基于胰腺纖維化微環(huán)境探討中醫(yī)藥防治慢性胰腺炎的機制*

彭青俠，許小凡，段麗芳，張 紅,

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)科研實驗中心，陜西 西安 712046）

慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）是一種以胰腺實質(zhì)破壞和纖維化改變?yōu)樘卣鞯穆匝装Y性疾病，最終可導(dǎo)致胰腺內(nèi)外分泌功能不全，患者預(yù)后較差[1]。大量研究證實胰腺纖維化是慢性胰腺炎發(fā)病的關(guān)鍵步驟，也是治療過程中的重要靶標(biāo)，其在慢性胰腺炎進(jìn)程中起決定作用[2]。而在胰腺纖維化微環(huán)境中主要有3種細(xì)胞相互作用參與胰腺纖維化的進(jìn)展[3-4]，即胰腺腺泡細(xì)胞、炎癥細(xì)胞（以巨噬細(xì)胞為主）和胰腺星狀細(xì)胞（pancreatic stellate cells，PSC）。在致病因素的作用下，胰腺腺泡細(xì)胞發(fā)生損傷，引起炎癥細(xì)胞在胰腺組織中浸潤，并釋放多種炎癥因子，刺激PSC由靜止變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維樣細(xì)胞，表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），增殖和遷移能力增強，并產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)（extra-cellular matrix，ECM）成分，促使胰腺纖維化的發(fā)生。中醫(yī)雖無“胰腺炎”之名，但根據(jù)其臨床癥狀，可將本病歸于“腹痛”“脾心痛”“泄瀉”等范疇，病因病機主要包括陰陽失調(diào)、脾胃虛弱、肝脾失調(diào)、情志不疏等[5-6]。近年來，大量學(xué)者結(jié)合慢性胰腺炎發(fā)病機制的最新研究進(jìn)展，開展了多種中醫(yī)藥防治慢性胰腺炎的藥理機制研究，主要針對慢性胰腺炎胰腺纖維化微環(huán)境進(jìn)行探索。本文從胰腺纖維化微環(huán)境入手探討中醫(yī)藥防治慢性胰腺炎的相關(guān)機制，并作一系統(tǒng)的概述。

1 中醫(yī)藥調(diào)控ECM的過度產(chǎn)生和降解

在胰腺損傷中，PSC被激活，產(chǎn)生大量的ECM蛋白，包括Ⅰ型膠原（COLⅠ-α1）、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和蛋白多糖基質(zhì)，在纖維形成活躍的部位進(jìn)行組織修復(fù)和再生，然而ECM蛋白產(chǎn)生的不平衡可使胰腺實質(zhì)發(fā)生纖維化，最終導(dǎo)致器官永久性的形態(tài)學(xué)損傷。因此，平衡ECM的合成與降解被認(rèn)為是治療胰腺纖維化的有效手段[7]。ECM降解主要依賴于機體內(nèi)降解酶系統(tǒng)的調(diào)控，其中，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）能選擇性降解多種ECM成分，MMPs的活性和表達(dá)水平又受金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitors of metal proteases，TIMPs）的抑制，所以干預(yù)MMPs或TIMPs表達(dá)，調(diào)控MMPs/TIMPs相關(guān)信號通路活性可以調(diào)節(jié)ECM降解[8]。LTC細(xì)胞系是永生化的大鼠PSC，保留了原代PSC的基本功能和形態(tài)特征，是目前常用的研究胰腺纖維化事件較為合適的哺乳動物細(xì)胞模型[9]，而在體內(nèi)、外研究中最常用到的，也是最強有力的纖維化誘導(dǎo)劑是轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）[7]。

相關(guān)研究證實[10]，中醫(yī)藥可通過調(diào)節(jié)ECM的過度沉積抑制纖維化形成。LIN Z等[11]用TGF-β刺激LTC-14細(xì)胞，研究中藥成分的抗纖維化作用，其研究結(jié)果顯示大黃酸、大黃素和姜黃素都可以通過抑制LTC-14細(xì)胞的Col I-α1和Fn1在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，起到抑制胰腺纖維化的作用。ZHANG S K等[12]采用DBTC誘導(dǎo)CP模型，發(fā)現(xiàn)造模后28 d，大鼠的胰腺中MMP13和TIMP1的表達(dá)顯著增加，天狼星紅染色證實，模型大鼠胰腺組織中存在Ⅰ型和Ⅲ型膠原的彌漫性纖維化；而給予加味小柴胡湯灌胃后，大鼠胰腺組織中MMP13表達(dá)明顯升高，Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量明顯降低，提示加味小柴胡湯可以提高基質(zhì)金屬蛋白酶對胰腺組織中ECM的降解能力，從而減緩纖維化的進(jìn)程。此外，張?zhí)炝岬萚13]還提出用和解利濕方（由柴胡桂枝湯和茵陳蒿湯組成）治療慢性胰腺炎急性發(fā)作，他們采用乙醇流質(zhì)飲食聯(lián)合內(nèi)毒素脂多糖（LPS）構(gòu)建大鼠慢性胰腺炎急性發(fā)作模型并給予和解利濕方灌胃治療，發(fā)現(xiàn)此方可以減少大鼠胰腺組織纖維沉積，對慢性胰腺炎急性發(fā)作有明顯的治療作用，并提示其治療機制可能與此方能調(diào)節(jié)胰腺組織中MMP-2、TIMP-1和TIMP-2蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)MMP/TIMP的平衡，增強其降解ECM的能力有關(guān)。

2 中醫(yī)藥抑制PSC活化

研究表明[14-15]，在PSC活化過程中，TGF-β和血小板源性生長因子（plateletderived growth factor，PDGF）扮演著至關(guān)重要的角色，二者可發(fā)揮不同的效應(yīng)。PDGF作為一個多肽類生長因子，能促進(jìn)PSC的有絲分裂；而TGF-β具有增加α-SMA表達(dá)和ECM蛋白質(zhì)的合成的功能。PSC在胰腺炎癥微環(huán)境中被激活，且通過復(fù)雜的信號通路進(jìn)一步促進(jìn)炎癥及促纖維化的進(jìn)展，PSC活化的主要信號通路包括Smad和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated prtein kinases，MAPKs）信號通路等[16]。MAPK家族又包括3個成員[17]，即JNK、ERK、p38 MAPK，在慢性胰腺炎進(jìn)展過程中活化的PSC與p-JNK、p-ERK、p-p38 MAPK存在共表達(dá)；在體外，PSC受到TGF-β1刺激后發(fā)生了JNK和ERK的過表達(dá)。研究提示嘌呤P2 X7R-NLRP3炎性小體（P2 X7R-NLRP3）也參與了慢性胰腺炎的進(jìn)展[18]，NLRP3炎性小體可以誘導(dǎo)IL-1β、IL-18的釋放，進(jìn)而通過自分泌和旁分泌信號，導(dǎo)致TGF-β1表達(dá)增加并進(jìn)一步促進(jìn)PSC活化；而PSC活化后也可分泌一些炎癥因子，如結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、趨化蛋白1、白細(xì)胞介素-1等，通過自分泌方式促進(jìn)PSC增殖[19]。

研究發(fā)現(xiàn)[20-22]中醫(yī)藥可通過調(diào)控參與PSC活化的細(xì)胞因子和通路，阻止或延緩胰腺纖維化的進(jìn)程。張心磊[22]采用SD大鼠尾靜脈注射DBTC復(fù)制慢性胰腺炎模型，發(fā)現(xiàn)丹參注射液可以減輕慢性胰腺炎大鼠胰腺的纖維化程度，并可降低大鼠血清中TGF-β1及IL-6的水平。陸宏偉等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，秋水仙堿可以減輕TGF-β1所誘導(dǎo)的PSC活化、抑制PSC增殖、促進(jìn)其凋亡，同時發(fā)現(xiàn)秋水仙堿可以明顯降低PSC中Smad2、Smad3和Smad4的磷酸化水平。許小凡[24]采用DBTC聯(lián)合飲用乙醇誘導(dǎo)小鼠慢性胰腺炎模型，發(fā)現(xiàn)大柴胡湯在減輕胰腺組織纖維化的同時，可有效降低胰腺組織p-ERK、p-JNK的表達(dá)水平。朱林佳[25]采用腹腔注射20%L-精氨酸復(fù)制小鼠慢性胰腺炎模型，給予大柴胡湯灌胃后，小鼠血清和胰腺組織中IL-6的含量及磷酸化STAT3的蛋白表達(dá)程度明顯降低，同時胰腺組織炎細(xì)胞浸潤程度、PSC活化程度明顯減低，胰腺纖維化減輕。王曼雪等[26]用番石榴葉的主要活性成分番石榴葉總黃酮作用于雨蛙素（cerulein）誘導(dǎo)的慢性胰腺炎小鼠模型，發(fā)現(xiàn)番石榴葉總黃酮可以降低小鼠胰腺中NLRP3、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)，提示番石榴葉總黃酮可通過抑制P2 X7R-NLRP3信號通路的激活，達(dá)到保護(hù)胰腺組織的作用。

大量的實驗證據(jù)表明中醫(yī)藥抑制PSC活化、抗胰腺纖維化的作用與其調(diào)控多種炎癥信號通路和細(xì)胞因子的生成有關(guān)。但是由于PSC活化是一個非常復(fù)雜的過程，其具體機制尚未完全闡述清楚，關(guān)于中醫(yī)藥抑制PSC活化的具體機制仍需進(jìn)一步研究。

3 中醫(yī)藥抑制炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥因子釋放

早期的研究發(fā)現(xiàn)[27]，慢性胰腺炎患者胰腺組織浸潤的主要免疫細(xì)胞是淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。慢性胰腺炎時，在胰腺組織中，巨噬細(xì)胞的浸潤程度較正常胰腺組織升高3~4倍。XUE J等[4]研究發(fā)現(xiàn)在人類和小鼠慢性胰腺炎胰腺組織中巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68和F4/80表達(dá)增加。有研究發(fā)現(xiàn)[28]活化的巨噬細(xì)胞可能通過分泌促纖維因子（尤其是TGF-β），參與PSC活化，使PSC合成并分泌膠原纖維成分，促進(jìn)胰腺纖維化的發(fā)展。MICHALSKI C W等[29]通過建立巨噬細(xì)胞與PSC共培養(yǎng)體系，進(jìn)一步證實巨噬細(xì)胞不僅可以促進(jìn)PSC活化，而且可以提升PSC分泌MCP-1、IL-6和TGF-β的能力，從而可能導(dǎo)致慢性炎癥持續(xù)狀態(tài)。

中醫(yī)藥可以通過抑制巨噬細(xì)胞浸潤和炎癥因子的釋放來抑制胰腺纖維化[30-31]。DUAN L F等[30]用20%L-精氨酸制備慢性胰腺炎小鼠模型，發(fā)現(xiàn)胰腺組織在纖維化的同時，可見大量巨噬細(xì)胞浸潤，血清IL-6濃度亦明顯升高，給予大柴胡湯灌胃后，發(fā)現(xiàn)小鼠胰腺巨噬細(xì)胞浸潤及纖維化程度明顯減弱，IL-6、MCP-1、MIP-1α及纖連蛋白的mRNA水平明顯降低，提示大柴胡湯可通過抑制胰腺組織中的巨噬細(xì)胞浸潤和炎癥因子分泌來有效改善胰腺纖維化。何林[31]用C57BL/6小鼠腹腔注射cerulein構(gòu)建慢性胰腺炎模型，發(fā)現(xiàn)胰腺組織中纖維化相關(guān)因子（a-SMA和FN）、巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物（CD68和F4/80）及炎癥相關(guān)因子（TNF-a和IL-6）的表達(dá)均升高，而給予異甘草素灌胃治療后，這些因子的表達(dá)均受到抑制，說明異甘草酸可以通過抑制巨噬細(xì)胞浸潤和相關(guān)炎癥因子表達(dá)，對慢性胰腺炎發(fā)揮治療作用。研究表明[32]不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞在慢性胰腺炎進(jìn)展中具有不同的作用，中醫(yī)藥如何影響巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)緩解慢性胰腺炎，值得進(jìn)一步探討。

4 中醫(yī)藥抑制腺泡細(xì)胞凋亡

腺泡細(xì)胞損傷是慢性胰腺炎胰腺組織的重要病理學(xué)表現(xiàn)之一，繼之被纖維化所替代。而胰腺腺泡損傷主要包括壞死和凋亡兩種形式[33]。細(xì)胞凋亡在慢性胰腺炎腺泡損傷的早期和中期具有重要作用[34-35]。有研究報道[36]大量腺泡細(xì)胞凋亡會釋放組蛋白、高遷移率族蛋白1等，其可能作為潛在原因通過增強胰蛋白酶原活性，促進(jìn)胰腺損傷和慢性胰腺炎進(jìn)展。而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族成員可與多種蛋白因子產(chǎn)生作用對細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控，為介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因子[37]。此外，Bcl-2家族蛋白在凋亡過程中同樣扮演著重要角色，Bcl-2家族中存在著對凋亡作用相反的兩類調(diào)節(jié)蛋白，即促凋亡的蛋白有Bax、Bak、Bad等，以及抗凋亡的蛋白有Bcl-2和Bcl-XL等[38]。

中醫(yī)藥可以通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白，抑制腺泡細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到防治慢性胰腺炎的目的[39-40]。高麗娟等[39]用L-精氨酸制備SD大鼠慢性胰腺炎模型，給予胰泰復(fù)方（由四君子湯加減化裁而成）治療，發(fā)現(xiàn)此方可下調(diào)慢性胰腺炎大鼠胰腺組織中明顯升高的Caspase-3蛋白表達(dá)，抑制慢性胰腺炎胰腺纖維化的進(jìn)程。周錢梅等[40]采用乙醇飼料聯(lián)合尾靜脈注射LPS制備SD大鼠酒精性慢性胰腺炎模型，給予和解利濕方灌胃治療，發(fā)現(xiàn)此方能減輕胰腺組織炎癥細(xì)胞浸潤和腺泡細(xì)胞凋亡，并降低Caspase-3、Caspase-9及Bax的表達(dá)，增加Bcl-2的表達(dá)和Bcl-2與Bax的比值。和解利濕方含藥血清對AR42J細(xì)胞的體外實驗顯示，和解利濕方可能通過減少腺泡細(xì)胞凋亡對慢性胰腺炎具有治療作用[40]。然而，中醫(yī)藥調(diào)節(jié)凋亡蛋白進(jìn)一步對胰腺微環(huán)境中的PSC和炎癥細(xì)胞的影響及其具體的作用機制還需深入研究。

5 中醫(yī)藥治療慢性胰腺炎的其他機制

酒精濫用被認(rèn)為是慢性胰腺炎的主要病因之一，其主要損傷目標(biāo)為腺泡細(xì)胞[41-42]。酒精過量，可使腺泡細(xì)胞中用于異種生物代謝的Ⅰ型細(xì)胞色素P450酶和Ⅱ型偶聯(lián)蛋白的活性增加，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量增加[43]。細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加會開啟細(xì)胞凋亡通路，細(xì)胞凋亡通路激活后，抗凋亡蛋白Bcl-2受到抑制，誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax寡聚化，線粒體膜透化及細(xì)胞色素C的釋放，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（apoptosis protease-activating factor-1，Apaf-1）結(jié)合形成Apaf-1/procaspase-9凋亡小體，從而激活啟動子Caspase-9，進(jìn)而激活下游效應(yīng)子Caspase-3/7，導(dǎo)致PARP蛋白破壞，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[44]。此外，還有研究報道氧化應(yīng)激增加會阻斷胰腺腺泡細(xì)胞的胞吐作用，從而導(dǎo)致腺泡細(xì)胞自噬代償增加，促使氧化自由基產(chǎn)物及新合成的酶進(jìn)入腺泡間質(zhì)，促使胰腺炎癥的發(fā)生[45]。

大量研究表明[46-47]，許多中草藥可作為天然抗氧化劑，通過清除自由基和抑制過氧化對胰腺起到保護(hù)作用。KAVITHA Y等[43]采用乙醇和cerulein誘導(dǎo)Wistar大鼠慢性胰腺炎模型，給予桑白皮甲醇提取物灌胃治療，發(fā)現(xiàn)桑白皮甲醇提取物可以使慢性胰腺炎大鼠血液中缺失的內(nèi)源性抗氧化因子，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶及還原型谷胱甘肽等的表達(dá)水平得到改善，胰腺纖維化和炎癥程度也明顯減輕，由此可見，桑白皮甲醇提取物可能通過恢復(fù)其抗氧化功能從而達(dá)到對胰腺的保護(hù)作用。以疏肝理脾、行氣活血為治法的膽胰寧對L-精氨酸誘導(dǎo)的慢性胰腺炎也具有治療作用，其機制為增加機體SOD的活性，減少胰腺自由基的含量，從而對大鼠胰腺組織發(fā)揮保護(hù)作用[48]。在DBTC復(fù)制的慢性胰腺炎小鼠，給予柴胡疏肝散治療后小鼠血清淀粉酶活性、透明質(zhì)酸的含量明顯降低，SOD活性呈回升趨勢，而丙二醛明顯下降并維持在較低水平，提示柴胡疏肝散可以通過提高胰腺組織的抗氧化能力，有效延緩胰腺纖維化的發(fā)展[49]。

綜上所述，ROS增加可通過增加腺泡細(xì)胞凋亡促進(jìn)慢性胰腺炎的發(fā)展，許多中醫(yī)藥單體或者復(fù)方具有抗氧化功能，有望通過減少氧自由基的形成，遏制慢性胰腺炎的進(jìn)展。

6 小結(jié)與展望

中醫(yī)藥可以通過調(diào)節(jié)胰腺纖維化微環(huán)境延緩胰腺纖維化進(jìn)程，中醫(yī)藥復(fù)方、單體及提取物可抑制PSC活化、炎性細(xì)胞浸潤和炎癥因子釋放、腺泡細(xì)胞凋亡等，以減少胰腺纖維化的形成，減輕胰腺實質(zhì)的損傷。但是，由于中醫(yī)藥防治慢性胰腺炎胰腺纖維化的機制研究以動物實驗和細(xì)胞實驗為主。因此，這些研究結(jié)果在臨床的轉(zhuǎn)化還需要加快。隨著對慢性胰腺炎胰腺纖維化機制的深入認(rèn)識，今后的研究應(yīng)立足中醫(yī)藥防治慢性胰腺炎的臨床療效，通過臨床實驗與動物實驗相結(jié)合，進(jìn)一步深入研究中醫(yī)藥防治胰腺纖維化的機制，為中醫(yī)藥在慢性胰腺炎的臨床應(yīng)用提供充足的科學(xué)依據(jù)。