脂肪干細胞來源外泌體在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的研究進展

賁新宇，易西南

（海南醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，海南省熱帶腦科學(xué)研究與轉(zhuǎn)化重點實驗室，海南?？?71199）

周圍神經(jīng)損傷是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在所有外傷中占到2.8%左右［1］，創(chuàng)傷相關(guān)導(dǎo)致的神經(jīng)損傷給社會經(jīng)濟帶來了很大的負擔(dān)，給家庭帶來了精神壓力［2］。盡管周圍神經(jīng)具有自我修復(fù)的能力，但很難達到功能上的完全恢復(fù)，尤其是較長的神經(jīng)損傷和近端神經(jīng)缺損［3］。雖然目前臨床上治療周圍神經(jīng)損傷的方法種類繁多［4，5］，但功能恢復(fù)效果不理想［6］，且存在修復(fù)材料價格昂貴、風(fēng)險性大等缺點［7］。近年來，脂肪干細胞（adipose-derived stem cell，ADMSC）外泌體（exosome，Exo）在很多疾病的治療領(lǐng)域都有較多報道［8，9］。本文將回顧近年來ADMSC 外泌體在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的研究進展，并討論脂肪干細胞外泌體在神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用策略和前景。

Exo 是指細胞主動向外分泌的富含多種非編碼RNA 和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的脂質(zhì)膜性囊泡［10］，Exo 所含的RNA 和蛋白質(zhì)等物質(zhì)被證實能介導(dǎo)細胞間的信號傳導(dǎo)［11］，同時發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)損傷修復(fù)等病理過程中也起到一定的作用［12］。自從1981 年外泌體的概念被首次提出［13］，外泌體便一直是多種領(lǐng)域的研究熱點。Exo 曾被認為是細胞活動中多余的成分，但是隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)Exo 在細胞之間傳遞物質(zhì)，例如RNA、蛋白質(zhì)等，外泌體通過這些物質(zhì)參與多種疾?。ㄈ缒[瘤、遺傳病等）的發(fā)生與發(fā)展［14，15］。在正常的生理過程中，外泌體發(fā)揮著介導(dǎo)細胞通訊的功能［16］。此外，外泌體也可以調(diào)節(jié)宿主-病原體的相互作用［17］。也有研究表明，由于外泌體表面及內(nèi)部存在特殊的蛋白［18］或miRNA［19］，并且外泌體可被分泌至血清、腦脊液、尿液、唾液等體液中［20］，這些分子標(biāo)志物使外泌體在臨床中可用于診斷疾?。?1］。

自從Zuk［22］等人2001 年首次在自體脂肪組織中提取出脂肪干細胞（adipose stem cells，ADMSCs），對其的相關(guān)研究便逐漸成為熱點，由于其易于取材且組織中干細胞含量豐富，在多種疾病中都被視為理想的修復(fù)細胞來源［23］。已經(jīng)有大量研究表明，間充質(zhì)干細胞來源的外泌體能夠調(diào)節(jié)細胞的增值與分化，限制組織與細胞損傷、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并促進組織的再生和細胞修復(fù)［24，25］。這些功能使脂肪干細胞外泌體在組織損傷修復(fù)的應(yīng)用中具有巨大的潛力。

1 脂肪干細胞外泌體的優(yōu)勢

1.1 脂肪干細胞及其外泌體

脂肪組織中含有豐富的成體干細胞，具有許多優(yōu)勢，例如易于獲取、生長速度快、遺傳穩(wěn)定性高、抗原性低［26，27］，以及強大的增殖能力和多向分化能力。Qian 等［28］使用作用于ADMSCs 的特異性誘導(dǎo)劑后，能夠檢測到神經(jīng)元特有的標(biāo)志性蛋白，說明ADMSCs 具有向神經(jīng)細胞分化的潛能。此外，細胞貼壁能力強，體外易于培養(yǎng)；營養(yǎng)需求較低，在培養(yǎng)基中生長旺盛［29］。脂肪來源的間充質(zhì)干細胞不僅具有多能性和可塑性［28］，而且數(shù)量豐富，ADMSCs在脂肪中含量約為脂肪細胞的2%，遠遠高于骨髓中的干細胞1/25 000～1/100 000 的比例［30，31］。此外，在氧含量正常或稍低的環(huán)境中，都可以在體外成功地分離到Exo［32，33］。正因ADMSCs 的易獲得性和低依賴性，使得其在臨床上的應(yīng)用受到重視。

1.2 脂肪干細胞外泌體的分子特征

隨著對外泌體研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)不同的EXO 具有不同的分子標(biāo)志物，這些標(biāo)志物可用于臨床疾病的診斷和檢測［34，35］。Sonoda 等［36］在建立的大鼠急性腎損傷模型中發(fā)現(xiàn)尿外泌體中miR-16、miR-24 和miR-200c 在腎臟損傷狀態(tài)上升，并且其增加與腎小球髓質(zhì)中的靶mRNA 減少相關(guān)。Zhang分析了ADMSC-EXO 的miRNA 譜，發(fā)現(xiàn)了148 種目前已知的miRNA［37］，且脂肪干細胞外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了1 466 種蛋白質(zhì)，參與各種細胞功能［38］。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，ADMSC-EXO 和骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體具有高度重疊的miRNA 表達譜，僅在少數(shù)轉(zhuǎn)運RNA 上有所不同［24］。

2 脂肪干細胞對在體周圍神經(jīng)修復(fù)的效果

大量研究［39，41］表明骨髓間充質(zhì)干細胞來源的Exo 能夠促進神經(jīng)缺損的修復(fù)，改善再生神經(jīng)纖維的數(shù)量和質(zhì)量。因此，經(jīng)推測ADMSCs 來源的外泌體或許在神經(jīng)損傷修復(fù)的過程中具有同樣的功效。近幾年大量有關(guān)ADMSCs 的研究發(fā)現(xiàn)其外泌體在人體周圍神經(jīng)修復(fù)過程中起到積極的作用。Ghoreishian 等［42］從狗的脂肪組織中分離出了未分化的ADMSCs，將未分化ADMSCs 包裹在藻酸鹽水凝膠中，成功修復(fù)了7 mm 的神經(jīng)缺損，改善了面神經(jīng)損傷的情況。Orbay 等［43］將ADMSCs 放在含有多種生長因子的誘導(dǎo)液中培養(yǎng)，其分化出類似于形態(tài)類似于雪旺細胞的細胞。并且用ADMSCs 和分化的ADMSCs 移植入用硅膠導(dǎo)管修復(fù)的缺損坐骨神經(jīng)中，術(shù)后與硅膠導(dǎo)管處理組相比，大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度等神經(jīng)功能指標(biāo)均有明顯提升。Marconi等［44］通過尾靜脈將ADMSCs 注入大鼠體內(nèi)，以研究其對損傷的坐骨神經(jīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與磷酸鹽緩沖液（PBS）組相比，坐骨神經(jīng)功能指數(shù)和神經(jīng)纖維再生的數(shù)目顯著增加。Allbright 等［45］將ADMSC置于水凝膠中用于受損的坐骨神經(jīng)，發(fā)現(xiàn)了不錯的修復(fù)情況。Ni 在有關(guān)應(yīng)激性尿失禁的研究中發(fā)現(xiàn)，ADMSC-Exos 治療后的大鼠尿道中的橫紋肌纖維和周圍神經(jīng)纖維的密度也高于未處理組［38］。Li 在其實驗研究中發(fā)現(xiàn)，在大鼠雙側(cè)海綿狀神經(jīng)損傷模型中，ADMSC-Exos 治療可以顯著減輕病理變化，包括正常神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)的扭曲，平滑肌萎縮和膠原蛋白沉積，并改善其勃起功能［46］。

3 脂肪干細胞外泌體神經(jīng)元保護和突起發(fā)生的作用

大量證據(jù)表明多種不同類型的Exo 可以促進神經(jīng)再生［47，48］。例如雪旺細胞來源的外泌體可以促進神經(jīng)突向外生長［49］。但大多數(shù)來源的Exo 可能引起不必要的組織損傷，ADMSC-Exos 在獲取過程相對方便且傷害較小，且在神經(jīng)損傷的修復(fù)中有著同樣不錯的效果［50］。2018 年，Yin 等［51］在實驗中發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過ADMSC-Exos 治療的坐骨神經(jīng)損傷模型中，神經(jīng)束內(nèi)損傷減輕，神經(jīng)束膜較完整有序，且通過減輕雪旺細胞凋亡、減輕其自噬來促進坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù)。2019 年，Ren 等［52］發(fā)現(xiàn)miRNA-133b 修飾的脂肪干細胞外泌體可以通過影響與軸突再生相關(guān)的信號通路和NF，GAP-43，GFAP 和MBP 的表達，顯著促進后脊髓損傷動物神經(jīng)功能的恢復(fù)。Wei 等［53］發(fā)現(xiàn)，在人ADMSC-Exo 中存在較多的胰島素樣生長因子和肝細胞生長因子，在誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷后，實驗發(fā)現(xiàn)ADMSC-Exos 對PC12 細胞的增殖產(chǎn)生了積極的影響，由此表明，ADMSC-Exos 對神經(jīng)損傷有保護的作用。Summa 等［54］將ADMSCs和纖維蛋白生物導(dǎo)管聯(lián)合坐骨神經(jīng)損傷模型，實驗結(jié)果表明ADMSCs 聯(lián)合生物導(dǎo)管使軸突再生長度和近端的干細胞移動的距離等方面都優(yōu)于僅生物導(dǎo)管使用組。這些實驗都證實了脂肪干細胞外泌體在神經(jīng)元的保護和和突起的發(fā)生上起著重要的作用。

4 脂肪干細胞外泌體促神經(jīng)再生的機制

外泌體影響神經(jīng)再生途徑的多種多樣，一些研究神經(jīng)營養(yǎng)因子與外泌體結(jié)合來促進神經(jīng)再生，例如，色素上皮衍因子（PEDF）修飾的ADMSC-Exos可以激活自噬并抑制神經(jīng)元凋亡，從而減輕腦缺血-再灌注損傷［55］。最近已經(jīng)證實，ADMSC 外泌體傳遞外泌體miR-30d-5p 以抑制小膠質(zhì)細胞的自噬，最終促進小膠質(zhì)細胞極化為抗炎表型并逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元的損傷［56］。此外，損傷部位神經(jīng)的血供也是影響神經(jīng)再生的重要因素，血管網(wǎng)絡(luò)的重建為周圍神經(jīng)修復(fù)過程中的軸突生長提供了可再生的微環(huán)境［57，58］。Kang 研究發(fā)現(xiàn)，ADMSC-Exos 通過miRNA-31 作用于內(nèi)皮細胞抗血管生成基因HIF-1，從而使其誘導(dǎo)血管生成［59］。Liang 等［60］發(fā)現(xiàn)ADMSCs-Exos 可將miRNA-125a 傳遞到內(nèi)皮細胞并減少血管生成抑制劑DLL4 的表達，從而促進受損部位血管新生。另有研究表明，ADMSC 來源的外泌體通過PI3K/AKT 信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用［53］。

周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)膠質(zhì)細胞被稱為施萬細胞，其起源于背側(cè)神經(jīng)管的神經(jīng)嵴細胞，在微環(huán)境作用下逐漸分化而成，包裹軸突形成有髓神經(jīng)纖維髓鞘，在神經(jīng)的生長發(fā)育過程中與軸突密切相關(guān)［61］。施萬細胞為軸突提供了一層保護鞘，并能分泌神經(jīng)生長因子、外泌體等促進軸突的延長［62］。且外周神經(jīng)損傷后的修復(fù)很大程度上依賴于施萬細胞的增殖和遷移［63］，因此，施萬細胞在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中起著重要的作用。2019 年，Bucan 等［64］發(fā)現(xiàn)ADMSC-Exos 可以刺激施萬細胞增殖并增加細胞周期蛋白Ki67 的表達，表明Exos 可以增強背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元的神經(jīng)突長度。在這篇文獻中Bucan 第一次證明了ADMSC-Exos 中含有多種有利于神經(jīng)再生的生長因子。同樣有研究表明，施萬細胞中的miRNA 表達水平在神經(jīng)損傷后產(chǎn)生了明顯的變化，提示施萬細胞分泌的攜帶miRNA 的外泌體可能對神經(jīng)再生起到了一定的作用［65，66］。脂肪干細胞和施萬細胞共培養(yǎng)促進了施萬細胞表皮生長因子受體3（EGFR3/ErbB3），神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（NRG1），早期生長反應(yīng)蛋白2（Egr2/Krox20）和髓鞘堿基的mRNA 水平、蛋白質(zhì)（MBP）、ErbB3、NRG1 和Krox20 的蛋白質(zhì)水平相應(yīng)增加，從而推動了神經(jīng)損傷的修復(fù)［67］。

5 前景與展望

隨著人們對外泌體研究的逐漸加深，人們意識到ADMSC-Exos 的使用可以消除干細胞移植引起的問題，脂肪干細胞外泌體因其易得且量大的優(yōu)點逐漸在各個領(lǐng)域被人們所接受，在神經(jīng)再生領(lǐng)域有著廣闊的前景。但在神經(jīng)的損傷修復(fù)過程中，對于脂肪干細胞外泌體施予方法、路徑、劑量、及安全性等還有待深入研究。對其長期效果及不良作用、副作用還缺少關(guān)注。盡管大量實驗證據(jù)表明，使用間充質(zhì)干細胞外泌體治療周圍神經(jīng)損傷是安全有效的，但外泌體在臨床上如何廣泛應(yīng)用的問題尚未解決，應(yīng)用于人類的安全劑量也不得而知［38］，脂肪干細胞外泌體與其他神經(jīng)修復(fù)方式的聯(lián)合也有待探究。因此需要繼續(xù)加深對脂肪干細胞的了解，并在臨床中進行大量的實驗研究。