冠心病不同證候的蛋白質(zhì)組學研究進展*

葉嘉豪，胡志希，楊 夢，鐘森杰，邱 宏，熊霞軍

（湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208）

冠心病是由于冠狀動脈粥樣硬化病變所導致血管狹窄或阻塞而引發(fā)心肌組織缺血、壞死而引起的心臟病[1]。本病在中醫(yī)學中屬“胸痹、真心痛”范疇，以膻中或左胸部發(fā)作性憋悶、疼痛為主要臨床表現(xiàn)。根據(jù)《中國心血管病報告2018》統(tǒng)計[2]，我國目前估計心血管病現(xiàn)患病總?cè)藬?shù)為2.9億，其中冠心病患者為1100萬。冠心病中醫(yī)證候分布調(diào)查顯示[3]，冠心病主要中醫(yī)證候為心血瘀阻（23.75%）、痰濁內(nèi)阻（20.00%）、氣虛血瘀（13.75%）、氣陰兩虛（11.25%）、痰瘀互阻（8.75%），說明瘀、痰、氣虛、陰虛在冠心病的形成中占主導地位，是導致冠心病發(fā)作的關鍵因素。目前蛋白質(zhì)組學已廣泛應用于冠心病研究中，冠心病的病理過程中伴隨著蛋白質(zhì)組學的改變，應用蛋白質(zhì)組學有助于冠心病的診斷及辨證分型。筆者就近年來的研究進展作一綜述，闡明其診斷價值，為后續(xù)研究提供借鑒。

1 蛋白質(zhì)組學在冠心病疾病診斷中的應用

蛋白質(zhì)組學通過收集冠心病患者的血漿、尿液等樣本，進行蛋白質(zhì)組學檢測，尋找與正常個體的差異蛋白，并闡明與之相關的生物學信息。

1.1 血漿蛋白質(zhì)組學冠心病血漿蛋白質(zhì)組學目前檢測方法有同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）技術等，iTRAQ技術具有分離能力強、分析范圍廣、結果可靠、分析時間快、自由化程度高等優(yōu)點，而LC-MS技術具有靈敏度及可重復性高、價格經(jīng)濟等優(yōu)點[4-7]。區(qū)文超等[8]運用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）技術檢測冠心病患者和健康人的血漿樣本，結果發(fā)現(xiàn)絲束蛋白-2、膜聯(lián)蛋白、凝集素、PGAM1、FGG、IGKC等存在差異。郭志鵬[9]通過iTRAQ技術測量冠心病患者與正常人的血漿樣本，結果顯示，上調(diào)的差異蛋白有35個，涉及凝血因子XIII B鏈、血小板因子4及分泌型卷曲相關蛋白等多個蛋白；下調(diào)的差異蛋白有41個，涉及維生素D結合蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及備解素等蛋白。KRISTENSEN L P等[10]運用iTRAQ技術研究冠心病患者的血漿樣本，認為黏著斑蛋白可作為冠心病的一種新標記物。

目前在冠心病血漿蛋白質(zhì)組學上，與健康人群比較，冠心病患者存在凝血、補體激活、脂類代謝、參與炎癥反應等多個層面的生物學改變，如絲束蛋白-2可促進受損內(nèi)膜聚集，繼而引起冠心病的發(fā)生；膜聯(lián)蛋白涉及調(diào)控細胞增殖凋亡、細胞黏附等作用，冠脈狹窄程度與其高表達相關，說明冠心病在發(fā)生發(fā)展時，存在凝血、免疫、脂質(zhì)代謝等多系統(tǒng)紊亂。目前通過運用多種檢測技術測量患者的血漿成分，能夠較為全面地分析其存在差異，也為后續(xù)科研提供數(shù)據(jù)支持。

1.2 尿液蛋白質(zhì)組學尿液蛋白質(zhì)組學相對于血漿蛋白質(zhì)組學，具有采集簡單、無創(chuàng)、容易連續(xù)性獲得的優(yōu)點，并且某些蛋白質(zhì)由于入血后快速經(jīng)腎臟代謝入尿，所以尿液蛋白質(zhì)組學還能檢測出某些特定的蛋白質(zhì)[11]。GISTER A等[12]通過ELISA檢測患者心肌梗死后1 h的尿液，發(fā)現(xiàn)hh-FABP能輔助診斷超早期急性心肌梗死。LEE M Y等[13]運用LC-MS技術檢測不穩(wěn)定型心絞痛患者與對照組的尿液樣本。結果顯示：與對照組比較，冠心病患者中表達上調(diào)蛋白為CD14，并認為CD14能大規(guī)模診斷、篩查早期冠心病心絞痛患者。國外有學者通過尿蛋白質(zhì)組學技術發(fā)現(xiàn)尿纖維蛋白、尿微量白蛋白、尿肝型脂肪酸結合蛋白等可作為臨床診斷冠心病的依據(jù)[14-16]。

尿液蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者與健康人在免疫、凝血等系統(tǒng)存在差異，如冠心病發(fā)病時，機體纖維蛋白原水平快速升高，導致血液處于高凝狀態(tài)，繼而導致腎功能受損，腎小球濾過功能下降，導致出現(xiàn)尿微量蛋白及尿肝型脂肪酸結合蛋白等指標的異常，因此可以通過尿液蛋白質(zhì)組學技術輔助冠心病的診斷。

2 冠心病中醫(yī)證候蛋白質(zhì)組學研究

蛋白質(zhì)組學可為冠心病的診斷治療提供輔助依據(jù)，同時也為中醫(yī)學研究冠心病“證”之間存在的差異提供了技術支持。對不同證候的樣本進行蛋白質(zhì)組學研究，篩選出差異蛋白，可研究該蛋白能否作為該證候診斷的金標準[17]。

2.1 冠心病“實證”蛋白質(zhì)組學研究冠心病是本虛標實、虛實夾雜的復合性疾病，標實以血瘀、痰飲、痰瘀為主，其中血瘀是冠心病致病的關鍵[18]，也是冠心病最常見、最多發(fā)的中醫(yī)證型。痰證和痰瘀互結證在發(fā)病早期所占比例較少[19]，但隨著病情的演變，中后期以痰證和痰瘀互結證為主。

2.1.1 血瘀證 冠心病血瘀證為目前研究熱點之一，研究發(fā)現(xiàn)與正常人比較，血瘀證存在凝血功能異常、血脂異常及炎癥反應異常，具體表現(xiàn)為全血黏度增高，血小板活化，血流動力降低，血液處于高凝狀態(tài)。以上可作為冠心病血瘀證辨證的依據(jù)。李雪峰等[20]運用MALDI-TOF-MS技術檢測冠心病心血瘀證患者與正?；颊叩难獫{樣本，發(fā)現(xiàn)CD41和Actinγ等7種差異蛋白，并認為CD41和Actinγ有望成為冠心病心血瘀證的標記蛋白。周倩倩等[21]通過MALDI-TOF-MS技術檢測冠心病心血瘀證患者和正常人的血漿樣本，發(fā)現(xiàn)差異蛋白為視黃醇結合蛋白、結合珠蛋白、血清白蛋白、載脂蛋白。趙慧輝等[22]應用HDMS與UPLC聯(lián)用檢測冠心病心血瘀證患者和健康人血漿樣本，發(fā)現(xiàn)上調(diào)蛋白13種，根據(jù)功能分為急性時相反應蛋白、補體蛋白、細胞骨架蛋白、凝血相關蛋白；下調(diào)蛋白12種，根據(jù)功能分為載脂蛋白、運輸?shù)鞍?、抗凝血相關蛋白、免疫球蛋白、細胞骨架調(diào)控蛋白。肖隋熙[23]應用iTRAQ技術檢測78例冠心病心血瘀證患者和34例冠心病非心血瘀證患者的血漿差異蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)11個上調(diào)的差異蛋白和16個下調(diào)的差異蛋白。其差異蛋白功能主要涉及細胞遷移、細胞損傷表達、細胞變性等。

以上研究分別運用MALDI-TOF-MS技術、iTRAQ技術、HDMS與UPLC聯(lián)用技術，檢測冠心病血瘀證與正常模型組的血液樣本，并發(fā)現(xiàn)其差異涉及炎癥反應、凝血功能、免疫反應、脂質(zhì)代謝等，具體差異蛋白為CD41、視黃醇結合蛋白、結合珠蛋白、血清白蛋白、載脂蛋白等。說明在疾病初期血瘀證階段，其病理改變以凝血、炎癥、免疫、脂質(zhì)代謝等通路紊亂為主。瘀血阻滯，導致血液黏稠度增加、微循環(huán)障礙，血流不暢，瘀阻心脈，最終導致了冠心病的發(fā)生。

2.1.2 痰證 冠心病痰證與血瘀證的共同特點為凝血、脂質(zhì)代謝紊亂，但兩者在蛋白質(zhì)組學表達方面均有側(cè)重，痰證以脂質(zhì)代謝異常所導致的“高脂”為主要特點，血瘀證以凝血系統(tǒng)紊亂為主。朱明丹等[24]采用ESI－MS技術對冠心病心氣虛證、心腎陰虛證、痰濁內(nèi)阻證、心血瘀證各9例患者的血清樣本進行蛋白質(zhì)組學研究，發(fā)現(xiàn)與血瘀證比較，痰證上調(diào)蛋白為血清淀粉樣P物質(zhì)、載脂蛋白E、凝溶膠蛋白亞型1、巨噬細胞刺激蛋白1、載脂蛋白H，下調(diào)蛋白為α-2-巨球蛋白、補體C4、補體成分C3、抗凝血酶Ⅲ。宋劍南等[25]利用雙向凝膠電泳-質(zhì)譜技術檢測痰證、血瘀證、痰瘀證患者和正常人的血漿樣本，發(fā)現(xiàn)痰證與血瘀證的差異蛋白為結合珠蛋白前體、腎上腺髓質(zhì)素結合蛋白前體、白蛋白、補體C4。

冠心病痰證主要體現(xiàn)在脂質(zhì)代謝（載脂蛋白E、載脂蛋白H等）、免疫系統(tǒng)（巨噬細胞刺激蛋白1）、凋亡系統(tǒng)（凝溶膠蛋白亞型1）異常，而血瘀證主要體現(xiàn)在補體（補體C4、補體成分C3）、凝血系統(tǒng)（抗凝血酶Ⅲ）等異常。

2.1.3 痰瘀互結證 痰瘀互結證與痰證、血瘀證比較，其特點表現(xiàn)為凝血、脂質(zhì)代謝進一步紊亂，血液處于高凝、高脂狀態(tài)，血流動力進一步降低?！案咧?、高凝”可能為冠心病痰瘀互結證的特點。苗蘭等[26]采用雙向凝膠電泳、基質(zhì)輔助激光解析-飛行時間質(zhì)譜技術檢測小型豬冠心病痰瘀證的心肌組織，結果顯示：與正常組比較，小型豬冠心病痰瘀證載脂蛋白E升高，補體C4降低。宋劍南等[25]發(fā)現(xiàn)與痰證比較，痰瘀互結證的上調(diào)蛋白為纖維蛋白原β鏈、白蛋白、補體C4、血紅蛋白結合蛋白前體、結合珠蛋白前體，下調(diào)蛋白為載脂蛋白AI前體、α-1抗胰蛋白酶片段、簇連蛋白前體等。說明痰瘀互結證、痰證差異蛋白體現(xiàn)在凝血系統(tǒng)（纖維蛋白原β鏈）、補體系統(tǒng)（補體C4）、脂質(zhì)代謝（載脂蛋白AI前體、載脂蛋白E）、血漿轉(zhuǎn)運蛋白（白蛋白）、炎癥反應相關蛋白（α-1抗胰蛋白酶片段、血紅蛋白結合蛋白前體）等方面。

從初期的血瘀證到中期的痰證及痰瘀互結證，冠心病主要以脂質(zhì)代謝指標升高、凝血等指標下降為主要表現(xiàn)。該結論可能與疾病的傳變存在一定關聯(lián)，血瘀證引起氣血的停滯，氣滯無力推動津液運行，或血瘀迫津外出，導致痰濁的內(nèi)停；而痰濁內(nèi)停也會引起氣血津液的停滯，最終引起血瘀證的發(fā)生或加重，兩者導致疾病螺旋發(fā)展，最終形成“痰瘀互結證”?！疤怠焙汀梆觥痹诓±砩匣ビ袀?cè)重，如痰證在脂質(zhì)代謝異常方面較明顯，可能由于痰濁內(nèi)停，損傷脾陽，導致運化功能失常，從而導致人體脂質(zhì)代謝功能的紊亂；而凝血系統(tǒng)異常主要以血瘀證、痰瘀互結證較明顯，可能因為血瘀導致氣血流動不暢，血流動力下降引起血液黏稠，進而導致凝血、補體指標升高。

2.2 冠心病“虛證”蛋白質(zhì)組學研究冠心病病機為本虛標實、虛實夾雜，本虛以心氣虛證、心腎陰虛證為主，其發(fā)病初期比例低于血瘀證，但是隨著疾病的發(fā)展，后期主要以心腎陰虛證、氣虛證等虛證為主。

2.2.1 心腎陰虛證 王剛等[27]采用熒光差異蛋白電泳、質(zhì)譜技術檢測冠心病心血瘀證與心腎陰虛證患者的血漿差異蛋白，結果顯示：與心腎陰虛證比較，心血瘀證患者的α2巨球蛋白、載脂蛋白A1、載脂蛋白E、補體C3、補體C1q亞成分亞基C、血紅素結合蛋白和激肽酶蛋白含量較高，而聚集素、血清淀粉樣P物質(zhì)含量較低。朱明丹等[24]發(fā)現(xiàn)，與心腎陰虛證比較，冠心病血瘀證的上調(diào)蛋白為血紅素結合蛋白、載脂蛋白E、α2巨球蛋白、載脂蛋白A-I、補體C1、載脂蛋白4前體、補體C3、激肽酶-1蛋白，下調(diào)蛋白為聚集素、血清淀粉樣P物質(zhì)。

上述2項研究結果大致相同，說明冠心病心腎陰虛與血瘀證的差異蛋白為補體C3、補體C1、載脂蛋白A1、載脂蛋白4前體、載脂蛋白E、α2巨球蛋白、激肽酶-1蛋白、血紅素結合蛋白、聚集素、血清淀粉樣P物質(zhì)，其差異蛋白主要涉及補體系統(tǒng)（補體C3、補體C1）、脂質(zhì)代謝（載脂蛋白A1、載脂蛋白4前體、載脂蛋白E）、激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（激肽酶-1蛋白）、阿爾茨海默信號通路（聚集素、血清淀粉樣P物質(zhì)），可用于作為辨別心血瘀證與心腎陰虛證的指標，同時其含量的降低可能為心腎陰虛證形成的內(nèi)在基礎。

2.2.2 心氣虛證 袁宏偉等[28]采用雙向電泳-質(zhì)譜技術對冠心病心氣虛證和心腎陰虛證患者的血漿進行分析，結果顯示，與心腎陰虛證比較，心氣虛證患者的上調(diào)蛋白為血紅素結合蛋白、補體C7、補體C3、補體C4-A、凝血酶原、血漿血管舒緩素，下調(diào)蛋白為α2巨球蛋白、富含組氨酸糖蛋白、載脂蛋白4前體、甘露糖結合蛋白C、載脂蛋白D、載脂蛋白A-I、活化T細胞核因子5亞型b、纖溶酶原、補體因子H亞型1。朱明丹等[24]發(fā)現(xiàn)，與心血瘀證比較，氣虛證患者的上調(diào)蛋白為補體C3、α2巨球蛋白、補體C4-A、血紅素結合蛋白、補體C7、結合珠蛋白亞型1、血漿血管舒緩素、抗凝血酶Ⅲ，下調(diào)蛋白為CPN1、羧肽酶N催化鏈、聚集素。

以上2項研究說明氣虛證補體C3、補體C4-A、補體C7、血紅素結合蛋白、血漿血管舒緩素的含量低于血瘀證、心腎陰虛證；差異指標主要涉及補體（補體C3、補體C4-A、補體C7）、激肽系統(tǒng)（血漿血管舒緩素）及炎癥反應相關蛋白（血紅素結合蛋白）；血瘀證、氣虛證以上指標存在一定差異，可能為初期以血瘀證為主，血瘀導致氣血津液的停滯，故會導致補體、激肽、免疫系統(tǒng)異常，以及炎癥相關蛋白、脂質(zhì)代謝紊亂等蛋白質(zhì)異常；而血瘀日久，耗傷正氣，最終由實轉(zhuǎn)虛，屬于由實轉(zhuǎn)虛的過程，故其病理特點并非器質(zhì)性病變，而是以氣虛無力固攝血液的生理性改變，故凝血因子含量會有所下降；同時氣虛不能固表，衛(wèi)氣虧虛導致了自身免疫功能下降[29]，推斷出冠心病后期氣虛證的主要特征為炎癥反應、免疫系統(tǒng)、脂質(zhì)代謝等方面的蛋白質(zhì)含量降低。

2.3 總結目前冠心病中醫(yī)證候蛋白質(zhì)組學在實驗中已經(jīng)初步揭示出正常人、冠心病患者及其不同證型之間的差異蛋白，一定程度上說明蛋白組學與中醫(yī)證候演變的相關性，可為以后研究疾病演變規(guī)律及證的本質(zhì)研究提供數(shù)據(jù)基礎。蛋白質(zhì)組學雖能檢測出差異蛋白，但是目前技術仍存在一定局限性[30-32]。

3 該領域所存在的問題及可能的解決方法

3.1 規(guī)范證候診斷目前蛋白質(zhì)組學實驗設計方案復雜多樣，如證候存在規(guī)范標準問題，且證有兼夾，證與證之間存在輕重、先后、主次、標本之別。因此，蛋白質(zhì)組學檢測不能避免由于樣本、動物模型、造模方式、檢測技術方法所導致的蛋白差異[33-36]，即使篩選出不同證型的差異蛋白，但不能確定其與證候間的關聯(lián)程度。其次目前已經(jīng)開展了大量蛋白質(zhì)組學實驗，但對于每個證的蛋白組“金標準”還沒有確定等[37]。針對以上研究問題，筆者認為，要進一步完善蛋白質(zhì)組學的相關技術，制訂相應的國家、行業(yè)技術標準，嚴格設計調(diào)查方案和標準操作規(guī)程，控制所有可能影響結果的因素，實驗以人作為對象應盡量控制年齡、環(huán)境、基礎病、人種、居住地、社會壓力、生活方式等所產(chǎn)生的差異；對于實驗動物應嚴格控制造模方式、檢測技術、種類、數(shù)據(jù)處理的方法等；開展大規(guī)模、大樣本的臨床研究，增加樣本量，從中獲得大量高質(zhì)量、可信度高的數(shù)據(jù)；重復實驗，驗證結果，進一步完善和制定符合臨床實際的證候診斷標準，最終得到其證候診斷的金標準。

3.2 優(yōu)化研究設計冠心病蛋白質(zhì)組學研究多集中于單一證型上，而中醫(yī)證型往往存在證候錯雜，單一證型不能滿足中醫(yī)證候的復雜性[38]；目前的研究缺乏對中醫(yī)異病同治的深入探討，缺乏了對于疾病綜合了解。筆者認為，可以根據(jù)西醫(yī)冠心病辨病分期及中醫(yī)辨證分型，進行樣本再細化，滿足中醫(yī)證型上復雜性，更深層次挖掘中醫(yī)證候的本質(zhì)。

3.3 創(chuàng)新技術手段目前中醫(yī)對蛋白質(zhì)組學還存在這一些問題，如對海量信息的分析處理能力、對小分子蛋白處理能力不足等[39-41]。筆者認為，目前應開展多組學技術相互聯(lián)用，整合分子生物學、生物信息學，并建立完善冠心病證型相關的數(shù)據(jù)庫，如“冠心病證候—蛋白質(zhì)表達譜”，結合統(tǒng)計學進行分析，最后通過網(wǎng)絡藥理學、Meta分析進行綜合評價，引入權重量化概念，通過不同的蛋白加權，篩選出區(qū)分中醫(yī)證型標記物及明確各差異蛋白與證候的關聯(lián)程度，為冠心病診治提供科學依據(jù)，降低臨床誤診率及患者發(fā)病率，提高診療效率及患者生活水平，推動中醫(yī)藥精準治療進程，為中醫(yī)藥邁向世界提供實驗數(shù)據(jù)支持。