別為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。對照組灌胃0.2 mL 無菌蒸餾水，低、中、高劑量組分別以2.5、5、10 g/kg 灌胃酶與微生態(tài)制劑復合組劑持續(xù)灌胃28 d。試驗期間同室分籠喂養(yǎng)，自由采光和飲水。

1.3.2 生長性能測定 試驗期間觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、被毛光澤度情況，每隔7 d 對小鼠進行稱質量并記錄。

1.3.3 血液指標檢測 28 d 后禁食12 h，摘取小鼠眼球采血，部分置于EDTA 抗凝管內收集全血，用于血液生理指標檢測；部分置于非抗凝采血管內，血液靜置2 h 或4 ℃過夜，凝結后以3 000 r/min 離心10 min，取血清，放置-80 ℃保存，用于全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、血尿素氮和肌酐含量。

1.3.4 免疫組化檢測MUC2 含量 28 d 后禁食12 h，頸椎脫臼處死小鼠，進行解剖檢查，取空腸、回腸組織固定于4%的多聚甲醛溶液中，沖水，脫水，石蠟包埋，切片。組織切片進行脫蠟，并用檸檬酸鈉抗原修復液進行高溫修復，應用免疫組化試劑盒進行一抗和二抗的孵育，DAB 顯色，蘇木精染色，0.1%鹽酸酒精分化，自來水和0.1%氨水返藍，組織切片進行梯度酒精脫水，封片。用光學顯微鏡觀察，是否出現棕黃色顆粒，有棕黃色顆粒為陽性。并隨機選取5 個視野，通過Image J18.0 軟件進行圖像分析MUC2 含量。

1.3.5 腸道黏膜MUC2 mRNA 相對表達量的測定將小鼠的空腸和回腸組織用液氮處理，用trizol 法進行總RNA 的提取。按照反轉錄試劑盒說明書進行RNA 的反轉錄獲取cDNA，進行熒光定量PCR。根據NCBI 上基因數據庫查找目的基因MUC2 以及內參GAPDH 相對應的基因序列，運用Primer 5.0軟件設計各基因的上下游引物（表1）。PCR 反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。

表1 引物序列

1.4 數據處理

使用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行數據處理，并采用單因素分析進行統(tǒng)計分析及顯著性檢驗。試驗數據以平均值±標準差表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 酶與微生態(tài)制劑復合組劑對小鼠生長性能的影響

小鼠灌胃酶與微生態(tài)制劑復合組劑后精神狀態(tài)無異常，生長狀況良好，呼吸正常，體質量增加，被毛有光澤。用不同劑量的復合組劑灌胃小鼠后，體質量變化如表2 所示。從表2 可以看出，小鼠在灌胃不同劑量的酶與微生態(tài)制劑復合組劑后，7、14 d，各組小鼠體質量均有所增加，但無顯著差異性（P＞0.05）；在21 d，中劑量組和高劑量組的小鼠體質量增加明顯，差異顯著（P＜0.05），低劑量組的小鼠體質量無顯著差異性（P＞0.05）；28 d 時，各試驗組的小鼠體質量明顯增加，差異性顯著（P＜0.05）。

表2 各組小鼠體質量結果比較 g

2.2 酶與微生態(tài)制劑復合組劑對小鼠血液指標的影響

由表3 可知，試驗組和對照組的血常規(guī)指標均在正常范圍內。其中，灌胃中劑量和高劑量的試驗組小鼠白細胞總數及淋巴細胞數均比對照組高，且差異顯著（P＜0.05）。由表4 可知，試驗組和對照組的丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、血尿素氮和肌酐的生化檢查結果均在正常范圍內，且無明顯差異（P＞0.05）。

表3 各組小鼠血常規(guī)結果比較

表4 各組小鼠血清生化指標結果比較

2.3 酶與微生態(tài)制劑復合組劑對腸黏膜MUC2 表達水平的影響

免疫組化結果如圖1、2 所示，對照組和各試驗組空腸和回腸黏膜表面均有MUC2 的表達，與對照組相比，各試驗組腸道黏膜表面MUC2 的表達量增高。通過Image J18.0 軟件進行圖像分析MUC2 含量，結果如圖3、4 所示，與對照組相比，灌胃低劑量復合組劑的空腸黏膜表面MUC2 表達量增加，且差異顯著（P＜0.05），低劑量復合組劑的回腸黏膜表面MUC2 表達量無明顯差異（P＞0.05）；灌胃中劑量復合組劑小鼠的空腸和回腸黏膜表面MUC2 表達量增加，且差異均極顯著（P＜0.01）；灌胃高劑量復合組劑小鼠的空腸和回腸黏膜MUC2 表達量增加，且差異均顯著（P＜0.05）。

2.4 酶與微生態(tài)制劑復合組劑對腸黏膜MUC2 mRNA 表達水平的影響

熒光定量PCR 結果顯示（圖5、6），灌胃酶與微生態(tài)制劑復合組劑小鼠的腸道黏膜MUC2 mRNA表達水平不同程度高于對照組。與對照組相比，低劑量組小鼠空腸和回腸的MUC2 mRNA 表達水平增加，差異達顯著水平（P＜0.05）；中劑量組空腸和回腸MUC2 mRNA 表達水平增加，差異達極顯著水平（P＜0.01）；高劑量組小鼠空腸MUC2 mRNA 表達水平增加，差異達顯著水平（P＜0.05），回腸mRNA 表達水平增加，差異達極顯著水平（P＜0.01）。

3 結論與討論

近年來，人們對替代抗生素產品的研究日益深入，酶制劑和微生態(tài)制劑的應用逐漸成為發(fā)展趨勢，也日益受到重視。本研究表明，酶與微生態(tài)制劑復合組劑作為新型飼料添加劑對小鼠生長具有促進作用，這是由于復合組劑是由益生菌和酶制劑復合而成。益生菌能夠增加動物小腸的黏膜皺裂，增加絨毛長度，加深陷窩深度，使小腸吸收面積增大，促進營養(yǎng)的吸收，也能夠提供動物生長發(fā)育所必需的部分營養(yǎng)物質、酶及調節(jié)因子，促進動物生長[13-14]。酶制劑能消除飼料中抗營養(yǎng)因子或有害物質，提高飼料的營養(yǎng)，同時能補充內源性消化酶的不足，促進消化吸收[15-16]。兩者共同作用可以促進飼料在小鼠體內的消化與吸收，促進小鼠生長，提高其生長性能。

血常規(guī)和血清生化指標檢查可以反映動物機體的健康水平，用于評估機體的健康狀況[17-20]。丙氨酸氨基轉移酶和天門冬氨酸氨基轉移酶是參與氨基酸代謝的酶，是肝臟功能損傷最敏感的檢測指標，它常出現于形態(tài)學發(fā)生變化之前[21]。肌酐、血尿素氮是判定腎臟是否損傷的重要指標，可判斷腎功能是否正常[22]。本試驗表明，小鼠灌胃28 d 后，各組小鼠的血常規(guī)和血清生化指標均在正常范圍內，表明酶與微生態(tài)制劑復合組劑不會引起小鼠肝腎功能損傷。白細胞不僅參與機體的非特異性免疫，還參與機體的特異性免疫，具有強大的吞噬能力和免疫功能[23-24]。血液中淋巴細胞是由淋巴結、脾臟等淋巴組織釋放而來，具有保護機體的作用。田其真等[25]給健康犬連續(xù)口服28 d 唾液乳酸桿菌TCSL1 后，犬的淋巴細胞數、紅細胞數顯著增加，白細胞數、單核細胞數和血紅蛋白含量相對升高，表明口服唾液乳酸桿菌TCSL1 能增強犬的免疫功能。本試驗表明，中劑量組的白細胞和淋巴細胞數量顯著高于低劑量組和高劑量組，高劑量組比低劑量組的值略高，說明酶與微生態(tài)制劑復合組劑具有增強免疫和抵抗感染的作用。

MUC2 可在腸道的表面形成一層黏液層，起到潤滑和拮抗致病菌的腸道粘附和侵襲的作用[26]。微生物及其代謝產物可以影響MUC2 的合成與分泌，調節(jié)MUC2 的生成，如牙雙歧桿菌可通過刺激杯狀細胞自噬來調節(jié)黏液的合成并上調MUC2 黏蛋白的分泌[27]。ROKANA 等[28]研究發(fā)現，益生菌可以與腸細胞表面的Toll 樣受體4（TLR4）結合，通過MyD88 途徑刺激NF-κB，從而上調MUC2 黏蛋白的表達。本試驗表明，不同劑量的復合組劑均能增加空腸和回腸中MUC2 含量，提示酶與微生態(tài)制劑復合組劑能通過增加MUC2 蛋白含量來加強腸道的黏液屏障，提高機體對致病菌的防御作用。

黏液蛋白的合成和分泌依賴于其mRNA 的表達，本試驗應用熒光定量PCR 對不同處理的小鼠空腸和回腸段MUC2 的mRNA 的相對表達量進行了評價。本試驗結果表明，試驗組中空腸和回腸內MUC2 mRNA 的表達量比對照組高，且中劑量組的表達量最高，這與免疫組織化學法檢測的空腸和回腸內蛋白含量結果基本一致，揭示酶與微生態(tài)制劑復合組劑能夠提高腸道內MUC2 mRNA 的表達，并且促進黏蛋白MUC2 的合成和分泌。

綜上所述，酶與微生態(tài)制劑復合組劑對實驗小鼠的生長具有促進作用；能提高血液中白細胞和淋巴細胞的數量，增加機體的抵抗力；能夠增加腸道MUC2 的含量和mRNA 表達量，增強腸道屏障功能，可為酶與微生態(tài)制劑復合組劑在養(yǎng)殖生產中的應用提供參考。