1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 四氫吡啶誘導(dǎo)小鼠嗅覺(jué)障礙的實(shí)驗(yàn)研究

張 欣，王 偉，司偉岳，魏一冉，李 靜，袁良杰

（1.山東第一醫(yī)科大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000；2.泰安市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 泰安 271000）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性減少為主要病理特征的中樞神經(jīng)退行性疾病，其臨床表現(xiàn)為靜止震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和步態(tài)不穩(wěn)為主要特征的運(yùn)動(dòng)癥狀[1，2]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究報(bào)道PD 的臨床表現(xiàn)除經(jīng)典的運(yùn)動(dòng)癥狀之外，還表現(xiàn)為以嗅覺(jué)障礙、便秘、情緒異常和睡眠障礙為主的非運(yùn)動(dòng)癥狀，其中嗅覺(jué)障礙的發(fā)生率最高，達(dá)70%～90%[3，4]。目前嗅覺(jué)障礙的發(fā)病病因及病理機(jī)制比較復(fù)雜，如基因突變、α-突觸核蛋白病變、神經(jīng)遞質(zhì)異常、神經(jīng)免疫系統(tǒng)紊亂、環(huán)境影響等因素[5]。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 四氫吡啶（l-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）為目前PD 研究中應(yīng)用較多的實(shí)驗(yàn)神經(jīng)毒素。大量研究發(fā)現(xiàn)[6-8]，MPTP 的制備的PD 慢性模型和亞急性模型能夠誘導(dǎo)小鼠的嗅覺(jué)障礙?；诖耍狙芯坎捎眯∈蟾骨蛔⑸銶PTP 制備PD 急性模型，探討MPTP 誘導(dǎo)對(duì)PD 小鼠嗅覺(jué)功能的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)使用SPF 級(jí)10 周左右雄性健康C57BL/6 小鼠，體重20～25 g，由安徽常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。小鼠在溫度18 ℃～22 ℃和12 h/12 h 晝夜循環(huán)光照條件下飼養(yǎng)。小鼠自購(gòu)買(mǎi)后在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行PD 小鼠模型制備。整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程完全遵循山東第一醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的規(guī)定[批號(hào)：SYXK（魯）20190022]。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及配置 MPTP 購(gòu)自美國(guó)sigma 公司，使用0.9%無(wú)菌生理鹽水溶解MPTP，配成10 mg/ml MPTP，每只小鼠15 mg/kg，給藥方式采用腹腔注射。兔抗-COX-2 抗體和兔抗-iNOS 抗體購(gòu)自abcam 公司。

1.3 方法 將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和MPTP 組，每組6 只，MPTP 組腹腔注射MPTP（15 mg/kg），每2 h 注射1 次，共4 次，同樣方法給予對(duì)照組注射生理鹽水，注射5 d 后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，嗅聞識(shí)別行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取雙側(cè)的小鼠嗅球，稱(chēng)重，并檢測(cè)炎性因子COX-2 和iNOS 蛋白的變化。

1.3.1 嗅聞識(shí)別行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 首先，將對(duì)照組和MPTP 組小鼠放在新墊料中飼養(yǎng)3 d。然后，于第4天將小鼠生活的籠子里另一半換上新墊料，另一半為小鼠生活的舊墊料。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將小鼠放在新舊墊料之間，檢測(cè)系統(tǒng)自動(dòng)記錄3 min 內(nèi)小鼠在新舊墊料分別活動(dòng)的時(shí)間。如小鼠不能辨別自己生活過(guò)的舊墊料的味道而是在新墊料區(qū)域停留的時(shí)間更長(zhǎng)，表明小鼠出現(xiàn)了嗅覺(jué)功能障礙。

1.3.2 樣本處理與Western Blot 實(shí)驗(yàn) 嗅聞識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠用8%的水合氯醛麻醉，然后用粗剪刀將小鼠斷頭剝?nèi)テっ珜樱褂眉?xì)剪刀將小鼠顱前部輕輕剪開(kāi)，雙側(cè)嗅球充分暴露置于干冰，用彎鑷小心分離出雙側(cè)嗅球置于已提前稱(chēng)重的EP 管中進(jìn)行稱(chēng)重。在一側(cè)嗅球的EP 管中加入蛋白裂解液（每1 mg 加入100 μl 的蛋白裂解液）。將小鼠樣品置于冰上，進(jìn)行電動(dòng)勻漿，勻漿至組織完全裂解為止，然后靜置40 min，4 ℃，12，000 r/min 離心20 min。小心吸取上清液置于新的EP 管中，每個(gè)樣本吸取1 μl 蛋白樣品用于濃度測(cè)定，將余下的蛋白樣品加入5X 蛋白上樣緩沖液，置于95 ℃金屬浴加熱器中孵育5 min，冰上靜置10 min。每個(gè)樣品取15 μg 上樣并進(jìn)行電泳分離出不同分子量蛋白。電泳結(jié)束后在將蛋白在300 mA、90 min 條件下轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF 膜浸潤(rùn)于5%的脫脂奶粉封閉90 min，4 ℃搖床一抗孵育24 h，然后將二抗孵育PVDF 膜，90 min，用發(fā)光液進(jìn)行顯影。利用ImageJ 軟件讀取COX-2，iNOS 與β-actin 蛋白條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MPTP 對(duì)小鼠雙側(cè)嗅球重量的影響 注射5 d后，兩組左側(cè)和右側(cè)嗅球重量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 MPTP 處理小鼠對(duì)小鼠雙側(cè)嗅球重量的影響（，mg）

2.2 MPTP 對(duì)小鼠嗅覺(jué)識(shí)別功能的影響 對(duì)照組小鼠嗅聞舊墊料時(shí)間長(zhǎng)于嗅聞新墊料時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MPTP 組小鼠嗅聞新舊墊料時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MPTP 組嗅聞舊墊料時(shí)間短于對(duì)照組，嗅聞新墊料時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 MPTP 處理小鼠后對(duì)嗅覺(jué)識(shí)別功能的影響（，s）

表2 MPTP 處理小鼠后對(duì)嗅覺(jué)識(shí)別功能的影響（，s）

2.3 MPTP 對(duì)小鼠嗅球炎性因子COX-2 和iNOS 蛋白表達(dá)的影響 注射5 d 后，MPTP 組嗅球COX-2、iNOS 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 MPTP 對(duì)小鼠嗅球COX-2 和iNOS 蛋白表達(dá)的影響（）

表3 MPTP 對(duì)小鼠嗅球COX-2 和iNOS 蛋白表達(dá)的影響（）

3 討論

嗅覺(jué)功能障礙是PD 最早的非運(yùn)動(dòng)特征之一，約在90%的早期PD 病例中存在，早于運(yùn)動(dòng)癥狀的出現(xiàn)數(shù)年[9]。誘發(fā)PD 患者嗅覺(jué)障礙的原因極其復(fù)雜，主要涉及到遺傳因素、環(huán)境因素、重金屬中毒和病毒感染等[10]。目前制備PD 模型研究最多外源性藥物是1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 四氫吡啶（l-methy-4-phenyl-l，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）[11，12]。研究表明[13]，鼻內(nèi)接觸MPTP 能夠有效的誘導(dǎo)PD 患者的嗅覺(jué)障礙，導(dǎo)致小鼠嗅覺(jué)喪失以及與帕金森病相似的連續(xù)認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)改變，但作用時(shí)間較短。采用MPTP 制備PD 模型包括急性PD 模型、亞急性和慢性PD 模型，研究表明[14]，MPTP 制備PD 慢性模型和亞急性模型均可誘發(fā)PD 的嗅覺(jué)功能障礙。本研究采用MPTP 腹腔注射制備小鼠PD 急性模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在注射MPTP 第5 天小鼠出現(xiàn)嗅覺(jué)障礙，表明腹腔注射MPTP 制備小鼠PD 急性模型能夠誘導(dǎo)PD 的前期非運(yùn)動(dòng)癥狀嗅覺(jué)功能障礙。

嗅覺(jué)功能障礙多表現(xiàn)為嗅覺(jué)減退及喪失，嗅覺(jué)損害具體表現(xiàn)為氣味辨別、識(shí)別、察覺(jué)的全面受損，而且氣味識(shí)別的損害比氣味察覺(jué)的損害更早、更加嚴(yán)重[15]。研究表明[16，17]，其主要的發(fā)病機(jī)制可能與神經(jīng)炎性、線粒體功能異常、氧化應(yīng)激、泛素一蛋白酶體系統(tǒng)功能障礙、興奮性氨基酸毒性作用及細(xì)胞凋亡等有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠嗅聞舊墊料時(shí)間長(zhǎng)于嗅聞新墊料時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MPTP 組小鼠嗅聞新舊墊料時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示腹腔注射MPTP 后小鼠不能分辨新舊墊料的氣味，表明小鼠的嗅覺(jué)功能受到損傷，說(shuō)明MPTP 制備的PD 急性小鼠模型能夠誘導(dǎo)小鼠的嗅覺(jué)功能障礙。研究表明[18]，腹腔注射MPTP 5 d 后導(dǎo)致中腦多巴胺能神經(jīng)元損傷，證實(shí)MPTP 能夠激活小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，釋放炎性因子COX-2 和iNOS 等促炎蛋白酶[19]。COX-2 是PGE2 的合成限速酶，PGE2 可以在膠質(zhì)細(xì)胞中調(diào)控IL-6 等炎性因子的表達(dá)[20]。iNOS 為誘導(dǎo)性一氧化氮合酶，誘導(dǎo)NO 的釋放，NO 是一種參與多種生理過(guò)程的分子信使，在腦出血，腦水腫及神經(jīng)退行性疾病中加速神經(jīng)元的損傷[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MPTP 組嗅球COX-2、iNOS 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示腹腔注射MPTP 導(dǎo)致嗅球區(qū)炎性因子COX-2 和iNOS 蛋白表達(dá)升高，表明MPTP 導(dǎo)致小鼠嗅覺(jué)障礙可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，MPTP 制備PD 急性小鼠模型能夠誘導(dǎo)小鼠的嗅覺(jué)功能障礙可能與膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有關(guān)。