花生籽仁抗黃曲霉菌生理生化機(jī)制研究進(jìn)展

柴芃沛，韓鎖義，崔夢(mèng)杰，郭俊佳，黃冰艷，董文召，張新友

（河南省作物分子育種研究院/鄭州大學(xué)研究生培訓(xùn)和科研基地/國(guó)家生物育種產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè)部黃淮海油料作物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省油料作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002）

0 引言

花生(ArachishypogaeaL.)含有大量的油脂和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在食用植物油和休閑食品消費(fèi)中占有舉足輕重的地位[1-2]。受到黃曲霉菌侵染的花生會(huì)在籽仁中產(chǎn)生強(qiáng)致癌性的黃曲霉毒素，能夠誘導(dǎo)突變，抑制免疫功能，引起肝臟疾病甚至急性中毒，是目前自然界中已知的對(duì)人類健康危害最大的生物毒素之一，影響花生的食用安全，嚴(yán)重危害人類健康[3-5]。截止目前，已經(jīng)鑒定出20余種黃曲霉毒素的同分異構(gòu)體，最為常見(jiàn)的有 B1、B2、G1、G2四種，其中黃曲霉毒素 B1是分布最廣，毒性最強(qiáng)的，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)定為一級(jí)致癌物質(zhì)，也常被用作檢測(cè)糧食及各種糧制品中黃曲霉毒素含量的重要指標(biāo)[6]。黃曲霉毒素是由黃曲霉(A.flavus)等曲霉屬真菌產(chǎn)生的一類含二氫呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)拇渭?jí)代謝產(chǎn)物，黃曲霉菌(AspergillusflavusL.)是一種常見(jiàn)的兼性腐生真菌，廣泛存在于土壤、空氣以及發(fā)霉的糧制品中。黃曲霉菌在土壤中以菌核及分生孢子的形式存在，在植物細(xì)胞中以菌絲的形式存在。菌核能夠抵御不良生態(tài)環(huán)境，在高溫或干旱等惡劣環(huán)境條件下存活；當(dāng)條件適當(dāng)時(shí)，菌核能夠產(chǎn)生大量分生孢子或子囊孢子，起到傳播和再侵染的作用[7]。

花生由于其地上開(kāi)花、地下結(jié)果的特性，花生莢果長(zhǎng)期與土壤微生物接觸，在受到干旱等不良環(huán)境或被地下害蟲(chóng)蠐螬、白蟻等侵襲時(shí)，極易受到黃曲霉毒素的污染。近年來(lái)，隨著花生種植面積的不斷擴(kuò)大，這一風(fēng)險(xiǎn)在局部地區(qū)進(jìn)一步增加。同時(shí)，花生產(chǎn)后干燥、儲(chǔ)存、運(yùn)輸及加工等各個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)的任何過(guò)程都有受到黃曲霉毒素污染的可能[8-9]。

由于黃曲霉毒素危害的嚴(yán)重性，世界各國(guó)對(duì)此非常重視，在農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易中黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)也很嚴(yán)格。多國(guó)已設(shè)立黃曲霉毒素最大殘留限量，其中歐盟的標(biāo)準(zhǔn)最為嚴(yán)格，要求花生及其制品中AFB1的含量不超過(guò)2 μg/kg，黃曲霉毒素總含量不超過(guò)4 μg/kg[10]。黃曲霉毒素污染的因素有很多，可以通過(guò)在花生生長(zhǎng)后期防治干旱脅迫、收獲后快速干燥等方法進(jìn)行防治，但是依然不能完全控制黃曲霉毒素污染問(wèn)題的發(fā)生[11]。因此，培育和大面積推廣能夠抵抗黃曲霉菌侵染和抑制毒素產(chǎn)生的花生品種是解決花生黃曲霉毒素污染問(wèn)題的理想途徑，在品種創(chuàng)制的基礎(chǔ)研究中，花生抵御黃曲霉菌侵染和產(chǎn)毒的生理生化機(jī)制是重要內(nèi)容。本文主要針對(duì)花生籽仁在抗黃曲霉菌侵染及產(chǎn)毒過(guò)程中生理生化物質(zhì)的變化情況，對(duì)花生抗黃曲霉菌侵染和產(chǎn)毒的機(jī)制予以討論，旨在為未來(lái)花生籽仁抗黃曲霉菌侵染研究指明方向。

1 花生籽仁中抵抗黃曲霉侵染和產(chǎn)毒的物質(zhì)

花生籽仁中抵抗黃曲霉侵染和產(chǎn)毒的物質(zhì)從化學(xué)組成上，可以大體分為兩類：植物多酚和抗菌蛋白。其中多酚類物質(zhì)包括白藜蘆醇、單寧、類黃酮等，抗菌蛋白包括病程相關(guān)蛋白、防御素、2S清蛋白、蛋白酶抑制劑、熱激蛋白、溶蛋白等。

1.1 多酚類物質(zhì)

多酚類物質(zhì)廣泛存在于各種植物當(dāng)中，并且很多都具有抗菌作用。研究表明，多酚類物質(zhì)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞色素P450的功能來(lái)抑制AFB1-DNA加合物的形成[12]。從花生籽仁中提取出的總多酚類物質(zhì)也能夠抑制黃曲霉菌的生長(zhǎng)和黃曲霉毒素的合成[13]。

1.1.1 白藜蘆醇 白藜蘆醇(Resveratrol)化學(xué)名為3,5,4’-三羥基-反-二苯乙烯(3,5,4-trihydroxysitlbene)，是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物[14]。白藜蘆醇及其衍生物具有抗菌、抗癌、調(diào)節(jié)人體代謝等多種功能。在植物中，其還具有抗真菌的生物學(xué)特性，是一種重要的植物抗毒素。研究認(rèn)為，白藜蘆醇是花生受到黃曲霉菌侵染時(shí)產(chǎn)生的一種主動(dòng)抗性物質(zhì)，其誘導(dǎo)生成的速度與花生籽仁的抗性相關(guān)，并以此提出花生接種黃曲霉菌后白藜蘆醇及其衍生物的含量可以作為篩選花生抗黃曲霉品種的重要生化指標(biāo)[15]。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)花生種子中白藜蘆醇含量與抗產(chǎn)毒水平呈顯著正相關(guān)，而且在培養(yǎng)基條件下白藜蘆醇對(duì)黃曲霉毒素的生物合成具有顯著抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能抑制黃曲霉毒素合成基因簇中的關(guān)鍵基因aflR的表達(dá)，從而抑制黃曲霉毒素的合成[17]。以白藜蘆醇為基本單元氧化合成的聚合體稱為其衍生物或芪化物。除白藜蘆醇外，花生種子中還含有種類豐富的芪化物，目前，從被黃曲霉菌侵染的花生種子當(dāng)中已經(jīng)分離出20余種，其中很多都具有與白藜蘆醇相似的生物學(xué)特性，具有抑制黃曲霉菌分生孢子的產(chǎn)生和黃曲霉毒素合成的生物功能[18-21]。

1.1.2 單寧 單寧又稱單寧酸或鞣質(zhì)、植物鞣質(zhì)，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚化合物。植物單寧具有抗菌和抗氧化功能，并且被認(rèn)為其具有預(yù)防癌癥的功能[22]。單寧對(duì)多種微生物都是有毒的，它能有效地抵抗細(xì)菌對(duì)植物的侵染，也能抑制大多數(shù)真菌的繁殖[23-25]。從高粱中分離獲得的單寧可以顯著抑制細(xì)菌、霉菌、酵母菌的生長(zhǎng)[26]。此外，研究表明單寧對(duì)不同真菌的抑制具有不同的機(jī)制，可以通過(guò)抑制真菌纖維素酶和果膠酶的活性來(lái)抵抗真菌對(duì)植物的侵染[27]，也可以通過(guò)破壞微生物的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)抑制微生物侵染[28]。目前已有研究證明指狀青霉細(xì)胞壁上存在單寧酸的作用位點(diǎn)[29]?；ㄉt衣中含有數(shù)量可觀的單寧[30]，從而使其具有抗菌和抗氧化的功能。從花生紅衣和子葉中提取的粗單寧可以有效抑制黃曲霉分生孢子的形成[31-32]。并且，花生單寧不止與黃曲霉菌在花生籽仁中的定殖相關(guān)，而且還能抑制寄生曲霉菌中黃曲霉毒素的合成[33]。

1.1.3 類黃酮 黃酮類化合物是一類重要的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，也是一種天然色素，因多呈黃色而被稱為生物類黃酮。至今已發(fā)現(xiàn)近萬(wàn)種類黃酮物質(zhì)，幾乎存在于所有具有維管的植物中[34]。植物類黃酮具有抗菌和抗氧化等活性，還能在體外抑制黃曲霉毒素的毒性[35]。在植物體內(nèi)，類黃酮物質(zhì)可能參與激素、活性氧、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[36]，并且可以參與到植物與病原體的互作中[37]。研究表明，類黃酮物質(zhì)的合成受到WRKY轉(zhuǎn)錄因子的刺激，在抗感品種中存在一定差異[38]，在玉米中，WRKY基因家族也是抵抗黃曲霉侵染的重要部分[39]。但花生受到黃曲霉菌侵染時(shí)，WRKY基因家族的大部分成員的表達(dá)量也會(huì)迅速上調(diào)[40]。很多類黃酮物質(zhì)都具有抗真菌的特性，例如山柰酚、槲皮素、花青素等[41]。有研究表明，一定濃度的槲皮素在培養(yǎng)基中能顯著抑制黃曲霉菌的生長(zhǎng)甚至殺死黃曲霉菌[42]?；ㄉN皮中的花青素及其前體物質(zhì)也能抑制黃曲霉菌絲的生長(zhǎng)和毒素的合成[43]。花生種子中還含有5,7-二甲氧異黃酮，其在培養(yǎng)基中也能抑制黃曲霉菌的生長(zhǎng)[44]。

1.2 抗菌蛋白

自然環(huán)境中的植物隨時(shí)會(huì)受到各種病原菌的侵染，因生存競(jìng)爭(zhēng)的需要，植物自身常產(chǎn)生一些物質(zhì)來(lái)與外源侵襲物對(duì)抗，植物抗真菌蛋白就是其中的一類，它們可抑制真菌生長(zhǎng)甚至殺死真菌。根據(jù)植物抗真菌蛋白的作用機(jī)制、結(jié)構(gòu)和序列特性，可將其大體分為以下幾類：病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)、防御素(defensins)、2S清蛋白(2s albumin proteins)、蛋白酶抑制劑(protease inhibitors)、熱激蛋白(heat shock proteins)、溶蛋白及其他蛋白等[45]。

1.2.1 病程相關(guān)蛋白 在植物自然衰老期間出現(xiàn)的少量蛋白或傷口誘發(fā)產(chǎn)生的大量蛋白常伴隨著對(duì)病原菌的反應(yīng)，也稱病程相關(guān)蛋白[46]。病程相關(guān)蛋白具有多種生物學(xué)活性，包括幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶、過(guò)氧化氫酶、溶菌酶等。幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶是病程相關(guān)蛋白中重要的兩種水解酶，在植物抵抗真菌侵染的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[47]。幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要成分，當(dāng)病原菌侵染植物時(shí)，幾丁質(zhì)酶會(huì)在被侵染的部位累積，起到分解真菌細(xì)胞壁的作用，從而抑制真菌的生長(zhǎng)與繁殖。與幾丁質(zhì)酶功能類似，β-1,3-葡聚糖酶能夠水解β-1,3-葡聚糖和β-1,3-1,6-葡聚糖，這兩種葡聚糖也是真菌細(xì)胞壁的重要組成部分。幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶在植物抵抗病原菌侵染時(shí)通常協(xié)同起作用，兩種酶同時(shí)存在時(shí)的抑菌活性遠(yuǎn)高于單種酶的抑菌活性[48]。研究表明，玉米種子在受到黃曲霉菌侵染后會(huì)產(chǎn)生這兩種酶來(lái)達(dá)到抵抗黃曲霉菌侵染的作用[49]。在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中，不論是轉(zhuǎn)入了幾丁質(zhì)酶基因還是β-1,3-葡聚糖酶基因的花生，都能夠抵抗黃曲霉菌的侵染，侵染率可以降低到10%以下[50-51]。花生自身的病程相關(guān)蛋白也具有水解酶活性，并且在花生抵抗黃曲霉菌侵染過(guò)程中發(fā)揮著一定作用[52]。Liang等[53]從花生中克隆出β-1,3-葡聚糖酶基因，并轉(zhuǎn)入花生植株當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)真菌病原體的抗性也有所增強(qiáng)。

PR10蛋白是PR蛋白家族當(dāng)中的重要成員之一，也是研究較多的病程相關(guān)蛋白之一。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)17個(gè)家族的PR蛋白，其中大部分都是定位在細(xì)胞外或者細(xì)胞內(nèi)的囊泡當(dāng)中，只有PR10蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[54]。PR10蛋白呈酸性，長(zhǎng)度16k～19kDa，缺少信號(hào)肽，在生物脅迫和非生物脅迫中都發(fā)揮作用，并且和蛋白酶有較大區(qū)別[55]。Chadha等[56]從花生中克隆出PR10蛋白并證明了其核酸酶活性及抗真菌作用。使用RNAi技術(shù)沉默玉米種子中的PR10基因會(huì)顯著加快黃曲霉菌菌絲的生長(zhǎng)，并且在沉默系中，黃曲霉毒素的累積量更高[57]。通過(guò)微陣列技術(shù)，發(fā)現(xiàn)并證明了PR10基因的表達(dá)與花生抗黃曲霉毒素污染相關(guān)[58-59]。在花生PR10基因的過(guò)表達(dá)系中，受到黃曲霉侵染后的侵染率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于正常品種[60]。

1.2.2 防御素 植物防御素，是一類分子量小、呈堿性、具有半胱氨酸保守結(jié)構(gòu)域以及復(fù)雜三維折疊結(jié)構(gòu)的短肽，一般由45～54個(gè)氨基酸組成，在微摩爾濃度下就能起到廣譜的抑菌作用，并抑制多數(shù)植物病原菌的生長(zhǎng)，尤其是絲狀真菌。大部分植物防御素都在細(xì)胞內(nèi)合成并且具有信號(hào)肽序列，被分泌到胞外空間發(fā)揮作用，在宿主防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[61]。不同植物防御素類型及氨基酸組成雖有所不同，但其三維結(jié)構(gòu)大多相似[62]。植物防御素抵御真菌侵染的作用已經(jīng)有較多報(bào)道，但關(guān)于防御素的作用機(jī)理目前有兩種主流的假說(shuō)，第一種是防御素與病原細(xì)胞細(xì)胞膜上的負(fù)電荷相互作用，破壞病原細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致病原菌細(xì)胞壞死[63]；另一種假說(shuō)則認(rèn)為防御素不會(huì)破壞細(xì)胞膜，而是與磷脂相互作用，從而改變膜透性，破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，從而導(dǎo)致病原菌細(xì)胞死亡[64]?？傊?，植物防御素抵抗真菌的能力是通過(guò)作用于細(xì)胞膜，改變膜透性來(lái)達(dá)到的。從苜蓿中克隆出的防御素基因能夠顯著抑制黃萎病菌的生長(zhǎng)[65]。轉(zhuǎn)入芥菜防御素基因的花生植株對(duì)葉斑病具有較強(qiáng)的抗性[66]。轉(zhuǎn)入MtDef4和MtDef5基因的花生抗黃曲霉侵染能力顯著增強(qiáng)[67]。李萬(wàn)福等[68-69]研究發(fā)現(xiàn)花生防御素基因過(guò)表達(dá)系幾乎不受黃曲霉菌的侵染，將花生籽仁切開(kāi)后，直接向籽仁中接種黃曲霉菌，花生籽仁仍未受到過(guò)多的黃曲霉菌侵染。

1.2.3 2S清蛋白 花生種子中存在3種貯藏蛋白：arachin，coarachin I和coarachin II（2S清蛋白）?；ㄉ?S清蛋白在65%～85%硫酸銨溶液中沉淀，占花生中總可溶性蛋白質(zhì)的約20%[70]。在植物體內(nèi)，2S清蛋白不止是一種貯藏蛋白，其還具有酶抑制劑、抗真菌、鈣調(diào)蛋白拮抗劑等多種作用[71]。從胡蘿卜中提取出的2S清蛋白在高濃度的情況下能夠抑制一部分病原真菌的生長(zhǎng)[72]。油菜、芝麻等種子中的2S清蛋白已被證實(shí)在體外具有抗真菌活性[73-74]?；ㄉN子中的2S清蛋白同樣具有一定的抑菌活性，Duan等[75]從花生中分離純化出2S清蛋白，并發(fā)現(xiàn)其和其它抗菌肽相似，氨基酸序列中富含谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸。經(jīng)過(guò)分離純化后的花生2S清蛋白在體外能夠有效抑制黃曲霉菌菌絲的生長(zhǎng)和孢子的形成。

1.2.4 蛋白酶抑制劑 蛋白酶抑制劑是一類分子量較小的多肽或蛋白，普遍存在與豆科、茄科、禾本科及十字花科等植物種子當(dāng)中，能與蛋白酶活性部位或變構(gòu)部位結(jié)合抑制酶的催化活性或阻止酶原轉(zhuǎn)化為有活性的酶，在調(diào)節(jié)蛋白酶活性和蛋白質(zhì)代謝等方面起重要作用[76]。在黃曲霉菌侵染作物種子的時(shí)候，需要分泌胞外角質(zhì)酶來(lái)降解表皮的角質(zhì)，分泌彈性蛋白酶來(lái)降解組織中的彈性蛋白，分泌α-淀粉酶降解碳水化合物，從而獲得其生長(zhǎng)和增殖所需的碳源和氨基酸[77-79]。研究發(fā)現(xiàn)，抗黃曲霉侵染的玉米種子中胰蛋白酶抑制劑的含量遠(yuǎn)高于感病品種[79]，其能夠抑制真菌α-淀粉酶的活性，從而阻止孢子萌發(fā)[80]，而α-淀粉酶分解產(chǎn)生的還原性糖還是黃曲霉毒素合成的主要誘導(dǎo)者[81]。從大豆中分離出的胰蛋白酶抑制劑能顯著抑制黃曲霉菌α-淀粉酶和部分蛋白酶的活性，從而抑制黃曲霉毒素的合成和黃曲霉菌的生長(zhǎng)[82]。梁炫強(qiáng)等[83]發(fā)現(xiàn)從花生種子中分離純化的胰蛋白酶抑制劑能在體外顯著抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)，并且發(fā)現(xiàn)花生種子中的胰蛋白酶抑制劑活性高低與品種抗黃曲霉侵染能力相關(guān)。

1.2.5 熱激蛋白 熱激蛋白又稱熱休克蛋白，分子量為10k～200 kD，幾乎存在于所有生物體內(nèi)，且高度保守[84]。正常條件下熱激蛋白在體內(nèi)含量較低，但當(dāng)?shù)讲涣紬l件刺激時(shí)，會(huì)大量合成，因此也被稱為逆境誘導(dǎo)蛋白。熱激蛋白含有一個(gè)被稱為“heat-shock”的結(jié)構(gòu)域，能夠在植物受到生物或非生物脅迫時(shí)作為分子伴侶發(fā)揮作用[85]。研究表明，當(dāng)植物受到病原菌侵害時(shí)，熱激蛋白能夠調(diào)節(jié)R蛋白的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，從而達(dá)到調(diào)節(jié)植物防御系統(tǒng)的作用[86]。Baldeep等[87]認(rèn)為熱激蛋白可作為一種真菌抑制劑被應(yīng)用到生產(chǎn)中。在花生抗黃曲霉侵染的轉(zhuǎn)錄組研究中，熱激蛋白基因均為關(guān)鍵基因[87-90]。

1.2.6 溶蛋白及其他蛋白 由于干旱是導(dǎo)致花生黃曲霉污染的重要因素之一，當(dāng)花生受到干旱脅迫且被黃曲霉菌侵染時(shí)，籽仁中會(huì)發(fā)現(xiàn)溶蛋白的存在[91]。Waraluk等[92]研究發(fā)現(xiàn)花生中溶蛋白與黃曲霉抗性相關(guān)，在培養(yǎng)基中，溶蛋白能夠顯著抑制黃曲霉菌的生長(zhǎng)。另外，類親環(huán)素蛋白(cyclophilin-like proteins)、核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating proteins，RIPs)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(1ipid-transfer proteins，LTPs)等蛋白的研究表明也可以抑制真菌生長(zhǎng)或殺死真菌[45]。

2 被黃曲霉菌侵染時(shí)相關(guān)酶活性的變化

在植物抵抗病原菌侵染的過(guò)程中，會(huì)伴隨著大量酶活性的變化，除了之前提到的能直接作用于病原菌的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶以外，還有很多與植物和病原菌互作相關(guān)的酶。其中，有兩種酶活性常被用來(lái)評(píng)價(jià)植株的抗性，分別為苯丙烷類代謝途徑相關(guān)酶以及與活性氧代謝相關(guān)酶。

2.1 苯丙烷類代謝酶活性

植物體內(nèi)苯丙烷類代謝途徑已闡明，反式肉桂酸、阿魏酸、香豆酸等是該途徑的中間產(chǎn)物，這些物質(zhì)可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成類黃酮與木質(zhì)素等[93]。香豆酸和肉桂酸能夠抑制P450單加氧酶，而該酶可以被黃曲霉菌利用產(chǎn)生黃曲霉毒素[94]。阿魏酸在體外條件下被證明具有高度的抑菌活性，能夠有效抑制黃曲霉孢子的形成[95]。木質(zhì)素作為植物體內(nèi)一種重要的物理抗菌物質(zhì)，能夠沉積于細(xì)胞壁上而作為結(jié)構(gòu)屏障，加固細(xì)胞壁，保護(hù)細(xì)胞免受病原菌的侵染[96]。類黃酮和酚類物質(zhì)具有清除體內(nèi)自由基的作用，是植物抵抗病原菌侵染的重要成分。

除此之外，苯丙烷類代謝途徑還與水楊酸(SA)合成相關(guān)。水楊酸是植物系統(tǒng)獲得性抗性的重要組成部分。苯丙氨酸在經(jīng)肉桂酸、苯甲酸等中間代謝產(chǎn)物，最終可以合成水楊酸。當(dāng)植物受到病原菌入侵時(shí)，在植物入侵部位會(huì)發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)(HR)，導(dǎo)致植物被侵染部位局部壞死，從而阻斷病原菌。之后經(jīng)過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引發(fā)植物對(duì)病原物的廣譜抗性，稱為系統(tǒng)獲得性抗性。水楊酸是系統(tǒng)獲得性抗性中最重要的調(diào)控因子。首先，SA可以調(diào)節(jié)HR反應(yīng)。在缺少HR基因的突變體中，會(huì)有較高水平的SA產(chǎn)生；在缺少SA基因的突變體中，HR反應(yīng)會(huì)增強(qiáng)[97-98]，這說(shuō)明SA或其代謝產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)HR反應(yīng)和細(xì)胞死亡。其次，SA可以調(diào)控下游病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗真菌能力。有研究表明，SA處理能夠增強(qiáng)植物中幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶以及苯丙氨酸解氨酶等的活性，從而增強(qiáng)植物的抗真菌能力[99-100]。除此之外，SA還具有誘導(dǎo)植物中抗氧化酶活性增強(qiáng)的作用[101]。

苯丙烷類代謝途徑中，苯丙氨酸解氨酶(PAL)是該途徑的限速酶，同時(shí)，該途徑還包括多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)等。梁炫強(qiáng)等[103]測(cè)定了抗感差異花生在受黃曲霉菌侵染后苯丙烷類代謝途徑中相關(guān)酶的活性，發(fā)現(xiàn)抗病品種中PPO和PAL活性的提高速度高于感病品種，其中PAL的變化幅度更是遠(yuǎn)高于感病品種。同時(shí)其還測(cè)定了木質(zhì)素的含量，發(fā)現(xiàn)感染7天后木質(zhì)素的含量與品種的平均感染率呈顯著負(fù)相關(guān)，即抗性越強(qiáng)的品種木質(zhì)素含量越高。朱敦瑋等[104]也測(cè)定了苯丙烷類代謝途徑中相關(guān)酶的活性，驗(yàn)證了前人的研究結(jié)果，還發(fā)現(xiàn)在抗病品種中黃酮類物質(zhì)的含量遠(yuǎn)高于感病品種。Nandini等[105]測(cè)定了水楊酸及其它苯丙烷類代謝途徑相關(guān)酶的活性和產(chǎn)物的含量，發(fā)現(xiàn)受黃曲霉菌侵染后，水楊酸和該途徑中的PAL、POD酶活性均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，水楊酸調(diào)控的β-1,3-葡聚糖酶活性也大幅提高。苯丙烷類代謝途徑的終產(chǎn)物之一木質(zhì)素的含量也比未侵染時(shí)大幅提高。在花生抗黃曲霉侵染的轉(zhuǎn)錄組研究中，也發(fā)現(xiàn)抗病品種PAL基因的表達(dá)比感病品種更早且表達(dá)量更高[90]。這些結(jié)果都表明，抗病品種在受黃曲霉侵染后苯丙烷類代謝途徑能夠迅速反應(yīng)，產(chǎn)生足量的酚類化合物、木質(zhì)素等以抵御黃曲霉菌的侵染。

2.2 活性氧代謝相關(guān)酶活性

活性氧是泛指那些含有氧原子但較氧具有更活潑化學(xué)反應(yīng)性的某些代謝物及其衍生物。植物體內(nèi)的活性氧主要有超氧自由基、過(guò)氧化氫、羥自由基等，其參與膜質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞壁木質(zhì)化和蛋白聚合，具有直接殺死病原菌和啟動(dòng)植物過(guò)敏反應(yīng)等功能[106]。當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，會(huì)迅速產(chǎn)生和積累活性氧，一方面直接殺死病原菌或抑制病原菌生長(zhǎng)，另一方面，活性氧的局部爆發(fā)可以引發(fā)植物細(xì)胞壞死，從而阻斷病原菌繼續(xù)入侵[107]。同時(shí)，活性氧也有促進(jìn)細(xì)胞壁木質(zhì)化及調(diào)控部分抗病相關(guān)基因表達(dá)的作用。

植物體內(nèi)與活性氧代謝相關(guān)的酶包括脂氧合酶(LOX)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等。超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶能夠清除植物體內(nèi)的活性氧，從而抑制過(guò)敏反應(yīng)。脂氧合酶則是參與到不飽和脂肪酸代謝途徑中，部分代謝物能有效抑制真菌的生長(zhǎng)和毒素合成，例如9S-HPODE[108]，也有部分能誘導(dǎo)植物啟動(dòng)體內(nèi)逆境脅迫基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)一系列防御反應(yīng)，例如茉莉酸甲酯(MEJA)，與水楊酸類似，都能誘導(dǎo)啟動(dòng)植物體內(nèi)蛋白酶抑制劑和類黃酮合成酶等病原相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，使植物獲得系統(tǒng)抗性。有研究表明，經(jīng)MEJA處理過(guò)的棉花、開(kāi)心果的黃曲霉毒素污染水平顯著降低[109-110]。

梁炫強(qiáng)等[111]對(duì)抗感花生活性氧相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定發(fā)現(xiàn)抗病品種中LOX活性迅速提高，同時(shí)產(chǎn)生大量活性氧，但活性氧清除酶SOD和CAT活性的變化不明顯，而感病品種正好相反，SOD和CAT活性迅速升高，體內(nèi)的活性氧累積量較少，并且在其結(jié)果中丙二醛濃度也發(fā)生了很大變化，丙二醛是判斷膜質(zhì)過(guò)氧化的重要指標(biāo)，可以推測(cè)出活性氧可能是破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞壞死，從而阻斷了黃曲霉菌的侵染。這些結(jié)果表明活性氧的累積在花生抗黃曲霉菌侵染的過(guò)程中起著重要作用。

3 展望

近年來(lái)，隨著生產(chǎn)的不斷擴(kuò)大，部分區(qū)域花生收獲、運(yùn)輸和貯藏等條件難以保證，從而導(dǎo)致花生的黃曲霉毒素污染問(wèn)題日益嚴(yán)重。花生抵抗黃曲霉菌侵染的生理生化機(jī)制研究對(duì)于解決花生黃曲霉毒素污染具有重大意義。目前，已有的研究表明，在黃曲霉菌侵染花生種子的過(guò)程中，花生自身的部分成分和花生防御系統(tǒng)共同發(fā)揮作用，其中，花生種皮中的多酚類物質(zhì)，例如黃酮類和單寧等，率先發(fā)揮抵御作用。溶蛋白和2S清蛋白等花生種子中的貯藏蛋白和其它內(nèi)含物也部分具有抗菌作用。在防御過(guò)程中，還有植物抗毒素基因及抗菌蛋白基因的表達(dá)，如白藜蘆醇合酶、幾丁質(zhì)酶、類黃酮合成基因等。JA和SA信號(hào)通路也在花生防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用?；钚匝醮x、脂肪酸代謝、苯丙烷類代謝途徑的相關(guān)酶類都在花生抵抗黃曲霉侵染的過(guò)程中協(xié)同發(fā)揮著重要作用。

近年來(lái)，雖然花生抗黃曲霉菌生理生化成分的變化與抗性相關(guān)基因表達(dá)模式已基本清晰，但是仍存在很多問(wèn)題。第一，花生中各個(gè)抗性成分在抵抗黃曲霉菌侵染中的具體作用尚不清楚，目前已知的很多成分有些只能抑制寄生曲霉，有些只能抑制黃曲霉，這些成分對(duì)曲霉菌的作用機(jī)理尚不清楚；第二，由于花生真實(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境是復(fù)雜的，會(huì)受到地上及地下生物和非生物等各種脅迫因素的影響，這些外部因素都有可能影響花生對(duì)黃曲霉菌的抗性，其具體的影響程度尚不清楚；第三，植物與病原菌的互作是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其中有部分物質(zhì)可以被植物和病原菌共同利用，這也為研究花生籽仁中各個(gè)成分對(duì)黃曲霉的抗性機(jī)制增加了難度。

隨著多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，預(yù)期花生抗黃曲霉機(jī)制研究在未來(lái)主要集中在以下幾個(gè)方面：（1）通過(guò)對(duì)花生抗黃曲霉物質(zhì)的分離、驗(yàn)證及檢測(cè)，了解各個(gè)組分的作用；（2）通過(guò)對(duì)不同環(huán)境花生黃曲霉抗性的檢測(cè)，進(jìn)一步探究環(huán)境因素對(duì)花生黃曲霉抗性的影響；（3）不斷深化各組學(xué)技術(shù)間的融合，強(qiáng)化多學(xué)科交叉融合意識(shí)并積極創(chuàng)新，進(jìn)一步揭示花生與黃曲霉相互作用的機(jī)制。