鼻咽癌微環(huán)境中外泌體作用機(jī)制的研究進(jìn)展

鐘宇蕭(綜述)， 蒿艷蓉(審校)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，來(lái)源于鼻咽部的上皮細(xì)胞，和其他上皮性頭頸部腫瘤起源于相似的細(xì)胞或組織譜系，易發(fā)生局部浸潤(rùn)和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且惡性程度高。NPC發(fā)生與EB病毒(epstein-barrvirus,EBV)感染、腫瘤抑制因子失活、癌基因激活和環(huán)境等因素有關(guān)[1-2]，在我國(guó)廣東、廣西、福建，以及東南亞、北非地區(qū)高發(fā)，多見(jiàn)于男性華人，男女發(fā)病率約為2.5∶1，年發(fā)病率近千分之三，具有家族聚集性特點(diǎn)，高發(fā)的家族移居后發(fā)病率也會(huì)高于當(dāng)?shù)鼐用?。而且NPC具有雙峰年齡分布特點(diǎn)：一是在50～60歲左右，二是小高峰為青少年和年輕人[3]。根據(jù)目前世界衛(wèi)生組織的病理分類(lèi)，NPC分為角化鱗狀細(xì)胞癌和非角化癌。后者進(jìn)一步細(xì)分為非角化分化癌和非角化未分化癌。隨著影像學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，雖然同步調(diào)強(qiáng)放療加化療、手術(shù)以及其他輔助性治療，使得患者局部癥狀的控制率有所提高，尤其是新型放射技術(shù)或設(shè)備的改進(jìn)，局部控制率可達(dá)到90%左右，但是在針對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)治療的效果還存在一定的局限性。從機(jī)制上講，NPC發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞不斷向周?chē)h(huán)境釋放外泌體，外泌體濃度越高，代謝和生理活動(dòng)越活躍，惡性程度越高。本文對(duì)外泌體主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程在細(xì)胞-細(xì)胞通信中發(fā)揮重要作用進(jìn)行綜述。

1 NPC微環(huán)境外泌體的形成

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)由腫瘤基質(zhì)、周?chē)芎湍[瘤細(xì)胞本身組成，包括周?chē)拿庖呒?xì)胞、血管、細(xì)胞外基質(zhì)、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓源性炎癥細(xì)胞和信號(hào)分子[4]。NPC微環(huán)境中細(xì)胞間的通訊，通過(guò)直接的細(xì)胞-細(xì)胞接觸或通過(guò)轉(zhuǎn)移分泌的細(xì)胞因子介導(dǎo)，是維持多細(xì)胞生物細(xì)胞功能和組織穩(wěn)態(tài)所必需的因素。細(xì)胞相互作用的破壞會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞-細(xì)胞通訊的中斷，從而促進(jìn)NPC的發(fā)生[5-6]。通常細(xì)胞會(huì)釋放各種類(lèi)型的囊泡來(lái)維持正常的功能，如來(lái)自?xún)?nèi)小體和質(zhì)膜的外小體和微囊泡[7]。外小體是直徑約40～150 nm由質(zhì)膜直接向外出芽形成的水泡結(jié)構(gòu)，它包含轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞表面受體、胞漿和核蛋白、miRNA和mRNA。質(zhì)膜的內(nèi)吞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成內(nèi)吞小泡，進(jìn)而相互融合形成內(nèi)小體，隨著內(nèi)小體的生長(zhǎng)和成熟，形成多囊體。多囊體可經(jīng)內(nèi)溶酶體降解回收，也可被外溶酶體釋放到細(xì)胞表面。當(dāng)多囊體與質(zhì)膜融合時(shí)其腔內(nèi)囊泡釋放到細(xì)胞外，從而形成外泌體[8]。NPC微環(huán)境外泌體不僅包括EBV相關(guān)外泌體、NPC衍生外泌體、間充質(zhì)干細(xì)胞-衍生外泌體和人類(lèi)EBV轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞衍生外泌體，它還含有許多來(lái)自樹(shù)突狀細(xì)胞和骨髓祖細(xì)胞的外泌體等[9]，這些外泌體攜帶的大量功能性蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA、DNA片段等多種生物活性物質(zhì)。

2 NPC微環(huán)境外泌體的遷移、侵襲、凋亡作用

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-to-mesenchymal trasition,EMT)是促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和啟動(dòng)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。Guo等[10]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源p53激活C-C基序趨化因子配體2(CCL2)的轉(zhuǎn)錄，CCL2水平升高后通過(guò)chemokine receptor 2(CCR2)促進(jìn)轉(zhuǎn)移和EMT。同樣，NPC衍生外泌體潛伏膜蛋白2(latent membrane protein 2，LMP2)通過(guò)誘導(dǎo)PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)NPC中的EMT磷酸化為4EBP1，激活的4EBP1-eIF4E軸可以上調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)移的腫瘤抗原1(metastatic tumor antigen 1,MTA1)，并且通過(guò)Wnt1途徑和激活β-catenin來(lái)促進(jìn)EMT[9，11]，還可以通過(guò)ERK1/2通路促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Fra-1的產(chǎn)生，LMP2A上調(diào)鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPHK1)，可產(chǎn)生鞘氨醇-1磷酸(S1P)激活A(yù)KT，從而促進(jìn)EBV相關(guān)的NPC細(xì)胞遷移[9，11]。Wasil等[12]證明LMP1可上調(diào)局灶性黏附(FA)復(fù)合物的形成，促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移。LMP1還可以下調(diào)腫瘤抑制因子miR-204，從而增強(qiáng)Cdc42介導(dǎo)細(xì)胞侵襲特性的活性，如焦點(diǎn)復(fù)合物的形成、整合素的定位和MMP的表達(dá)[13]。此外，癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-related fibroblasts,CAFs)對(duì)癌癥的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。Zhu等[14]證實(shí)了環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase 2，COX-2)在原發(fā)性NPC組織中的低表達(dá)，但在CAFs轉(zhuǎn)移部位高表達(dá)，COX-2在成纖維細(xì)胞中的高表達(dá)通過(guò)COX-2-PGE2-TNF-α軸增強(qiáng)NPC的遷移特性。Wu等[15]研究發(fā)現(xiàn)EBV感染的NPC微環(huán)境中EBV相關(guān)外泌體LMP1通過(guò)NF-κB/p65信號(hào)通路激活正常成纖維細(xì)胞(normal fibroblasts,NFs)成為CAFs，而LMP1已被證明通過(guò)依賴(lài)ERK-MAPK通路的機(jī)制在上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)EMT，但抑制TGF-β信號(hào)對(duì)逆轉(zhuǎn)EMT表型沒(méi)有影響[16]。我們可以推測(cè)LMP1可以通過(guò)上皮細(xì)胞中的ERK-MAPK信號(hào)直接驅(qū)動(dòng)EMT，或者間接通過(guò)CAFs的招募和激活，刺激它們釋放的TGF-β以旁分泌的方式作用于TME中的NPC細(xì)胞，或者二者是協(xié)同作用?？梢?jiàn)，NPC微環(huán)境的外泌體通過(guò)不同的信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT或CAFs，對(duì)調(diào)控TME發(fā)揮了重要作用。CAFs是預(yù)后較差的一個(gè)突出特征，因此，外泌體在CAFs中的作用，在將來(lái)有望幫助腫瘤的診斷分期、治療效果評(píng)估以及成為監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志物。

3 NPC微環(huán)境外泌體的促血管生成

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和擴(kuò)散取決于新生的血管，這些血管為維持腫瘤生長(zhǎng)提供了所需的營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子和氧氣。腫瘤在進(jìn)展的不同階段，腫瘤血管生成涉及復(fù)雜的內(nèi)皮細(xì)胞活動(dòng)的編排，包括增殖、遷移、入侵、黏附和分化[17]。Lu等[18]用遷移法、管形成法和基質(zhì)凝膠塞法分別評(píng)價(jià)了內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)外泌體miR-9對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(human umbilical vein endothelial cell line，HUVECs)在體內(nèi)和體外細(xì)胞遷移和管形成關(guān)系，研究數(shù)據(jù)表明了外泌體miR-9通過(guò)靶向介導(dǎo)MDK和調(diào)節(jié)PDK1/AKT通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞生成，從而抑制血管形成，然而miR-9過(guò)表達(dá)則通過(guò)AMPK信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和血管生成。結(jié)果揭示miR-9可以通過(guò)多條信號(hào)通路介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生成，進(jìn)而影響血管形成。Bao等[19]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞和高血管化組織中富集的miR-23a-27a-24-2簇成員通過(guò)抑制miR-23/27靶向誘導(dǎo)Sprouty 2和Sema 6A蛋白來(lái)抑制發(fā)芽血管生成。在此基礎(chǔ)上，他們還發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-23a可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和內(nèi)皮細(xì)胞的管形成。我們可以進(jìn)一步猜測(cè)，是否外泌體miR-23a以旁分泌的機(jī)制，從NPC細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)皮細(xì)胞后通過(guò)直接靶向睪丸特異性基因抗原(testis-specific gene antigen，TSGA10)加速鄰近腫瘤內(nèi)膜的血管生成。BMP和激活素受體膜結(jié)合抑制劑(BAMBI)，作為T(mén)GF-β typeⅠ受體家族成員的競(jìng)爭(zhēng)偽受體，在腫瘤的發(fā)生和血管生成中起著重要的作用。Duan等[20]的研究表明，來(lái)自NPC細(xì)胞的外泌體miR-17-5p通過(guò)靶向作用于BAMBI和調(diào)節(jié)AKT/VEGF-A信號(hào)促進(jìn)血管生成。此外，TME外泌體還通過(guò)VEGF、EGFR和STAT3介導(dǎo)的途徑，以多種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和血管生成[17，21]。綜上所述，NPC微環(huán)境外泌體在介導(dǎo)血管生成中起著重要作用。

4 NPC微環(huán)境外泌體參與免疫作用

NPC微環(huán)境中存在許多免疫抑制因子，通過(guò)募集免疫抑制細(xì)胞抑制局部免疫反應(yīng)，使得原本起保護(hù)作用的免疫反應(yīng)抑制腫瘤生長(zhǎng)失敗，甚至導(dǎo)致癌基因的產(chǎn)生。然而，外泌體通過(guò)免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的通訊，參與微環(huán)境的免疫機(jī)制，對(duì)免疫監(jiān)測(cè)、免疫抑制和免疫逃逸起著關(guān)鍵性作用[22]。一方面，NPC細(xì)胞分泌的外泌體程序性死亡配體1(PD-L1)可能參與細(xì)胞因子和趨化因子等免疫介質(zhì)的調(diào)節(jié)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)通訊抑制微環(huán)境中免疫反應(yīng)[5，23]。活化基質(zhì)、抗炎M2巨噬細(xì)胞等是免疫衰竭的特征，可激活WNT/TGF-β信號(hào)通路，促進(jìn)TGF-β在衰竭亞型中顯著富集，從而抑制宿主的免疫應(yīng)答[24]。研究[25]表示PD1/PD-L1過(guò)表達(dá)，通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta,TGF-β1)去掉DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT 1)，以啟動(dòng)子的去甲基化或以依賴(lài)TNF-α的方式激活I(lǐng)KKE/NF-κB信號(hào)通路，從而促進(jìn)TME中的免疫逃逸。另一方面NPC衍生外泌體和間充質(zhì)干細(xì)胞衍生外泌體(IEXs)已被證明通過(guò)轉(zhuǎn)移抗原來(lái)激活CD4T細(xì)胞和CD8T細(xì)胞，從而增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)并抑制腫瘤進(jìn)展[23]。同樣，微環(huán)境中EB病毒核抗原-1(EBV encoded nuclear antigen 1,EBNA-1)蛋白，通過(guò)產(chǎn)生IgA抗體來(lái)增強(qiáng)對(duì)EBNA-1的體液免疫反應(yīng)[26]。NOPC來(lái)源的外泌體白介素-18(interleukin-18,IL-18)和CXC趨化因子配體10(CXCL10)可能誘導(dǎo)趨化因子受體3(CXCR3)陽(yáng)性T細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素(interleukin-γ,IFN-γ)，IFN-γ能形成積極的調(diào)節(jié)回路促進(jìn)惡性上皮細(xì)胞產(chǎn)生CXCL10，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和白細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，LMP1還可上調(diào)IL-18，這導(dǎo)致IL-18、IL-6和血清粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)進(jìn)入TME增多，從而抑制TME中的免疫監(jiān)測(cè)[11]。由此可見(jiàn)，微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，提示了僅靠單一靶點(diǎn)很難掌握免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，要不斷發(fā)掘新的靶點(diǎn)及代償通路，微環(huán)境中有更多外泌體有望成為免疫治療的新靶點(diǎn)。

5 NPC缺氧微環(huán)境中的外泌體

腫瘤細(xì)胞的增殖使局部基底膜受損，TME遭受缺氧和破壞。TME缺氧是觸發(fā)腫瘤血管生成并激活缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)表達(dá)的主要力量[17]。HIF-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞代謝和生理過(guò)程的各個(gè)方面，包括癌癥的發(fā)生、發(fā)展。由于骨髓祖細(xì)胞來(lái)源外泌體HIF-1a mRNA的表達(dá)整合多種病毒致癌的生物途徑，使大多數(shù)致癌病毒能夠穩(wěn)定或增強(qiáng)血管生成因子HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性。缺氧微環(huán)境中，隨著HIF-1a的積累，激活許多缺氧條件下的靶基因，如促血管生成因子和促生長(zhǎng)因子、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)。由于HIF-1a在誘導(dǎo)機(jī)制中的重要性，使得MMP-13過(guò)度表達(dá)，從而誘導(dǎo)NPCEMT和腫瘤侵襲[27]。Li等[28]用Hre2構(gòu)建了4個(gè)質(zhì)粒，證明了NPC衍生外泌體葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78(glucose-regulated protein 78，GRP78)嵌合啟動(dòng)子調(diào)控融合基因TK/VP3，表達(dá)的TK和VP3，在葡萄糖缺乏或缺氧條件下能顯著抑制NPC細(xì)胞的增殖，促進(jìn)NPC細(xì)胞的凋亡。同時(shí)證實(shí)了miR-519可以直接結(jié)合HIF-1a，并顯著抑制其表達(dá)，若HIF-1a過(guò)強(qiáng)可反饋性抑制miR-519進(jìn)而抑制NPC細(xì)胞進(jìn)展。此外，LMP1在這些細(xì)胞成為低氧甚至缺氧微環(huán)境下的高級(jí)腫瘤細(xì)胞之前，激活具有腫瘤干細(xì)胞或祖細(xì)胞樣特性的細(xì)胞的低氧信號(hào)通路，這有助于維持腫瘤干細(xì)胞在NPC早期階段的發(fā)育[29]。綜上所述，缺氧是TME重要的組成因素，癌細(xì)胞可以通過(guò)多種細(xì)胞機(jī)制適應(yīng)所處的缺氧環(huán)境，同時(shí)TME外泌體在通過(guò)不同的信號(hào)通路促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞的適應(yīng)性方面發(fā)揮了重要作用。

6 NPC微環(huán)境外泌體在臨床中的應(yīng)用

在NPC的進(jìn)展中，腫瘤細(xì)胞不斷向周?chē)h(huán)境釋放外泌體。外泌體可以將生物信號(hào)從腫瘤傳遞到遠(yuǎn)處的組織和器官，甚至進(jìn)入血液循環(huán)中遍布全身。因此，外泌體可以作為靶向給藥載體，在供體細(xì)胞和受體細(xì)胞之間的細(xì)胞貨物的載體中起內(nèi)源性作用，以及在激發(fā)生物反應(yīng)中起作用。外泌體在治療中的使用包括抗腫瘤藥物的藥物傳遞、免疫調(diào)節(jié)、去除體液中腫瘤來(lái)源的外泌體、調(diào)節(jié)外泌體含量以防止腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[5，30]。外泌體中嵌有不同類(lèi)型的病毒成分，如LMP1、LMP2A、BAMHI-a向右結(jié)構(gòu)1(Bam-HIA rightward frame 1,BARF1)和EBV核酸(DNA、mRNA和miRNA)，這些EBV相關(guān)外泌體靶點(diǎn)可以作為NPC診斷和預(yù)后指標(biāo)，也可以作為不同類(lèi)型EBV相關(guān)癌和疾病的治療靶點(diǎn)[31-32]。而且研究[33]發(fā)現(xiàn)，環(huán)親素A(cyclophilin A,CYPA)不僅可以被排入外周血，還可以被輸送并富集在血清外泌體中，外泌體CYPA和EBV-VCA-IgA的結(jié)合可以提高診斷的準(zhǔn)確性，尤其是當(dāng)EBV-VCA-IgA為陰性的時(shí)候。該研究提示，循環(huán)外泌體CYPA是一種新的提示NPC不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。而且還有研究[9]提示，NPC微環(huán)境中外泌體EBV-BART1-miRNAs在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用，可作為無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物用于NPC患者的早期檢測(cè)、診斷和治療監(jiān)測(cè)。此外，RAB27A通過(guò)調(diào)節(jié)外泌體介導(dǎo)的侵襲性，從而刺激癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，表明RAB27A是發(fā)病機(jī)制的重要調(diào)節(jié)因子，因此它既是幾種類(lèi)型癌癥的關(guān)鍵預(yù)后指標(biāo)，也是治療靶點(diǎn)[34]。綜上所述，雖然微環(huán)境中外泌體在腫瘤的治療、診斷及預(yù)后中發(fā)揮重要作用，但由于NPC極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，使得其在臨床方面的應(yīng)用尚處于初級(jí)階段。因此微環(huán)境中外泌體有著巨大研究潛力和意義。

7 結(jié)語(yǔ)

我們探索了NPC微環(huán)境的外泌體通過(guò)多種途徑參與NPC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲和凋亡，外泌體有望成為評(píng)估腫瘤進(jìn)展的一項(xiàng)重要的生物學(xué)指標(biāo)。外泌體通過(guò)不同信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管生成，例如外泌體miR-9通過(guò)靶向誘導(dǎo)MDK和調(diào)節(jié)PDK1介導(dǎo)的AKT通路進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞，從而抑制血管形成，使我們有望找到調(diào)控血管生成起主要作用的關(guān)鍵突變，有可能找到抗腫瘤血管生成的新的治療靶點(diǎn)。此外，通過(guò)外泌體在TME中的免疫檢測(cè)、免疫調(diào)節(jié)及免疫逃逸等機(jī)制，有可能為腫瘤的免疫治療提供新的治療思路。盡管現(xiàn)在外泌體的研究進(jìn)展較大，但總體理解和認(rèn)識(shí)仍不夠全面。在TME中如何識(shí)別不同活性細(xì)胞來(lái)源的外泌體，以及如何通過(guò)外泌體所攜帶的多種生物活性成分，如蛋白質(zhì)、miRNA、DNA等，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)、驗(yàn)證、提取出更多重要的外泌體是不小的挑戰(zhàn)。目前，關(guān)于NPC微環(huán)境中的外泌體在臨床的診斷工作中運(yùn)用研究并不是很多，外泌體在NPC診斷中的潛力還沒(méi)有被挖掘出來(lái)。我們要挖掘更多的外泌體，并進(jìn)一步闡明它們的功能作用和臨床意義，探討其在NPC患者的治療中所起的作用。