誘導多能干細胞移植治療脊髓損傷的研究進展

范佳俊，王君杰，陳烽，陳哲

(1.浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310005)

脊髓損傷是脊柱損傷最嚴重的并發(fā)癥，往往導致?lián)p傷平面以下自主運動和感覺的喪失[1]。流行病學調(diào)查顯示，全世界平均每年每百萬人中有40～80人發(fā)生脊髓損傷[2]，其中年輕人占比較大[3]。Edwin Smith早在公元前2500年就認為該病是“不可治愈且不值得治療的”[4]。目前盡管各種治療手段較之前取得了一定進展，但療效仍不能令人滿意，至今仍沒有一種普遍被接受且治療效果顯著的方法用來治療該病[5-6]。近年來，隨著再生醫(yī)學的發(fā)展，尤其是干細胞技術的發(fā)展和應用，脊髓損傷的治療也有了新的方向。誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，IPSCs)是由分化的體細胞經(jīng)過重編程而產(chǎn)生的多能干細胞，兼具干細胞的多種優(yōu)點，有著近似胚胎干細胞的自我更新能力和分化潛能。目前，IPSCs已成為國內(nèi)外干細胞研究領域的熱點。本文就IPSCs治療脊髓損傷的研究進展綜述如下。

1 脊髓損傷的概述

脊髓損傷可分為原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷。原發(fā)性脊髓損傷是由外力直接引起的，通常導致神經(jīng)組織的變形、撕裂，甚至神經(jīng)軸被切斷，這些損傷往往是不可逆的。脊髓損傷后，短時間內(nèi)(幾分鐘)病變部位開始出血，引發(fā)血管痙攣、血栓形成以及脊髓水腫[7]?？梢?，脊髓損傷主要是神經(jīng)損傷和血管結構損傷。在原發(fā)性脊髓損傷后，繼發(fā)性脊髓損傷開始出現(xiàn)，并將持續(xù)幾分鐘至幾個月不等[8]。脊髓損傷后脊髓組織出現(xiàn)水腫，血腦脊髓屏障會被破壞，隨后內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞發(fā)生變性，神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕增生[9]。膠質(zhì)瘢痕增生在脊髓損傷后3 d開始，并在約28 d后達到穩(wěn)定[10]。最終，脊髓受損區(qū)域內(nèi)軸突再生的過程會被提前增生的膠質(zhì)瘢痕阻斷。硫酸軟骨素蛋白多糖是一種與膠質(zhì)瘢痕增生相關的神經(jīng)軸突生長抑制分子，也參與了抑制病變區(qū)脊髓的再生[11]。

2 IPSCs的產(chǎn)生和生物學特性

治療脊髓損傷的重點在于修復、重建損傷的脊髓，以及恢復運動、感覺和自主神經(jīng)功能[12]。神經(jīng)元是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的關鍵細胞，它能啟動新的軸突生長，并最終建立新的突觸連接[13]。軸突的再生需要5個步驟：第1步，從損傷區(qū)進行逆行的信號轉(zhuǎn)導；第2步，將信號輸入細胞核；第3步，軸突生長必不可少的分子轉(zhuǎn)錄和翻譯；第4步，軸突自身生長；第5步，軸突突觸形成[14]。干細胞移植可以為受損區(qū)域提供充足的外源性神經(jīng)元，建立脊髓再生的基礎條件，這為脊髓損傷的治療開啟了新的篇章。神經(jīng)干/祖細胞(neural stem/progenitor cells，NS/PCs)已被證明是所有候選細胞中較為理想的供體細胞[15]。獲取NS/PCs的經(jīng)典方法是使用胚胎干細胞。由胚胎干細胞衍生分化而來的NS/PCs具有修復受損脊髓，促進脊髓損傷模型動物功能恢復的能力[16]。然而，源自人的胚胎組織或胚胎干細胞因涉及倫理問題而受到限制，甚至在某些國家已經(jīng)明確表示禁止使用[17]。為了解決無法使用胚胎組織的這個問題，Yamanaka將Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc這4種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染到小鼠體細胞中，結果發(fā)現(xiàn)小鼠的體細胞經(jīng)過這4種因子的誘導后產(chǎn)生了逆分化現(xiàn)象，形成了多能干細胞，即為IPSCs[18]。這些誘導生成的多能干細胞顯示出與胚胎干細胞相似的特性，同樣具有多重分化能力。干細胞經(jīng)歷分化后，基因被選擇性表達，形成具有特定功能的體細胞，但這些細胞本質(zhì)上并沒有改變自身遺傳物質(zhì)。IPSCs的制備過程就是將分化的細胞在特定條件下逆轉(zhuǎn)，使之擁有無限生長的能力，同時又保持多能性。IPSCs在形態(tài)、蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細胞倍增能力、類胚體及畸形瘤生成、分化能力等方面均與胚胎干細胞相似。IPSCs能分化為所有胚層細胞，分化出成體動物的所有組織和器官。這種源自體細胞的IPSCs不僅解決了倫理問題，而且若細胞來源于患者自身，在臨床使用過程中還可以避免免疫排斥的問題。

3 IPSCs移植治療脊髓損傷的研究現(xiàn)狀

目前，越來越多的研究團隊將IPSCs應用于脊髓損傷的治療，并證明了其有效性。Tsuji等[19]用小鼠IPSCs引導分化后形成神經(jīng)球，并將神經(jīng)球移植到脊髓被挫傷9 d后的小鼠脊髓損傷區(qū)，結果顯示這些源自IPSCs的神經(jīng)球成功地分化為3個細胞譜系，即神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，從而促進了小鼠運動功能的恢復。Nori等[20]將成年人成纖維細胞作為供體細胞來建立人類誘導多能干細胞(human-induced pluripotent stem cells，HIPSCs)，并將這些HIPSCs衍生的神經(jīng)球移植到非肥胖型糖尿病聯(lián)合嚴重免疫缺陷的小鼠脊髓中治療脊髓損傷，結果顯示HIPSCs衍生的神經(jīng)元和受損區(qū)域中的小鼠神經(jīng)元之間形成了突觸連接，而且直至實驗結束時(脊髓損傷后112 d)仍可以觀察到小鼠運動功能的恢復。Kobayashi等[21]通過使用HIPSC-NS/PCs來治療狨猴脊髓損傷，結果證明了IPSCs在靈長類動物脊髓損傷模型中同樣有效，這使得人們更加相信IPSCs未來可以用于治療人類的脊髓損傷。Fujimoto等[22]的研究表明，實驗小鼠運動功能的恢復是由被移植的神經(jīng)元和存活的內(nèi)源性神經(jīng)元共同參與完成的，2種類型的神經(jīng)元均通過形成突觸連接并整合神經(jīng)元回路來重建皮質(zhì)脊髓束。

由于脊髓損傷分為急性損傷和慢性損傷，所以并不是所有的研究在將IPSCs用于治療脊髓損傷時都能取得令人滿意的結果。我們查閱了近10年來所有關于HIPSCs移植治療脊髓損傷的動物實驗研究，其中近90%的實驗研究是在脊髓損傷的急性或亞急性期，即脊髓損傷后14 d內(nèi)移植了HIPSCs。但是否在脊髓損傷的急性期移植HIPSCs就一定有效，目前尚存爭議。Nutt等[23]從一位86歲的男性身上取體細胞建立了HIPSCs，在實驗大鼠脊髓損傷后第14天將其移植到免疫缺陷的脊髓損傷大鼠體內(nèi)，并通過組織學觀察，從受傷區(qū)域的白質(zhì)及灰質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了新生的軸突。Lu等[24-27]報道，在脊髓損傷的慢性期(脊髓損傷4周后)使用HIPSCs進行細胞移植治療，組織學結果均顯示脊髓內(nèi)有新的軸突形成。盡管組織學結果令人滿意，但研究人員并未觀察到受傷大鼠的神經(jīng)功能有任何恢復。Lu等[24-25]報道，將HIPSCs移植到脊髓損傷大鼠體內(nèi)后，并沒有觀察到大鼠下肢功能的顯著改善。Okubo等[26-27]的研究結果顯示，雖然HIPSCs移植治療的時間間隔是最長的(脊髓損傷后42 d)，但均觀察到大鼠下肢神經(jīng)運動功能明顯得到改善。Yousefifard等[28-29]薈萃分析結果顯示，IPSCs移植治療可以改善脊髓損傷大鼠的運動功能，脊髓損傷后治療間隔時間越短后期功能恢復越好。

此外，有學者考慮將手術中極易獲得的椎間盤細胞作為IPSCs的供體細胞。Oh等[30]研究報道，在小鼠脊髓損傷后9 d，將來自椎間盤組織的IPSC-NS/PCs移植到小鼠脊髓中，結果顯示小鼠的后肢功能得到明顯改善。這說明椎間盤這種以前一直被認為在手術中切除后只能被丟棄的組織，有望成為脊髓損傷替代療法的自體細胞來源。

4 IPSCs移植治療脊髓損傷面臨的問題及解決方法

4.1 免疫排斥問題及解決方法免疫排斥問題是IPSCs移植治療脊髓損傷的首要安全問題。自體細胞被誘導生成IPSCs并達到移植條件所需時間至少6個月[17]，這將錯過脊髓損傷治療的最佳時期。因此，使用已生成和測試過的臨床特征良好的同種異體IPSCs則更可行。但是，使用同種異體IPSCs移植治療脊髓損傷，必然會產(chǎn)生免疫排斥問題。

Pomeshchik等[31]報道，對脊髓損傷實驗大鼠僅給予他克莫司作為免疫抑制藥物，不僅遠期生存率較差，而且大鼠下肢運動功能恢復也未得到任何改善。而Romanyuk等[32]報道，將HIPSC-NS/PCs移植到脊髓損傷大鼠體內(nèi)后，給予環(huán)孢素、甲基潑尼松龍和硫唑嘌呤鈉等多種免疫抑制藥物，最終有大鼠存活了下來，且移植的細胞最終分化為中間神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元和運動神經(jīng)元。綜上，我們認為IPSCs可以在免疫抑制的病變區(qū)域內(nèi)存活并發(fā)揮作用，但應當服用合適的免疫抑制藥物。

4.2 長期安全性問題及解決方法IPSCs移植治療脊髓損傷的長期安全性是另一個值得考慮的問題。Nori等[33]報道，在成人真皮成纖維細胞中轉(zhuǎn)染Oct4、Sox2和Klf4因子，建立IPSCs細胞系并將之誘導形成神經(jīng)球后植入脊髓損傷小鼠體內(nèi)，這些神經(jīng)球最終分化為3種譜系的神經(jīng)細胞，在移植47 d后可見小鼠運動功能恢復；然而，到移植103 d時，由于移植區(qū)出現(xiàn)了腫瘤，最終導致小鼠運動功能惡化。IPSCs移植治療脊髓損傷面臨的長期安全性問題是IPSCs有致瘤性。因此，我們認為在采用IPSCs移植治療各種疾病之前，需要建立高度安全可信的IPSCs。IPSCs導致的腫瘤大致可以分為2種類型：一種是畸胎瘤，成熟畸胎瘤通常是一種良性疾病，它由多種不同的組織如皮膚、毛發(fā)、牙齒、骨骼、油脂和神經(jīng)組織等組成；另一種是實質(zhì)性腫瘤，極有可能向惡性發(fā)展，向外周侵襲甚至轉(zhuǎn)移[34]。

目前，畸胎瘤的形成機理尚未完全明確。近些年的研究表明，未分化的IPSCs仍是導致畸胎瘤形成的原因[35-36]。未分化的IPSCs具有與腫瘤細胞一樣的不受限制的分化能力，通過改變MHC-1、Fas或Trail突變來逃避免疫反應，使其可以在宿主中不受限制的分化，從而形成畸胎瘤[37]。Okubo等[35]研究發(fā)現(xiàn)，使用γ-分泌酶抑制劑(gamma-secretase inhibitor，GSI)阻斷Notch信號通路，可以誘導未分化的HIPSC-NS/PCs在體外分化為成熟的神經(jīng)元細胞；通過基因表達譜發(fā)現(xiàn)，GSI能促使神經(jīng)元成熟的標記基因上調(diào)，而與細胞繁殖和自我更新相關的基因標記物下調(diào)；通過組織學觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GSI處理的脊髓損傷區(qū)域中有成熟的分化神經(jīng)元，而未經(jīng)GSI處理的脊髓損傷區(qū)域中細胞呈腫瘤樣過度生長。因此，去除未分化細胞及降低細胞增殖能力可能是防止畸胎瘤形成有效手段?；チ龅男纬蛇€與供體細胞的組織來源有關。Miura等[38]報道，用成人不同組織生成的IPSCs進行移植，發(fā)現(xiàn)畸胎瘤的形成傾向有很大差異；來源于胃上皮細胞的IPSC-NPCs沒有腫瘤形成傾向，而來自成年小鼠尾尖成纖維細胞的IPSCs具有較高的腫瘤形成風險。這表明IPSCs的供體組織不同，其移植后畸胎瘤形成的風險也不同。

但是，有研究[33-34]發(fā)現(xiàn)，即使清除了所有未分化的細胞，在移植區(qū)域仍能發(fā)現(xiàn)實質(zhì)性腫瘤。因此，闡明這些腫瘤的發(fā)生機制就顯得更加重要。與良性畸胎瘤相比，實質(zhì)性腫瘤通常是惡性的，它們有隨時侵襲或擴散到身體其他部位的可能。這些腫瘤發(fā)生的主要機制包括基因組不穩(wěn)定性和表觀遺傳不穩(wěn)定性[39-40]。引起基因組不穩(wěn)定的因素有3個方面原因：第一，IPSCs形成時使用了逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒等整合載體。這些載體可以很容易將目的基因整合到細胞原有的基因組中，但這種整合是非定向的，這也就造成了在整合過程中可能會破壞細胞正常的抑癌基因并形成腫瘤[41-44]。使用GSI預處理移植細胞并使用非整合型仙臺病毒載體，可降低HIPSCs衍生細胞的腫瘤形成率，并提高HIPSCs衍生細胞移植治療的安全性[44-45]。因此，我們建議使用不干擾基因組的無整合方法轉(zhuǎn)染重編程因子，以避免因基因整合引起的致瘤性。第二，Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc這4個轉(zhuǎn)錄因子在各種自然形成的癌癥細胞中也會高表達。有報道表明，在40種癌癥類型中有18種癌癥細胞至少過表達一個重編程基因[46]。第三，成熟的體細胞經(jīng)歷多次分裂并存活很長一段時間才能獲得遺傳突變。在正常情況下，由于不再繁殖復制，這些突變對腫瘤形成的影響微乎其微。但是，如果細胞處在不斷的分裂繁殖期，這種微小的突變就會因為多次復制而被放大，就可能會促使腫瘤形成[47]。除了基因組的不穩(wěn)定性外，表觀遺傳不穩(wěn)定性在腫瘤發(fā)生中也起著重要作用，尤其是DNA甲基化。Iida等[34]報道，癌基因甲基化不足的IPSC-NS/PCs更容易形成腫瘤。

5 小 結

IPSCs作為一種理想型的來源細胞，為未來應用于臨床治療脊髓損傷帶來了希望，但是臨床應用時仍需克服一些問題。首先，要考慮的是腫瘤的形成。通過IPSCs的終末分化，使用無基因整合方法以及建立可靠的移植細胞克隆來降低腫瘤發(fā)生的風險[48]。還可以利用自殺基因，特異性地去除移植區(qū)內(nèi)尚未分化的增殖細胞來降低腫瘤發(fā)生的風險；但是，自殺基因在去除這些細胞后還會影響已經(jīng)具有運動功能的細胞，這會嚴重影響實驗動物運動功能的恢復。其次，免疫抑制劑的使用仍是現(xiàn)階段乃至未來建立短時間內(nèi)獲取安全可靠的自體IPSCs方法之前，解決免疫排斥問題的優(yōu)選方案。未來的研究應更加集中于慢性脊髓損傷的治療，為IPSCs移植治療脊髓損傷打通最后的難關。相信隨著學者們對IPSCs認識及在移植調(diào)控方面研究的不斷深入，IPSCs在脊髓損傷修復中的應用前景將更加廣闊。