正交試驗優(yōu)化好食脈孢菌類胡蘿卜素提取工藝

衛(wèi) 陽，楊繼業(yè)，陳書明，張希春，張 瑜，陳亞偉，封健健,鮑琳杰

（1.山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西太谷030801；2.山西省畜牧遺傳育種中心，山西太原030027；3.山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院，山西晉中030619）

由于類胡蘿卜素具有維生素A 原活性、抗氧化、提高免疫力、著色等多種生理功能[1]，故被廣泛用于食品、飼料、化妝品等行業(yè)[2]。由瑞士Roche 公司和德國BASF 公司提供的化學合成產(chǎn)品占全球近80%類胡蘿卜素市場份額[3]，而部分化學合成的部分類胡蘿卜素已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)有害，受到人們的抵制[4-5]，天然類胡蘿卜素更加受人們青睞。天然類胡蘿卜素主要源于植物提取和微生物提取，植物提取受季節(jié)因素影響大，規(guī)模生產(chǎn)受限制；而微生物提取則由于對營養(yǎng)要求低、條件易控、周期短等優(yōu)點而擁有更為廣闊的市場前景，越來越受到研究者的關(guān)注。

脈孢菌為絲狀真菌屬，其分生孢子內(nèi)均蘊含大量類胡蘿卜素[6-8]，PRIATNI[9]對脈孢菌屬產(chǎn)類胡蘿卜素的前景進行了展望。好食脈孢菌作為FDA 認證的可食用安全菌種，由于其孢子內(nèi)富含類胡蘿卜素，生長速度快[10]，已被廣泛用于生產(chǎn)類胡蘿卜素的應(yīng)用研究[11]。但由于好食脈孢菌所產(chǎn)類胡蘿卜素主要存在于孢子內(nèi)[12]，而孢子具有極難裂解的孢子壁，使得類胡蘿卜素很難被釋放；因此，提高孢子內(nèi)類胡蘿卜素的釋放率，尋求高效率的類胡蘿卜素提取方法，對其規(guī)?；a(chǎn)至關(guān)重要。

由于類胡蘿卜素存在于微生物不同的部位，因此，類胡蘿卜素的提取方法有所差異。目前，浸提法、研磨法、酶反應(yīng)法、超聲波提取法和酸熱破壁法等是類胡蘿卜素的常見提取方法。其中，浸提法、研磨法和超聲波提取法對好食脈孢菌孢子中類胡蘿卜素提取效果較差；酶反應(yīng)法雖然可以較好地提取類胡蘿卜素，但成本高；而酸熱破壁法不僅提取效果較好，成本低，且采用酸熱破壁法提取好食脈孢菌孢子內(nèi)類胡蘿卜素的引用較廣泛[13]，但是酸熱破壁過程中酸濃度、用量及熱處理時間不一致，導(dǎo)致類胡蘿卜素提取量差異較大。

為了提高好食脈孢菌孢子內(nèi)類胡蘿卜素提取量，本試驗對酸熱破壁法提取類胡蘿卜素工藝中的鹽酸濃度、鹽酸用量、振蕩時間和沸水浴時間分別進行了單因素試驗，通過正交試驗優(yōu)化出高效提取好食脈孢菌孢子內(nèi)類胡蘿卜素的工藝。

1 材料和方法

1.1 材料

好食脈孢菌（Neurospora sitophila），山西農(nóng)業(yè)大學發(fā)酵工程實驗室保存。玉米秸稈由山西農(nóng)業(yè)大學國家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系飼料資源崗位試驗基地提供。

瓊脂粉、蛋白胨均購自Solarbio，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 好食脈孢菌菌種活化與液體種子液制備

1.2.1.1 菌種活化 挑取PDA 固體斜面培養(yǎng)基[14]上的好食脈孢菌孢子分散于20.0 μL 無菌水中，用接種環(huán)劃線接種至PDA 固體培養(yǎng)基，于29.0 ℃、濕度70.0%培養(yǎng)4 d，備用。

1.2.1.2 液體種子液制備 取活化后的好食脈孢菌孢子分散于無菌水（1.4×106cfu/mL）中，按1/50 接種量接種至液體種子培養(yǎng)基[14]，于29.0 ℃、200 r/min培養(yǎng)2 d，即為液體種子液。

1.2.2 好食脈孢菌發(fā)酵玉米秸稈獲得好食脈孢菌孢子 取干燥揉絲玉米秸稈10.0 g 放于1.0 L 燒杯，加27.0 mL 蒸餾水，攪拌均勻，121 ℃滅菌20.0 min，于超凈工作臺中冷卻，備用。接種好食脈孢菌種子液3.0 mL，攪拌均勻，于29.0 ℃、濕度70.0%培養(yǎng)箱中發(fā)酵96.0 h，取出發(fā)酵產(chǎn)物，加入蒸餾水充分攪拌洗滌，4 層紗布過濾并收集濾液，5 000 r/min 離心10.0 min，棄上清，沉淀（好食脈孢菌孢子粗品）在通風處晾干、稱質(zhì)量，備用。

1.2.3 好食脈孢菌孢子類胡蘿卜素提取工藝優(yōu)化好食脈孢菌孢子中類胡蘿卜素的提取采用鹽酸熱破壁法。稱取10.0 mg 好食脈孢菌孢子，置于50.0 mL離心管，加入10.0 mL 鹽酸（3.0 mol/L），恒溫振蕩（25 ℃，100 r/min）45.0 min，再將離心管置于沸水中（擰松離心管蓋子）進行沸水浴10.0 min，迅速置于冰水冷卻，并調(diào)節(jié)酸解液pH 值至7.0，4 500 r/min離心10.0 min，棄上清，沉淀即為破壁的好食脈孢菌孢子，加入丙酮充分浸提，離心（4 500 r/min，10.0 min），收集上清液，重復(fù)丙酮浸提步驟，直至提取液為無色時，結(jié)束浸提，合并丙酮提取液并記錄體積。類胡蘿卜素提取量計算公式參考文獻[14]。

為了優(yōu)化酸熱破壁法提取好食脈孢菌孢子類胡蘿卜素的工藝，首先對影響類胡蘿卜素提取量的4 個因素（鹽酸濃度、鹽酸用量、振蕩時間、沸水浴時間）進行單因素試驗，單因素試驗水平如表1 所示。鹽酸濃度單因素試驗中其他因素參數(shù)為：鹽酸用量1.0 mL/mg，振蕩30 min，沸水浴時間10 min；鹽酸用量單因素試驗中其他因素參數(shù)為：鹽酸濃度3.0mol/L，振蕩30 min，沸水浴時間10 min；振蕩時間單因素試驗中其他因素參數(shù)為：鹽酸濃度3.0 mol/L，鹽酸用量1.0 mL/mg，沸水浴時間10 min；沸水浴時間單因素試驗中其他因素參數(shù)為：鹽酸濃度3.0 mol/L，鹽酸用量1.0 mL/mg，振蕩30 min。單因素試驗中好食脈孢菌孢子量均為10.0 mg，丙酮用量均為20.0 mL。然后采用4 因素、3 水平正交試驗（表2）優(yōu)化好食脈孢菌孢子類胡蘿卜素提取工藝。

為了檢驗優(yōu)化結(jié)果的有效性，對優(yōu)化結(jié)果進行驗證試驗，即在優(yōu)化結(jié)果參數(shù)下，對好食脈孢菌孢子進行破壁，并測定類胡蘿卜素提取量，同時統(tǒng)計所有試驗結(jié)果，若驗證試驗結(jié)果均高于其余各試驗組結(jié)果，則說明優(yōu)化結(jié)果有效。

表1 好食脈孢菌孢子類胡蘿卜素提取單因素試驗

表2 好食脈孢菌孢子類胡蘿卜素提取正交試驗因素水平

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多重比較及獨立樣本t檢驗，Graph Pad Prism 5.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素提取單因素試驗結(jié)果

從圖1 可以看出，酸熱破壁時，隨鹽酸濃度、鹽酸用量、振蕩時間以及沸水浴時間的增大，類胡蘿卜素的提取量均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，當鹽酸濃度為1.0 mol/L，鹽酸用量為0.3 mL/mg 時，振蕩時間為30 min 時，類胡蘿卜素提取量分別為最大值，且分別與臨近檢測點差異顯著（P＜0.05）。從圖1 還可以看出，酸熱破壁時，隨著沸水浴時間的延長，類胡蘿卜素的提取量呈現(xiàn)逐漸上升后緩慢下降的變化趨勢，沸水浴8、9 min 時，提取量最大差異不顯著（P＞0.05），但是均顯著高于7、10 min 的提取量（P＜0.05）。

2.2 正交試驗

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取了鹽酸濃度、鹽酸用量、振蕩時間、沸水浴時間4 個因素的3 個水平（表2），并設(shè)計L9（34）正交試驗（表3）。

從表3 可以看出，在酸熱破壁法提取類胡蘿卜素過程中，由4 個因素的極差R 值大?。≧ 值越大，影響越大）可知，影響因素從大到小排序為B＞A＞D＞C，即鹽酸用量＞鹽酸濃度＞沸水時間＞振蕩時間。因此，最優(yōu)工藝為A2B2C2D3，即鹽酸濃度1.0mol/L、鹽酸用量0.3 mL/mg、振蕩時間為30 min、沸水浴時間8 min。

表3 類胡蘿卜素提取的正交試驗結(jié)果L9（34）

2.3 驗證試驗

從表3 可以看出，類胡蘿卜素提取量最大為11.3 mg/g，試驗組合為A2B2C3D1。由于最優(yōu)水平（A2B2C2D3）沒有出現(xiàn)在正交表中，故對其進行驗證試驗。通過試驗驗證優(yōu)水平A2B2C2D3，得出類胡蘿卜素提取量為（11.4±0.6）mg/g，此結(jié)果高于表3正交試驗中所有組合試驗結(jié)果，因此，最優(yōu)組合驗證成功，即酸熱破壁工藝參數(shù)組合為鹽酸濃度1.0 mol/L、鹽酸用量0.3 mL/mg、振蕩時間30 min、沸水浴時間9 min。

2.4 工藝優(yōu)化前后好食脈孢菌孢子類胡蘿卜素提取量的比較

工藝優(yōu)化前類胡蘿卜素提取主要工藝參數(shù)是：鹽酸濃度3.0 mol/L、鹽酸用量1 mL/mg、振蕩時間45 min、沸水浴時間10 min，類胡蘿卜素提取量為（9.3±0.5）mg/g。工藝優(yōu)化后類胡蘿卜素提取主要工藝參數(shù)是：鹽酸濃度1.0 mol/L、鹽酸用量0.3 mL/mg、振蕩時間30 min、沸水浴時間9 min，類胡蘿卜素提取量為（11.4±0.6）mg/g，比工藝優(yōu)化前提高了22.6%（P＜0.01）。

3 結(jié)論與討論

類胡蘿卜素是脂溶性萜類化合物，可以根據(jù)相似相溶原理，使色素溶解在極性相近的有機溶劑中[15]，再用紫外分光光度法對其含量進行測定[16]。但是，其孢子壁結(jié)構(gòu)緊密，難以裂解[17]，類胡蘿卜素難以釋放。提取類胡蘿卜素方法多樣[18]，但采用酸熱破壁法和有機溶劑浸提法的應(yīng)用最為廣泛[19]，其中，大多選用鹽酸結(jié)合熱處理，但是鹽酸濃度以及熱處理時間不統(tǒng)一[20-21]，使得類胡蘿卜素提取量差異較大。劉志剛[12]對粗糙脈孢菌孢子中類胡蘿卜素采用不同方法提取，發(fā)現(xiàn)酸熱法提取率最高，并用響應(yīng)面法對其進行優(yōu)化得到最優(yōu)提取工藝，使類胡蘿卜素提取量提高。本試驗為了提高好食脈孢菌孢子類胡蘿卜素提取量，針對鹽酸濃度、鹽酸用量、振蕩時間以及沸水浴時間分別進行單因素試驗，并通過正交試驗對上述4 因素進行組合試驗，以期優(yōu)化出最優(yōu)組合。對于提取劑的選取，山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院發(fā)酵工程課題組通過對不同有機溶劑進行篩選，發(fā)現(xiàn)丙酮作為提取劑時，提取劑用量少，并且提取徹底，因此，選用丙酮進行后續(xù)提取劑。本試驗最終得到好食脈孢菌類胡蘿卜素提取最優(yōu)組合為鹽酸濃度1.0 mol/L、鹽酸用量0.3 mL/mg、振蕩時間30 min、沸水浴時間9 min，在該組合條件下，類胡蘿卜素提取量最高為（11.4±0.6）mg/g，與優(yōu)化前類胡蘿卜素提取量（（9.3±0.5）mg/g）相比，顯著提高了22.6%（P＜0.01），為工業(yè)化提取好食脈孢菌孢子中類胡蘿卜素提供了工藝參考。

本試驗優(yōu)化后的方法提高了類胡蘿卜素的提取量，降低了鹽酸濃度[21]，既減少了鹽酸用量又節(jié)約了振蕩和沸水浴時間，大大提高了類胡蘿卜素的提取量和提取效率。

本試驗酸解選用鹽酸，雖然優(yōu)化后類胡蘿卜素提取量提高，但分析認為，由于鹽酸酸性強，對釋放出的類胡蘿卜素會造成破壞，對提取出的類胡蘿卜素活性有不利影響。因此，為了保護類胡蘿卜素在提取過程中不被損耗，更為優(yōu)質(zhì)的提取方法還有待探索；且弱酸、弱堿或者其他更好的處理方法裂解孢子壁，并最大程度地減小由于破壁因素對類胡蘿卜素造成不利影響的研究鮮有報道。因此，山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院發(fā)酵工程課題組將探討弱酸、弱堿或其他破壁方法對好食脈孢菌孢子的破壁效果，以期優(yōu)化出綠色環(huán)保的好食脈孢菌孢子破壁方法，提高類胡蘿卜素提取量，為工業(yè)化生產(chǎn)提供工藝參考。