循環(huán)腫瘤DNA在婦科惡性腫瘤中的應(yīng)用

陳霜，馬蓉，馬彩玲

循環(huán)腫瘤DNA (circulating tumor DNA，ctDNA)是指腫瘤細(xì)胞DNA脫落或者當(dāng)腫瘤細(xì)胞凋亡后釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的DNA，是一種無細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA，廣泛存在于血液、滑膜液和腦脊液等體液中，其主要是由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，以DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物或游離DNA兩種形式存在，是一種特征性的腫瘤生物標(biāo)志，通過ctDNA檢測(cè)，能夠檢出血液中的腫瘤蹤跡。ctDNA作為液體活檢的一種，有時(shí)也被直接稱為液體活檢。

1 循環(huán)腫瘤DNA的生物學(xué)特征

在1948年，Mandel和Metais發(fā)現(xiàn)了健康個(gè)體血液中存在游離的雙鏈DNA片段(cell free DNA,cfDNA)[1]。在1977年，有研究表明不同類型癌癥患者血液中cfDNA的水平不同[2]。由于在癌癥患者血液檢測(cè)到突變的RAS基因片段，cfDNA的臨床潛力得到了承認(rèn)[3-4]。cfDNA可以在健康人群中檢測(cè)到，通常小于100 ng/mL，而腫瘤患者通常是10～40倍[5-6]。ctDNA是cfDNA的一部分，來源于腫瘤細(xì)胞，且僅見于腫瘤患者體內(nèi)。從非癌細(xì)胞向外周血和其他體液中釋放cfDNA的確切機(jī)制以及其生物學(xué)特性尚不清楚，ctDNA可能通過多種機(jī)制起源于腫瘤細(xì)胞，包括凋亡、壞死和細(xì)胞外囊泡和循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC)的活性分泌[7-9]。ctDNA具有原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤相同的遺傳物質(zhì)和表觀遺傳改變，具有無創(chuàng)評(píng)估癌癥的潛能。幾乎所有存在于癌細(xì)胞中的分子改變都可以在ctDNA中檢測(cè)到，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)、微衛(wèi)星位點(diǎn)、雜合子丟失(LOH)、突變、pol 多態(tài)性、甲基化和拷貝數(shù)變化等[10-11]。ctDNA水平也受疾病嚴(yán)重程度和許多其他因素的影響，如腫瘤位置、血管和細(xì)胞周期等[8,12- 13]。大多數(shù)的肝癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌和轉(zhuǎn)移性癌患者以及頭頸部神經(jīng)母細(xì)胞瘤和黑色素瘤患者，都可以檢測(cè)到相當(dāng)水平的ctDNA，而腫瘤定位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)或有黏液特征的腫瘤(如前列腺和甲狀腺)通常只能檢測(cè)到較低水平的ctDNA或不可檢測(cè)到ctDNA[8,14]。由于通過腎臟、肝臟和脾臟的淋巴循環(huán)迅速清除，ctDNA在循環(huán)中有一個(gè)可變的半衰期，據(jù)報(bào)道平均在15 min左右[5]。而且，對(duì)于一個(gè)腫瘤患者來說，ctDNA來源于個(gè)別癌癥病變的比例還取決于腫瘤的解剖位置和大小。此外，CTCs和轉(zhuǎn)移性病變的存在也有助于ctDNA的產(chǎn)生[15]。

2 循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)的相關(guān)技術(shù)

cfDNA是高度片段化的DNA，ctDNA的總量約僅占cfDNA總量的0.01%，其極低的濃度給ctDNA的檢測(cè)帶來了挑戰(zhàn)，特別是在腫瘤發(fā)展的早期階段[16-18]。目前主要有兩大類檢測(cè)ctDNA的方法，第一類是采用靶向測(cè)序的方法，利用原發(fā)腫瘤中已知的單個(gè)或幾個(gè)腫瘤特異性突變來監(jiān)測(cè)外周血中的特異性改變，這些技術(shù)包括高通量測(cè)序技術(shù)(NGS)、數(shù)字PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)PCR技術(shù)等，該方法需要有關(guān)腫瘤基因組的詳細(xì)信息，而該方法敏感性較高，可以快速檢測(cè)到等位基因頻率低至0.01%的突變，且具有較高特異性[19-21]。第二種方法是非靶向測(cè)序，旨在進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)的拷貝數(shù)畸變分析(CNAs)[22]或通過全基因組測(cè)序(WGS)或全外顯子組測(cè)序(WES)點(diǎn)突變分析[23]。非靶向篩查方法既能夠識(shí)別在腫瘤治療期間發(fā)生的新變化，又不需要有關(guān)原發(fā)腫瘤基因組的信息，但是為了可靠地重建腫瘤特異性全基因組變化需要高濃度的ctDNA。非靶向測(cè)序方法由于成本高、檢測(cè)周期長(zhǎng)、數(shù)據(jù)分析難度較大，而且總體靈敏度較低(5%～10%)[23]，難以應(yīng)用于臨床。

3 循環(huán)腫瘤DNA在婦科惡性腫瘤中的應(yīng)用

3.1 循環(huán)腫瘤DNA與卵巢癌

在卵巢癌的診斷方面，ctDNA有重要的臨床意義，Phallen等[24]發(fā)現(xiàn)在42例入組的卵巢癌患者中，有71%的患者能檢測(cè)出相當(dāng)水平的ctDNA；Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)在I期卵巢癌中，cfDNA的敏感性和特異性(分別為85.3%和90.5%)比CA125(分別為56.1%和64.15%)更高。而Parkinson等[26]發(fā)現(xiàn)在一組高級(jí)別漿液性卵巢癌患者中，ctDNA水平與腫瘤體積之間也有很強(qiáng)的關(guān)系，說明ctDNA在評(píng)估腫瘤負(fù)擔(dān)中具有潛在價(jià)值。Kamat等[27]在一項(xiàng)小鼠研究中證實(shí)ctDNA水平升高表明腫瘤負(fù)擔(dān)增加。特定ctDNA突變的存在甚至被確定為卵巢癌患者總生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[28]，Siravegna等[29]發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者ctDNA水平與術(shù)后殘余腫瘤負(fù)荷>1 cm(P=0.0001)和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高(P=0.002)顯著相關(guān)。在卵巢癌的復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)方面，ctDNA可能提供無法通過影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)的復(fù)發(fā)性病變。一項(xiàng)研究表明，ctDNA可以比CT掃描提早7個(gè)月診斷出復(fù)發(fā)的卵巢癌病例[30]。Martignetti等[31]采用一種高敏感性和高特異性的生物標(biāo)記物，即成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(FGFR2)融合ctDNA的生物標(biāo)記物，在對(duì)特定卵巢癌患者進(jìn)行為期4年的隨訪期間進(jìn)行的28項(xiàng)測(cè)量中，F(xiàn)GFR2融合比CA125更好地反映了疾病的演變，特別是腫瘤復(fù)發(fā)。

綜上所述，ctDNA對(duì)于卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)、治療和預(yù)后及復(fù)發(fā)檢測(cè)有十分重要的臨床意義，也是基礎(chǔ)和臨床科研工作者研究的熱點(diǎn)，對(duì)于卵巢癌這種起病隱匿、病死率高的疾病，希望能通過探索ctDNA與卵巢癌的臨床意義，對(duì)卵巢癌的篩查、診斷及治療預(yù)后提供重要依據(jù)，取得突破性進(jìn)展。

3.2 循環(huán)腫瘤DNA與子宮內(nèi)膜癌

ctDNA在子宮內(nèi)膜癌方面研究雖然相對(duì)較少，但仍有研究表明ctDNA具有作為識(shí)別不同組織學(xué)亞型和等級(jí)的子宮內(nèi)膜癌復(fù)發(fā)的高度敏感的生物標(biāo)志物的潛力。Moss等[32]報(bào)道ctDNA可以監(jiān)測(cè)正在接受治療的子宮內(nèi)膜癌患者。Margolin等[33]開展了一項(xiàng)研究，以檢測(cè)包括42例子宮內(nèi)膜癌患者在內(nèi)的5種類型腫瘤中ZNF154CpG島的甲基化程度，除組織樣本外，他們的研究還使用了ctDNA的計(jì)算模擬(1%的腫瘤DNA，99%的正常DNA)，結(jié)果以0.79的AUC表明其在子宮內(nèi)膜腫瘤中表現(xiàn)出很好的性能。有相關(guān)研究表明ctDNA可在較早的時(shí)間點(diǎn)識(shí)別非有效療法，而無需等待對(duì)疾病反應(yīng)的影像學(xué)評(píng)估。目前關(guān)于子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)研究很少，可能是由于子宮內(nèi)膜癌早期癥狀較明顯，且通過較簡(jiǎn)單的活檢方法就可以獲得病理學(xué)標(biāo)本，但并不代表生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的臨床意義較小，因此探索ctDNA對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的臨床意義仍是基礎(chǔ)和臨床工作者研究的重要方向。

3.3 循環(huán)腫瘤DNA與宮頸癌

人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵一步，已有研究表明，幾乎所有宮頸癌組織都能發(fā)現(xiàn)HPV遺傳物質(zhì)[34]。兩種特殊的HPV亞型，HPV16和HPV18導(dǎo)致70%以上的宮頸癌，包括宮頸鱗狀細(xì)胞癌和腺癌[34]。有研究表明宮頸癌患者血漿或血清中的HPV ctDNA在宮頸癌的診斷中具有極好的準(zhǔn)確性[35]。最近的研究表明，大多數(shù)超過I期的宮頸癌患者都可檢測(cè)到ctDNA，而且ctDNA的濃度反映了腫瘤的嚴(yán)重程度[36]。由于將HPV整合到人類基因組中是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵部分[37]，而且病毒基因序列與人類基因不同，所以血液中HPV DNA的檢測(cè)可能反映治療前的腫瘤負(fù)擔(dān)和治療后觀察期間的復(fù)發(fā)信號(hào)。由于HPV的DNA序列與人類基因組有很大的不同，因此在ctDNA中可以更容易地檢測(cè)到HPV DNA，遺憾的是，通過常規(guī)PCR只能發(fā)現(xiàn)12%～45%的宮頸癌患者[38-39]。由于目前宮頸癌篩查項(xiàng)目和疫苗接種技術(shù)已經(jīng)較成熟，所以關(guān)于宮頸癌ctDNA的相關(guān)研究較少，但是探索宮頸癌生物學(xué)標(biāo)志物，通過液體活檢比傳統(tǒng)病理學(xué)活檢有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，如無創(chuàng)、更早發(fā)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)，因此探索ctDNA對(duì)于宮頸癌的臨床意義也十分重要。

4 結(jié)論與展望

基于液體活檢的ctDNA分析已迅速成為在患者監(jiān)測(cè)的許多階段進(jìn)行無創(chuàng)癌癥評(píng)估的有效策略，液體活檢可以通過釋放到血液循環(huán)中的不同生物標(biāo)志物提供有關(guān)腫瘤的生物學(xué)和臨床特征等有價(jià)值的信息?？梢酝ㄟ^定量檢測(cè)血液樣本中的ctDNA或通過檢測(cè)突變來分析整個(gè)腫瘤基因組。過去幾年中，有研究表明了ctDNA檢測(cè)和分析技術(shù)的顯著進(jìn)步，例如，基于NGS的方法在克服許多降低ctDNA檢測(cè)的錯(cuò)誤率和提高靈敏度的挑戰(zhàn)方面取得了重大進(jìn)展。盡管如此，基于NGS的方法仍然相對(duì)昂貴并且消耗大量時(shí)間。而基于實(shí)時(shí)PCR的技術(shù)進(jìn)行的分析具有成本效益、快速且對(duì)于有限數(shù)量的生物標(biāo)記物在常規(guī)臨床實(shí)踐中是可行的。這些技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)一步發(fā)展將使ctDNA在癌癥診斷領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。因此探索更經(jīng)濟(jì)、靈敏度和特異度更高的ctDNA檢測(cè)方法具有十分重要的臨床意義。婦科惡性腫瘤目前仍然困擾著臨床工作者，ctDNA因具有無創(chuàng)、精準(zhǔn)、比傳統(tǒng)檢查更早出現(xiàn)改變等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前科研工作者的重要研究方向，廣大基礎(chǔ)和臨床科研工作者正在努力探索更好的檢測(cè)方法，改進(jìn)液體活檢的技術(shù)，提高檢測(cè)的靈敏度和特異度。雖然目前ctDNA檢測(cè)尚處于臨床前階段，但是相信在不久的將來，液體活檢成為臨床輔助檢查，結(jié)合其他臨床檢查更好地指導(dǎo)臨床。