外陰陰道假絲酵母菌病的基礎研究進展

馬洋洋，蔡淑嫣，許瑞雪 綜述 蔣學風 審校

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是一種機會性黏膜感染疾病,主要由假絲酵母菌感染誘導所致,以外陰陰道瘙癢、灼熱痛、豆腐渣樣白帶為主要臨床表現(xiàn)。1年內(nèi)有癥狀并經(jīng)真菌學證實的VVC發(fā)作4次或以上，稱為復發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis,RVVC)[1]。VVC易復發(fā)，盡管針對VVC/RVVC研發(fā)了多種新藥和有效的RVVC維持療法，但在過去30多年里，VVC的年患病率及復發(fā)率并沒有大幅下降，Denning 等[2]預測到2030年RVVC病例將有上升趨勢。

VVC的發(fā)病機制較為復雜，被認為是一種多因素疾病，其中陰道微生物失衡、雌激素水平、宿主易感因素、遺傳易感因素和念珠菌的形態(tài)都與疾病的發(fā)生相關(guān)[3]。現(xiàn)就核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)相關(guān)細胞焦亡、形態(tài)轉(zhuǎn)換、細菌與真菌的相互作用在VVC發(fā)病機制中的進展做一綜述。

1 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎性體相關(guān)細胞焦亡

目前越來越多的研究將先天的黏膜防御機制與疾病免疫病理學聯(lián)系起來，包括多形核中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)募集和促炎性細胞因子在陰道黏膜的表達，并認為RVVC和VVC的癥狀是由于PMN募集介導的，而這與假絲酵母菌激活的NLRP3炎性體密切相關(guān)。

1.1 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎性體及細胞焦亡經(jīng)典途徑

NLRP3是核甘酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白家族的成員，與接頭蛋白 (apoptosis-associated speck-like protein，ASC)和半胱天冬酶-1(caspase-1)共同組成多蛋白復合體(NLRP3炎性體)，通過激活caspase-1將白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細胞介素-18(IL-18)的非活性前體裂解成具有生物活性的細胞因子；而caspase-1通過切割GSDMD(Gsdermin D)蛋白形成的N端結(jié)構(gòu)域，可以在細胞膜上聚集形成孔洞破壞巨噬細胞的完整性，釋放IL-1β和IL-18到細胞外，最終導致巨噬細胞死亡即細胞焦亡[4]。這種依賴NLRP3炎性體激活觸發(fā)細胞焦亡的途徑稱為經(jīng)典途徑的細胞焦亡。

1.2 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎性體在外陰陰道假絲酵母菌病中的作用

在1項研究中發(fā)現(xiàn)，NLRP3-/-，ASC-/-，caspase-1-/-和IL-1R-/-的假絲酵母菌感染小鼠中，假絲酵母菌負荷量增加，生存率下降，這表明NLRP3炎性體在假絲酵母菌模型中具有保護性作用[5]。Roselletti等[6]發(fā)現(xiàn)有癥狀的VVC患者陰道液中存在大量PMN募集，且均檢測到NLRP3炎性體和caspase-1的表達以及IL-1β和IL-8兩種炎性細胞因子，而無癥狀攜帶者及健康女性這些因子幾乎不表達。1項動物實驗發(fā)現(xiàn)NLRP3-/-的VVC小鼠模型中，陰道PMN的募集、警報蛋白S100A8和炎性因子明顯減少，并認為在感染過程中，NLRP3可能是通過警報蛋白和一些炎性因子(如IL-1β)來控制PMN的募集。以上這些研究表明，VVC患者陰道中存在活躍的炎癥反應，NLRP3炎性體的表達促使VVC患者陰道中的PMN募集、IL-1β和IL-8的產(chǎn)生，促進VVC的癥狀學表現(xiàn)。

但VVC期間觀察到強烈的炎癥反應和PMN募集并不影響真菌負荷，Junko Yano等[7]發(fā)現(xiàn)小鼠陰道環(huán)境中存在的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)作為PMN上巨噬細胞抗原-1(macrophage associated antigen-1,Mac-1)的競爭配體，使中性粒細胞不能與念珠菌結(jié)合發(fā)揮殺菌作用而處于功能性“無能”狀態(tài)。免疫病理的誘因持續(xù)存在，激活NLRP3炎性體募集PMN,從而形成正反饋，導致陰道黏膜高度炎癥狀態(tài)。因此有人提出VVC/RVVC可能是由于PMN過度侵略性的先天反應，而不是受損的適應性免疫反應[1]。Jaeger等[8]的研究加強了NLRP3炎性體在促進VVC持續(xù)的高炎癥狀態(tài)中的中心作用，并提供了有力的證據(jù)證明RVVC患者中存在炎性小體和IL-1β產(chǎn)生類似的過度活化。有研究發(fā)現(xiàn)在PMN耗竭的VVC小鼠模型中檢測到的一種已知的細胞損傷標記物乳酸脫氫酶水平與對照組相似，這表明即使在缺乏強有力的免疫病理刺激下，黏膜依然會發(fā)生損傷，這種損傷可能是真菌菌絲導致的[9]。因此，我們推測由NLRP3炎性體介導的陰道高度炎癥狀態(tài)及PMN的無能會造成慢性陰道黏膜損傷，影響?zhàn)つば迯瓦M而有利于VVC發(fā)展為RVVC。

1.3 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3介導的細胞焦亡對外陰陰道假絲酵母菌病的影響

有研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞吞噬假絲酵母菌后的早期，假絲酵母菌是通過激活NLRP3誘導焦亡殺死巨噬細胞，在吞噬后的晚期一方面假絲酵母菌仍然可以通過轉(zhuǎn)換為菌絲，對巨噬細胞膜造成物理性損害，最終穿透細胞膜導致巨噬細胞死亡，另一方面假絲酵母菌通過與巨噬細胞競爭性消耗葡萄糖引發(fā)巨噬細胞的快速死亡，從而逃避先天免疫[10]。焦亡通過巨噬細胞自身裂解發(fā)生的炎癥反應一定程度上有利于組織的修復及病原菌的清除，但炎癥反應過度激活或持續(xù)存在會對組織造成傷害，使原有疾病加重，進一步導致VVC的復發(fā)。

2 形態(tài)轉(zhuǎn)換

假絲酵母菌是人體常見的一種機會性致病菌，通常無癥狀定植在陰道、口腔、消化道、皮膚上，在不同的宿主環(huán)境因素刺激下可呈現(xiàn)不同的形式，較為常見的有呈球形或橢圓球形的出芽酵母形式和細長的菌絲(假菌絲/真菌絲)形式。酵母相-菌絲相的轉(zhuǎn)換及菌絲相關(guān)基因和毒力因子的表達，如菌絲細胞壁蛋白1(hyphal wall protein-1,HWP1)、細胞延伸程度基因ECEl(extent of cell elongation)編碼的念珠菌溶素酶、分泌型天冬氨酸蛋白酶(secretory aspartyl proteinases,SAPs)或凝集素樣序列3(agglutinin-like sequence 3,ALS3)基因，促進假絲酵母菌的粘附、侵襲、營養(yǎng)獲取、宿主細胞損傷和免疫逃避等[11]。

2.1 信號傳導通路與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和生物合成途徑相關(guān)的機制

假絲酵母菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換受多種轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)的嚴格調(diào)控，當宿主環(huán)境因素變化或營養(yǎng)缺乏時(包括血清、溫度、中性/堿性pH、氮缺乏、碳缺乏、低氧、N-乙酰氨基葡萄糖)，這些轉(zhuǎn)錄因子會通過多種途徑發(fā)出信號激活或抑制菌絲轉(zhuǎn)換通路[12]。研究較多的有環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP-protein kinase A,cAMP/PKA)通路、絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路、轉(zhuǎn)錄因子Rim101(regulator of IME2)介導的PH信號通路、轉(zhuǎn)錄阻遏物Tup1(dTMP-UPtake) 介導的負調(diào)控信號通路，它們通過調(diào)節(jié)其下游的轉(zhuǎn)錄因子抑制菌絲的生長發(fā)育。除此之外，Kadosh[13]發(fā)現(xiàn)白色念珠菌TLO基因家族的基因組擴張導致更大的“游離”TLO蛋白庫，通過與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄激活因子競爭與共激活因子的結(jié)合，導致負向絲狀生長調(diào)節(jié)基因 (negative filamentous growth regulator gene，NFG)不被激活，細胞以絲狀生長；組蛋白調(diào)節(jié)基因HIR1(Histone regulation-1)是復制非依賴性組蛋白伴侶復合體的關(guān)鍵成分，HIR缺失導致菌絲特異基因(hyphal-specific gene,HSG)表達的幅度降低，絲狀減少；熱休克轉(zhuǎn)錄因子(heat shock factor-1,HSF1)是假絲酵母菌對熱休克反應的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過增加正向絲狀生長調(diào)控因子[如UME6(unscheduled meiotic gene expression 6)]和減少負向調(diào)控因子NRG1(negative regulator of glucose-controlled genes 1)的表達促進高水平的絲狀化，還可通過依賴表皮生長因子(epidermal growth factors-1，Efg1)的途徑和通過抑制熱休克蛋白(heat shock protien-90，Hsp90)伴侶的功能促進細絲形成；除了許多已知的絲狀化調(diào)節(jié)因子的研究，有報道抑制麥角甾醇和N-連接的糖基化兩條生物合成途徑也可以抑制酵母-菌絲的轉(zhuǎn)換。

2.2 菌絲相關(guān)基因和毒力因子在外陰陰道假絲酵母菌病發(fā)病機制中的作用

菌絲相關(guān)基因和毒力因子的表達在VVC的發(fā)病機制中扮演重要角色，尤其是ECEl編碼的念珠菌溶素是驅(qū)動損傷和外陰陰道免疫發(fā)病的關(guān)鍵，一方面激活NLRP3炎性體激活先天免疫，另一方面直接破壞陰道黏膜，釋放損傷相關(guān)分子模式(demage associated molecular pattern，DAMP)進一步放大陰道黏膜的先天免疫病理信號[14]。有研究發(fā)現(xiàn)ECEl在檢測的所有VVC患者中表達上調(diào)，而在無癥狀攜帶者中不表達；敲除ECEl可顯著降低小鼠陰道內(nèi)感染(中性粒細胞、促炎細胞因子、警報蛋白)和組織損傷的免疫病理標記物[9]。此外有研究發(fā)現(xiàn)念珠菌溶素與宿主細胞膜的直接相互作用是導致單核巨噬細胞死亡的另一途徑，與炎性小體和焦亡無關(guān)。SAP的表達使真菌能夠粘附或入侵和破壞宿主組織，有研究發(fā)現(xiàn)天冬氨酸蛋白酶家族尤其是SAP2，SAP6可以通過激活NLRP3炎性體和caspase-1引起IL-1β和IL-18產(chǎn)生，且SAP可以通過多種途徑介導細胞因子的產(chǎn)生，這可能促進假絲酵母菌炎癥過度反應[15]。但有研究發(fā)現(xiàn)，SAP2和SAP5在大部分菌絲缺陷的Efg1Δ/Δ、假絲酵母菌假菌絲調(diào)控因子cph1(candida pseudo hyphal regulator 1)Δ/Δ背景中的過表達不會引起黏膜損傷或炎癥，認為菌絲似乎是增強這種活性所必需的[16]。由此可見，了解環(huán)境信號如何調(diào)節(jié)白色念珠菌形態(tài)的發(fā)生，以及菌絲相關(guān)基因和毒力因子的表達對理解VVC發(fā)病機制和開發(fā)新的治療策略具有重要意義。

3 細菌與白色念珠菌相互作用

正常人陰道中寄居有各種各樣的微生物群(如細菌、真菌、支原體等)，它們間的相互作用共同維持陰道微生態(tài)的平衡，一旦打破就會出現(xiàn)各種陰道的感染性疾病，如細菌性陰道炎、念珠菌性陰道炎等[17]。其中細菌為代表的乳桿菌屬作為陰道的優(yōu)勢桿菌，可以通過分解陰道上皮的糖原維持陰道的酸性環(huán)境、分泌過氧化氫或細菌素、減少真菌與陰道黏膜的粘附等抑制或殺滅其他病原微生物，因此，被視為治療或預防VVC有前途的益生菌[18]。有研究證實陰道乳桿菌可以抑制假絲酵母菌的生長、形態(tài)轉(zhuǎn)換，尤其是卷曲乳桿菌[19]。這可能是通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄阻遏基因NRGl的表達，下調(diào)菌絲特異性基因ALS3、HWP1和ECEl的表達抑制菌絲形成。這與Jang SJ等[20]研究結(jié)果一致，即乳桿菌上清液處理組中菌絲相關(guān)基因ALS3、ECEl、SAP5和HWP1的表達顯著下調(diào)，且中性pH條件下的抗真菌活性不受熱滅活和蛋白水解酶處理的影響。

群體感應是一種以響應周圍微生物群落的細胞密度和物種組成的變化，是微生物間能夠集體改變行為的細胞間交流過程[21]。法尼醇是第一個從真菌中分離出來的群體感應分子，是真菌麥角固醇生物合成過程中的中間產(chǎn)物，它可以通過抑制假絲酵母菌向菌絲的轉(zhuǎn)換、誘導菌絲向酵母的轉(zhuǎn)換、抑制假絲酵母菌生物膜形成、以及誘導假絲酵母菌的凋亡來降低假絲酵母菌的毒力[22]。但有研究證明法尼醇在高濃度情況下不會影響陰道乳酸桿菌的生長，但是可能會影響對陰道上皮的粘附性[23]，法尼醇的這一特性提示作為VVC治療的輔助抗菌劑以及陰道環(huán)境維持的安全性仍然需要進一步探索。

Swidsinski等[24]針對VVC婦女的陰道組織活檢研究發(fā)現(xiàn)，真菌不均勻地侵襲在活檢的陰道上皮表面，且真菌的浸潤常伴有細菌(乳桿菌、加德納氏菌和阿托波氏菌最常見)成分的共同侵入，細菌可均勻地分布在真菌侵襲的深度(加德納菌和乳桿菌較為典型)，也可集中在真菌侵襲的前沿(乳桿菌多見)，真菌與細菌的相互作用可能有助于真菌從腐生型向侵襲型的轉(zhuǎn)變(見圖1、圖2，見彩插1)。

以上介紹了VVC與NLRP3相關(guān)的免疫學機制、形態(tài)轉(zhuǎn)換、以及細菌與真菌的相互作用，并提出NLRP3炎性體相關(guān)焦亡在VVC患者陰道炎癥過度激活中的重要性、白色念珠菌的形態(tài)控制機制可能是重要的抗真菌靶標以及假絲酵母菌感染過程中伴有細菌的移位對陰道上皮的作用可能成為VVC易復發(fā)的另一機制，值得進一步研究。明確這些機制可能會為VVC的治療提供新的思路，從而提高患者的生活質(zhì)量。