敲低程序性死亡配體1抑制人乳腺癌細(xì)胞生長與轉(zhuǎn)移

陸麗峰，周雷升，劉躍貞，陳鵬業(yè)

在過去的幾十年中，通過研究已經(jīng)確定了涉及乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移進(jìn)展的分子改變，從而使得乳腺癌的治療取了里程碑式的進(jìn)展，如靶向雌激素受體(ER)的激素療法和針對致癌蛋白(ERBB2，EGFR，VEGF和PI3K/AKT/mTOR途徑)的靶向療法。然而，由于癌細(xì)胞的高誘變性和適應(yīng)能力，在大多數(shù)情況下出現(xiàn)抗性克隆，使得腫瘤反應(yīng)僅暫時出現(xiàn)。由于免疫反應(yīng)的適應(yīng)性，癌癥免疫療法理論上可以解決這個問題[1]。但乳腺癌的免疫原性低于黑色素瘤或腎細(xì)胞癌，這使得過繼免疫治療(白細(xì)胞介2，干擾素和疫苗)的結(jié)果一直不理想。但在過去十年中出現(xiàn)了免疫的作用證明了腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TILs)存在的良好預(yù)后影響及免疫應(yīng)答的基因表達(dá)特征。

免疫反應(yīng)代表一種復(fù)雜現(xiàn)象，其基于調(diào)節(jié)TIL活性的激活劑和抑制劑途徑之間的平衡。這種平衡可能在某些病理條件下受到干擾，例如癌癥，其中免疫系統(tǒng)的抑制將有利于腫瘤進(jìn)展[2]。一種關(guān)鍵的抑制劑是程序性細(xì)胞死亡1(PD1)-程序性死亡配體1(PDL1)途徑。實際上，有來自不同部位的腫瘤細(xì)胞表達(dá)PDL1，因此可以抑制免疫應(yīng)答。目前已經(jīng)在不同的癌癥中研究了PDL1的表達(dá)，如腎、肺、胰腺、食管、卵巢、結(jié)腸直腸、頭頸部和鱗狀細(xì)胞癌、黑素瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[3-5]，表明了與臨床病理學(xué)腫瘤特征相關(guān)。在乳腺癌中，PD1-PDL1途徑的研究非常少。本研究采用MTT、劃痕實驗及Taswell侵襲實驗檢測PDL1在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的生物學(xué)行為，為乳腺癌的靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、設(shè)備來源 研究材料主要包括正常狀態(tài)下的乳腺細(xì)胞系及癌細(xì)胞系，實驗材料與實驗過程所需相關(guān)硬件設(shè)備、試驗耗材均于美國購回。

1.2 qRT-PCR檢測PDL1的表達(dá) 為實現(xiàn)PDL1的準(zhǔn)確表達(dá)，研究過程中，研究人員借助于RNA抽提試劑對研究過程中涉及到的3種細(xì)胞分別進(jìn)行RNA的提取。在整個研究過程中，為保證提取的有效性，將提取試劑盒保存在-70 ℃環(huán)境內(nèi)。同時研究人員好需要對循環(huán)體系、擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行梳理、完善及優(yōu)化，在明確循環(huán)體系、循環(huán)梳理的基礎(chǔ)上，對循環(huán)的溫度要素等進(jìn)行控制，確保檢測結(jié)果的有效性。

1.3 MTT實驗 實驗過程中，培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞，按照相關(guān)操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，為后續(xù)研究活動的開展提供參考借鑒，確保研究活動的有效性。為保證實驗的準(zhǔn)確性，降低實驗誤差，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞放置于孔板之中，每個組別設(shè)置5個復(fù)孔，并通過霉菌液進(jìn)行飽和處理，飽和處理過程中，使用設(shè)備儀器進(jìn)行低速震蕩處理，震蕩周期控制在10 min，震蕩后的實驗對象使用檢測儀器進(jìn)行指標(biāo)測定，并記錄測定結(jié)果，采用重復(fù)實驗的方式，排除誤差。

1.4 劃痕實驗 細(xì)胞培養(yǎng)與分組同MTT實驗。將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，待長至臨近飽合，用PBS緩沖液將板中細(xì)胞洗滌2遍，用無菌10 μl Eppendorf Tip在細(xì)胞板上劃痕。倒置顯微鏡下分別觀察各組細(xì)胞0 h，48 h的劃痕距離，并攝像。軟件測量各孔細(xì)胞任意3個部位的不同劃痕距離，計算各組傷口愈合率，計數(shù)3組實驗的平均值，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5 Transwell侵襲實驗 在進(jìn)行侵襲實驗過程中，借助于Transwell等設(shè)備，對實驗條件、實驗場景等主要參數(shù)進(jìn)行調(diào)控。在實際的操作環(huán)節(jié)，研究人員將已經(jīng)根據(jù)實驗需求稀釋好的基質(zhì)膠放置到Transwell小室，并靜置一段時間。靜置完成后，選擇100 μl細(xì)胞稀釋液，放入到Transwell上層，在下層放入一定體量、一定濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液，并將整個實驗的溫度控制在37 ℃，保溫36 h，在完成上述操作后，隨機(jī)選擇上層未發(fā)生遷移的細(xì)胞作為觀察對象，使用光學(xué)顯微鏡等設(shè)備進(jìn)行觀察，并進(jìn)行記錄，為保證觀察結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以進(jìn)行重復(fù)實驗，并開展數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 人乳腺癌細(xì)胞中PDL1表達(dá)水平的檢測 從整個研究的結(jié)果來看，人乳腺細(xì)胞系表的PDL1表達(dá)與正常細(xì)胞系的相關(guān)表達(dá)水平之間的差異較為明顯，分別為4.615-5.743、0.733-0.831，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=235.878，264.906，P<0.01)。

2.2 敲低PDL1對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染si-PDL1組的OD值為(0.514±0.007)，與si-control組(0.762±0.012)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=174.908，P<0.05)。提示在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞干擾PDL1后能抑制癌細(xì)胞的增殖。

2.3 敲低PDL1對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示，si-PDL1組48 h后傷口愈合率分別為(56.2±7.4)%，與si-control組(74.8±8.6)%相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.063，P<0.05)。提示在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞干擾PDL1后能抑制癌細(xì)胞的遷移。

2.4 敲低PDL1對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的影響 Transwell結(jié)果顯示，si-PDL1組穿過基質(zhì)膠的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞數(shù)量為(105±9)與si-control組(196±15)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=50.970，P<0.05)。提示在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞干擾PDL1后能抑制癌細(xì)胞的侵襲。

3 討 論

研究顯示，與其他癌癥相比，乳腺癌中出現(xiàn)了免疫的重要性。一些免疫應(yīng)答相關(guān)變量對乳腺癌患者的生存和化療反應(yīng)具有良好的預(yù)測影響[6]。免疫反應(yīng)是激活劑和抑制劑途徑之間平衡的復(fù)雜現(xiàn)象。癌細(xì)胞可以維持有利于腫瘤進(jìn)展的免疫抑制微環(huán)境。PD1受體—配體相互作用是主要的抑制劑途徑。PD1是由包括T細(xì)胞在內(nèi)的各種免疫細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面膜蛋白質(zhì)。它被其配體PDL1和PDL2激活，其由抗原呈遞細(xì)胞如巨噬細(xì)胞或B細(xì)胞表達(dá)。PDL1或CD274是PD1的配體之一，在許多癌癥和免疫細(xì)胞如抗原呈遞細(xì)胞的表面表達(dá)。它與PD1的結(jié)合抑制了T細(xì)胞遷移，細(xì)胞毒性介質(zhì)的增殖和分泌，以及限制腫瘤細(xì)胞殺傷[7]。PD1在與其配體結(jié)合后，PD1能減弱淋巴細(xì)胞活化并促進(jìn)T-調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育和功能，從而終止免疫應(yīng)答。最近，通過對抗癌免疫反應(yīng)抑制的研究發(fā)現(xiàn)PD1可能成為癌癥進(jìn)展的主要參與者[7]。PDL1在許多不同的癌癥中上調(diào)，阻斷PDL1增強(qiáng)抗癌免疫能力。目前臨床試驗測試通過抗PD1或抗PDL1藥物以恢復(fù)抗癌免疫力并具有持久的反應(yīng)，結(jié)果較為理想，特別是在黑素瘤和腎、肺、前列腺、膀胱癌中，并且Ⅲ期研究正在進(jìn)行中[8-12]。目前研究已證明腫瘤和(或)浸潤性免疫細(xì)胞的PDL1表達(dá)與治療反應(yīng)具有相關(guān)性[13-15]。

為系統(tǒng)、全面掌握乳腺癌細(xì)胞的PDL1表達(dá)特性，在研究過程中，設(shè)計了相關(guān)研究與實驗，以測定其具體的細(xì)胞表達(dá)方式，整個研究更為具體、更為直觀。通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中干擾PDL1后，細(xì)胞的增殖能力明顯減弱。劃痕實驗與Transwell實驗結(jié)果顯示在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中干擾PDL1后，細(xì)胞的遷移與侵襲能力亦明顯被抑制。目前，PDL1在乳腺癌中的分子調(diào)控機(jī)制研究還處于起始階段，繼續(xù)深入PDL1在乳腺癌中的研究，將為乳腺癌潛在治療靶點的挖掘提供新的思路。