多囊卵巢綜合征動(dòng)物模型構(gòu)建方法的研究進(jìn)展
——聚焦于雄激素的誘導(dǎo)

付貝貝，謝青貞

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育齡女性最常見的一類生殖器官結(jié)構(gòu)和功能改變的復(fù)雜病癥，并且與代謝疾病相關(guān)，患病率約占育齡期女性的6%～10%[1]，主要臨床表現(xiàn)為稀發(fā)排卵或不排卵、臨床或生化高雄激素血癥(hyperandrogenism，HA)、卵巢多囊化。除卵巢改變外，該綜合征還影響代謝，主要表現(xiàn)為肥胖，PCOS中約38%～88%的女性合并有腹型肥胖[2]。此外，還有50%～70%PCOS女性同時(shí)伴有類似2型糖尿病表現(xiàn)的高胰島素血癥和胰島素抵抗(insulin resistance，IR)[3]。

PCOS病因?qū)W至今尚未明確，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多系統(tǒng)的復(fù)雜調(diào)控使得其病理生理改變多態(tài)且具有異質(zhì)性。雄激素是公認(rèn)的PCOS發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，HA是PCOS的標(biāo)志。但由于PCOS病因不明，且首選雌、孕激素治療，幾乎不選擇手術(shù)治療，臨床樣本采集較為困難。因此，構(gòu)建一種能夠模擬人類PCOS特征的動(dòng)物模型，對(duì)于PCOS發(fā)病機(jī)制的深入研究具有極高價(jià)值。

迄今為止，已有數(shù)十種研究方法被開發(fā)，試圖構(gòu)建接近人類PCOS的動(dòng)物模型，采用較多的除雄激素造模法外還有雌激素、孕激素、芳香化酶抑制劑造模法等。其中以雄激素誘導(dǎo)法得到嚙齒類動(dòng)物模型，造模周期短、成模率高、成本低廉，且最為接近人類PCOS的生殖與代謝特征，因此應(yīng)用較為廣泛?，F(xiàn)將通過雄激素誘導(dǎo)法得到的PCOS動(dòng)物模型方法及特征綜述如下，為該領(lǐng)域的研究者提供參考。

1 多囊卵巢綜合征動(dòng)物模型的選擇

原則上，應(yīng)選擇生理、生殖功能與人類最為相近的靈長(zhǎng)類動(dòng)物，如恒河猴等，其與人類共享93%的基因組[4]，生殖系統(tǒng)、月經(jīng)和排卵周期都接近人類，是研究PCOS理想的動(dòng)物模型，但繁殖期長(zhǎng)且成本較高，科研應(yīng)用受限[5]。在綿羊的研究中，給予母羊大劑量睪酮(testosterone，T)，過量雄激素刺激下的小羊在青年期出現(xiàn)黃體生成素(luteinizing hormone，LH)水平增加、異常卵巢周期等類PCOS表現(xiàn)[6-7]，但因價(jià)格昂貴同樣存在科研限制性。家兔性激素敏感度低，也無法成為選擇之一。

大鼠、小鼠等嚙齒類動(dòng)物，遺傳背景穩(wěn)定、性激素敏感度高、繁殖力強(qiáng)、動(dòng)情周期短，同時(shí)實(shí)驗(yàn)可操作性強(qiáng)、來源廣泛、價(jià)格低廉、易于飼養(yǎng)，使得其造模周期短、成模率高、模型穩(wěn)定具有復(fù)制性，是目前最常選擇的PCOS動(dòng)物種類。其中，大鼠發(fā)情周期穩(wěn)定，且體型和器官較大、血容量高，有利于操作及樣本收集。但常見的大鼠品系Wistar和Sprague-Dawley都屬于遠(yuǎn)交系，雖然疾病抵抗力較強(qiáng)，但存在不易進(jìn)行復(fù)制及基因工程改造等缺點(diǎn)。小鼠近交系多，品種一致性高，較易復(fù)制，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性高，更有利于基因工程方面的研究。

2 多囊卵巢綜合征動(dòng)物模型雄激素造模法

雄激素造模是目前應(yīng)用最多的造模方法，其誘導(dǎo)得到的鼠類模型下丘腦-垂體-卵巢軸完整，且卵巢和內(nèi)分泌特征明顯。對(duì)孕鼠羊膜予藥或?qū)Σ煌L(zhǎng)周期大、小鼠予外源性雄激素刺激，通過改變雄激素的種類及給藥方式，可使其表現(xiàn)出與人PCOS相似的表型。

2.1 脫氫表雄酮造模法

脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)是一種主要在腎上腺內(nèi)合成的雄激素，是孕酮經(jīng)△5途徑轉(zhuǎn)化成雄烯二酮的中間產(chǎn)物，受LH調(diào)控。通過外源性提高DHEA水平,導(dǎo)致雄烯二酮水平增高，進(jìn)而造成T及雌酮水平升高，表現(xiàn)為PCOS典型的HA，升高的雄酮負(fù)反饋調(diào)節(jié)卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)分泌使得FSH相對(duì)不足，卵泡發(fā)育受阻，從而出現(xiàn)卵泡排出障礙及多囊樣卵巢[8]。

DHEA誘導(dǎo)法是現(xiàn)今國際公認(rèn)的、也是國內(nèi)應(yīng)用最多的較為理想PCOS動(dòng)物模型造模方法。該方法最早在1991年由Lee等[9]提出，對(duì)23日齡SD大鼠連續(xù)20 d皮下注射DHEA(6 mg/100 g)，成功構(gòu)建了DHEA誘導(dǎo)的PCOS大鼠模型。Anderson等[10]成功復(fù)制了該模型，觀察到DHEA處理的大鼠表現(xiàn)出不規(guī)則動(dòng)情周期，卵巢重量增加，卵巢內(nèi)卵泡趨于閉鎖且出現(xiàn)囊樣擴(kuò)張，類似于PCOS患者的卵巢病理改變。此外還觀察到LH水平降低，LH/FSH比值及T水平的升高。

Kim等[11]對(duì)42日齡(青春期后)SD大鼠每日皮下注射DHEA(60 mg/kg)持續(xù)長(zhǎng)達(dá)20～30 d，建立了改良后的DHEA誘導(dǎo)的PCOS大鼠模型，與青春期前模型相比，青春期后大鼠模型發(fā)情期被破壞和多囊性卵巢的比例均增加，表明DHEA處理的青春期后PCOS大鼠模型具有更高的誘導(dǎo)率。此外，還觀察到卵巢、子宮重量、子宮壁厚度和卵巢囊腫數(shù)量明顯增加，為PCOS的病因研究提供了一個(gè)新的模型構(gòu)建方法。

Solano、Qi等[12-13]通過對(duì)青春期前小鼠(21～25日齡)連續(xù)20 d皮下注射DHEA(6 mg/100 g)，觀察到小鼠發(fā)情周期被破壞，體重增加，生殖能力低下，卵巢表現(xiàn)出明顯的囊樣囊泡外觀，閉鎖卵泡增多、卵泡膜細(xì)胞層變薄、顆粒細(xì)胞緊密，雌激素、孕酮(progesterone，P)水平上升，葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)提示糖耐量降低和葡萄糖耐受不良，提示IR。

綜上所述，DHEA誘導(dǎo)的大鼠、小鼠PCOS動(dòng)物模型在生殖、代謝方面都與PCOS女性具有高度相似性，是可以用于研究PCOS的理想模型。但需要注意的是，該方法誘導(dǎo)得到的動(dòng)物模型在卵巢多囊化及激素水平的變化上雖接近人類PCOS患者，但在卵巢形態(tài)學(xué)及對(duì)治療的反應(yīng)方面還存在一定的差異，同時(shí)外源性DHEA的過量補(bǔ)充會(huì)導(dǎo)致模型動(dòng)物內(nèi)、外源性及卵巢局部雄激素水平升高，對(duì)于雄性激素變化的研究有所影響。

2.2 雙氫睪酮造模法

雙氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT)造模法是一種較常用的、高生物活性的雄激素，在體內(nèi)由T通過5α-還原酶轉(zhuǎn)化而得，通過影響內(nèi)分泌相關(guān)受體，干預(yù)卵泡的發(fā)育、成熟及排卵，還可與皮膚、毛囊的受體結(jié)合導(dǎo)致PCOS患者出現(xiàn)多毛、痤瘡等臨床表現(xiàn)。

DHT誘導(dǎo)的PCOS大鼠模型由瑞典科學(xué)家Stener-Victorin 2007年初創(chuàng)，隨后被眾多學(xué)者參考借鑒。Manner?s等[14]對(duì)21日齡的Wistar大鼠頸部皮下植入DHT緩釋藥片(含7.5 mg DHT，83 μg/d)，持續(xù)給藥90 d，造模結(jié)束后觀察到大鼠體重明顯增加，增加的脂肪組織集中于腹股溝和腹內(nèi)，尤其是腸系膜。此外還觀察到不規(guī)則的動(dòng)情周期，血清雌二醇(estradiol，E2)、P、LH水平下降，卵巢重量減少、體積縮小，但卵巢內(nèi)卵泡體積增大，囊性卵泡數(shù)量增加且囊壁增厚，表現(xiàn)為內(nèi)膜細(xì)胞層增厚，顆粒細(xì)胞層變薄，同時(shí)伴有IR。

Van等[15]對(duì)青春期前雌性小鼠，在出生后第19 d皮下植入DHT緩釋藥丸90 d(含2.5 mg DHT，27.5 μg/d)，構(gòu)建了DHT誘導(dǎo)的PCOS小鼠模型，同樣觀察到不規(guī)則動(dòng)情周期，體重增加，脂肪細(xì)胞體積增大，瘦素水平升高，腹腔內(nèi)葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)顯示小鼠同時(shí)伴有葡萄糖不耐受。但是，區(qū)別于DHT處理大鼠的卵巢重量減少，小鼠模型卵巢重量趨于增加，但差異無顯著性。此外，經(jīng)DHT處理后的小鼠卵巢囊性卵泡數(shù)量增加，但卵泡分布并不完全類似PCOS女性，LH水平趨于降低但與對(duì)照組相比無差異。

DHT誘導(dǎo)得到的鼠類模型能夠表現(xiàn)出人類PCOS的關(guān)鍵特征，是可以用于研究PCOS的模型之一。該方法的缺點(diǎn)一是在于未表現(xiàn)出PCOS卵巢特征性的白膜增厚和體積增大；二是大鼠模型血LH水平差異性的不升反降。此外還需要注意的是，上述方法構(gòu)建的模型誘導(dǎo)時(shí)間為90 d，模型建立時(shí)大鼠、小鼠約為3.5月齡，已是體成熟期，研究者需將模型年齡納入?yún)⒖肌?/p>

2.3 丙酸睪酮造模法

丙酸睪酮(testosterone propionate,TP)是一種經(jīng)由人工合成的雄激素類藥物，在體內(nèi)會(huì)先轉(zhuǎn)化為5α-二氫睪酮再結(jié)合細(xì)胞受體發(fā)揮作用。過量的雄激素干擾卵泡的發(fā)育和優(yōu)勢(shì)卵泡生成，最終導(dǎo)致排卵障礙。

1983年Ota等便嘗試通過TP制備具有實(shí)驗(yàn)性PCOS的大鼠，發(fā)現(xiàn)皮下注射TP處理后的雌鼠具有許多與人PCOS類似的內(nèi)分泌和組織學(xué)特征。Belooseaky等[16]對(duì)21日齡的Wistar大鼠，每日皮下注射TP(1 mg/100 g)連續(xù)35 d，7 d后便觀察到卵巢內(nèi)囊性卵泡顯著積聚，35 d后，觀察到卵巢內(nèi)囊性卵泡的形成，卵巢呈多囊樣改變，未觀察到黃體形成，提示卵巢內(nèi)無排卵。內(nèi)分泌方面，觀察到空腹血糖/胰島素比率顯著降低，表現(xiàn)出類似人PCOS的IR癥狀，但模型的穩(wěn)定性未做研究，只適合短期實(shí)驗(yàn)觀察。Chaudhari等[17]使用同樣的方法復(fù)制了該模型，觀察到血清T水平增加，但缺點(diǎn)在于未觀察到E2水平的差異，此外LH水平不升反降、卵巢重量減輕、體積減小等與人類PCOS的差異性都是該建模方法的局限性。

2.4 睪酮造模法

T是一種主要由男性睪丸或者女性卵巢分泌的雄激素，在體內(nèi)可以直接或者先轉(zhuǎn)化為5α-二氫睪酮作用于雄激素受體或者通過直接轉(zhuǎn)化成E2作用于雌激素受體發(fā)揮作用。過量T使得垂體對(duì)下丘腦刺激的敏感性降低、LH持續(xù)性分泌及排卵性LH峰的消失，同時(shí)FSH的促排卵作用也被抑制，最終導(dǎo)致不排卵。

T誘導(dǎo)的PCOS動(dòng)物模型目前多見于大鼠，在小鼠中僅有少量在孕鼠和初生鼠的研究報(bào)道。Sun等[18]在6～10日齡的SD大鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，9日齡組70%的大鼠出現(xiàn)持續(xù)性高雄激素導(dǎo)致的不排卵性不孕，并伴有攝食量的增多和肥胖，激素水平上表現(xiàn)為血LH、FSH水平降低，胰島素、T、DHEA水平升高，T/E2比值升高，卵巢體積縮小、重量減輕，但未觀察到卵巢白膜增厚和卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞的增生，該方法得到的大鼠模型僅表現(xiàn)出少數(shù)PCOS特征，并不適于卵巢形態(tài)學(xué)的研究，LH水平的不升反降也與PCOS特異性的內(nèi)分泌特性相悖，仍有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)語

以上便為現(xiàn)階段國內(nèi)外采用較多的通過單純雄激素誘導(dǎo)構(gòu)建的PCOS動(dòng)物模型，目前國內(nèi)外造模方法50余種，但由于PCOS病因復(fù)雜、發(fā)病機(jī)制不明確，使得上述各種造模方法都無法完全模擬PCOS的臨床特點(diǎn)。雄激素誘導(dǎo)法相較而言，更能表現(xiàn)出在人類PCOS中觀察到的關(guān)鍵特征。但目前仍沒有一個(gè)模型可以全面地復(fù)制這個(gè)復(fù)雜的臨床綜合征，更好的PCOS模型仍有待開發(fā)。本綜述討論了不同雄激素法構(gòu)建得到的PCOS動(dòng)物模型的表型和特征，有助于幫助研究者們選擇合適的模型構(gòu)建方法，提高對(duì)PCOS發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。