MMP-2在眼組織中的表達(dá)與檢測(cè)

蔣潤(rùn) 周激波

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase proteins，MMPs）是一類(lèi)鋅依賴的肽鏈內(nèi)切酶，可存在于多種器官及系統(tǒng)中。根據(jù)其底物、自身結(jié)構(gòu)及細(xì)胞定位可將MMPs分為膠原蛋白酶、明膠酶、間質(zhì)溶解素、膜型金屬蛋白酶以及基質(zhì)溶解素這幾種類(lèi)型[1，2]。

MMP-2是MMPs家族中的第二個(gè)成員，為IV型膠原酶，又稱明膠酶A。人類(lèi)MMP-2基因編碼分子量約72 kDa的酶原，經(jīng)水解后活化為65 kDa的活性形式，活化后可與多種膠原底物相結(jié)合。與MMPs的其他成員一樣，MMP-2在組織重塑、胚胎發(fā)育、傷口愈合、血管生成和炎癥等生理方面起著重要的作用[3]。

MMP-2 的異常表達(dá)近年來(lái)被證明與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，例如肺癌[4]、消化道腫瘤[5]、心肌梗死[6]等。MMP-2在許多眼科疾病中也起著重要作用，例如高度近視、圓錐角膜、青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性、脈絡(luò)膜新生血管等。因此MMP-2在眼內(nèi)的表達(dá)和檢測(cè)成為研究眼疾病發(fā)生機(jī)制的重要環(huán)節(jié)[7，8]?，F(xiàn)筆者對(duì)此方面的研究進(jìn)行總結(jié)。

1 MMP-2在淚液和房水中的檢測(cè)

淚液作為人眼中可無(wú)創(chuàng)獲得的檢測(cè)樣本，能從健康人身上獲取以作為陰性對(duì)照，對(duì)研究有很好的參考價(jià)值。2001年，英國(guó)科學(xué)家Smith與其研究團(tuán)隊(duì)從健康受試者和患有各種活動(dòng)性眼病的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的淚液中獲得實(shí)驗(yàn)樣品，通過(guò)酶譜法觀察所有樣品的MMP，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性眼病患者的淚液中主要累積了MMP-2和MMP-9，比較樣品中明膠酶酶譜活性特征，推斷出這些MMP主要來(lái)源于粒細(xì)胞，淚液中MMP的積聚并非活動(dòng)性潰瘍性角膜炎患者獨(dú)有；可在相關(guān)特應(yīng)性疾病的患者身上檢測(cè)到酶，如圓錐角膜、皰疹性眼病以及全身和非系統(tǒng)性干眼病[9]。2012 年，澳大利亞科學(xué)家Balasubramanian團(tuán)隊(duì)取正常人群和圓錐角膜交聯(lián)手術(shù)后患者淚液進(jìn)行MMP-2蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，普通人群為（37.1±4.8）FIU/mg，圓錐角膜患者約為（52.0±8.2）FIU/mg，兩者差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從數(shù)值上來(lái)看，圓錐角膜患者的MMP-2含量更高[10]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也不乏淚液MMP-2的檢測(cè)。2013年，澳大利亞Andrea Petznick團(tuán)隊(duì)研究在角膜上皮創(chuàng)傷后淚液成分的變化，對(duì)18只實(shí)驗(yàn)室短毛貓隨機(jī)選擇的眼睛進(jìn)行角膜上皮清創(chuàng)術(shù)，在基線和各愈合階段收集眼淚，將正常眼用作對(duì)照，使用明膠酶譜法分析淚液MMP活性，免疫組化法評(píng)估MMP在眼組織中表達(dá)，該實(shí)驗(yàn)顯示在上皮遷移和傷口閉合期間角膜中MMP-2表達(dá)增加，在角膜愈合過(guò)程中，淚腺M(fèi)MP-2的免疫染色升高，而瞼板腺的變化很小或沒(méi)有變化。結(jié)膜相關(guān)淋巴組織顯示弱MMP-2染色[11]。

房水中也檢測(cè)到MMP-2的存在。2014年，JIA團(tuán)隊(duì)分別收集了近視和白內(nèi)障患者的房水，通過(guò)LuminexxMAP技術(shù)分析了房水中MMPs和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs）水平，并分析其水平和眼軸長(zhǎng)度（Axial，AL）之間的關(guān)系，首次在人類(lèi)房水中檢測(cè)到MMP-2、MMP-3、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3，且與AL呈正相關(guān)[12]。2018年，王理論團(tuán)隊(duì)選取110例確診并接受治療的原發(fā)性青光眼患者與68例原發(fā)性白內(nèi)障患者的房水，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)其中MMP2，對(duì)比發(fā)現(xiàn)青光眼患者房水中的MMP-2含量增多[13]。

由于在臨床中很難獲取正常人群的房水，通常選用接受透明晶狀體置換術(shù)或白內(nèi)障手術(shù)的患者的房水作為正常對(duì)照，房水中蛋白含量較少，具有一定的局限性。而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，可以取材到眼部組織，但又因?yàn)閯?dòng)物眼球較小，對(duì)動(dòng)物眼房水的測(cè)定至今仍較少。

2 MMP-2在角膜與鞏膜中的檢測(cè)

MMP-2在角膜中的研究已有二十多年的歷史。正常人類(lèi)角膜主要來(lái)源為捐獻(xiàn)，病理角膜來(lái)源于角膜移植術(shù)。

1992 年，美國(guó)M.ElizabethFini團(tuán)隊(duì)利用免疫組化的方法從捐獻(xiàn)的正常角膜組織和圓錐角膜中，證明提取出的是中性明膠酶MMP-2 和MMP-9 的促激活形式和活化形式。但是正常和圓錐角膜在可提取的中性明膠酶的量或亞型沒(méi)有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也沒(méi)有顯示它們?cè)谂囵B(yǎng)中合成的量或亞型[14]。1998年，Zhou團(tuán)隊(duì)在檢測(cè)中也得到類(lèi)似結(jié)論[15]。而2000 年，Smith團(tuán)隊(duì)通過(guò)酶譜法分析來(lái)自正常和圓錐角膜的角膜細(xì)胞培養(yǎng)物分泌的MMP-2 活性譜，發(fā)現(xiàn)從培養(yǎng)的早期圓錐角膜的角膜細(xì)胞獲得的蛋白質(zhì)比從培養(yǎng)正常角膜角膜細(xì)胞獲得的蛋白質(zhì)更容易產(chǎn)生MMP-2的活化酶，即MMP-2活性增加[16]。2001年，謝立信團(tuán)隊(duì)也進(jìn)行了正常角膜和圓錐角膜的免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MMP-2分布于角膜上皮、基質(zhì)與內(nèi)皮中，主要存在于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外、基質(zhì)纖維板層之間，且圓錐角膜中MMP-2含量明顯增多[17]。其他疾病角膜中MMP-2含量也有研究，2016年，Alessandra Micera團(tuán)隊(duì)收集了40例青光眼患者和23例捐獻(xiàn)者的角膜組織，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡、酶譜和聚合酶鏈反應(yīng)證實(shí)MMP-2、MMP-7、TGFb-1和VEGF的表達(dá)異常，但在青光眼亞型之間未檢測(cè)到蛋白質(zhì)表達(dá)的差異[18]。

研究者在多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)角膜與鞏膜中的MMP-2，例如雞、兔子、豚鼠[19-21]等。其中MMP-2在近視中的作用得到了廣泛的研究。2017年，Xi團(tuán)隊(duì)構(gòu)建高度近視散光小雞模型，檢測(cè)角膜與鞏膜的5個(gè)區(qū)域的MMP-2的mRNA檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高度近視散光小雞的角膜與鞏膜上MMP-2的mRNA有更高的表達(dá)[20]。2018 年，Zhou團(tuán)隊(duì)構(gòu)建MMP-2過(guò)表達(dá)小鼠，發(fā)現(xiàn)4周后鞏膜MMP-2上調(diào)的小鼠在正常視覺(jué)環(huán)境中有明顯的近視，相反，成纖維細(xì)胞特異性MMP-2缺失的小鼠的形覺(jué)剝奪性近視發(fā)展減弱27%，證明MMP-2在近視形成過(guò)程中起重要的作用[22]。2019年，Jiang團(tuán)隊(duì)構(gòu)建房角關(guān)閉模型的兔子，通過(guò)免疫熒光、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbert assay，ELISA），評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兔子的角膜鞏膜連接處金屬蛋白酶MMP-2，發(fā)現(xiàn)MMP-2染色在小梁網(wǎng)和虹膜中彌漫，MMP-2的免疫熒光信號(hào)在房角關(guān)閉后1個(gè)月內(nèi)強(qiáng)烈，隨后變?nèi)鮗19]。

3 MMP-2在晶狀體中的檢測(cè)

目前，MMP-2與晶狀體的研究集中在后發(fā)性白內(nèi)障方面，但由于目前后發(fā)性白內(nèi)障的治療方式以YAG激光為主，所以人眼后發(fā)性白內(nèi)障組織樣本較難獲取，目前MMP-2與后發(fā)性白內(nèi)障的研究多在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。2008年Li團(tuán)隊(duì)測(cè)量MMP-2 在白內(nèi)障手術(shù)前后的不同表達(dá)情況，以探討MMP-2在后囊膜混濁中的可能作用。他們?cè)?只人類(lèi)捐獻(xiàn)眼中進(jìn)行假性白內(nèi)障手術(shù)，利用免疫組化染色研究前囊膜破裂后人晶狀體上皮細(xì)胞（Lens epithelialcells，LEC）的MMP-2的表達(dá)，并在術(shù)后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定總MMP-2的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-2蛋白表達(dá)隨時(shí)間增加，在30 d達(dá)到最大水平，從而證實(shí)MMP-2的改變對(duì)后囊膜混濁有影響[23]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，也得出了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2007 年，任孝偉團(tuán)隊(duì)對(duì)兔子進(jìn)行白內(nèi)障手術(shù)，利用免疫組化檢測(cè)MMP-2蛋白以及zymography法檢測(cè)MMP-2活性，發(fā)現(xiàn)正常兔晶狀體囊膜中檢測(cè)出MMP-2，而術(shù)后實(shí)驗(yàn)組MMP-2含量及活性較對(duì)照組增強(qiáng)[24]。

4 MMP-2在玻璃體中的檢測(cè)

2000年，Vaughan-Thomas團(tuán)隊(duì)研究對(duì)人眼玻璃體的老化是否伴隨著組織內(nèi)降解酶的升高。通過(guò)酶譜法檢測(cè)供體的玻璃體內(nèi)MMP-2 含量，結(jié)果未顯示MMP-2 含量與年齡有關(guān)[25]。

2014年，Zhuang團(tuán)隊(duì)選擇了26例接受玻璃體切除術(shù)治療黃斑視網(wǎng)膜劈裂或黃斑裂孔的高度近視（High myopia，HM）患者與26 例特發(fā)性黃斑裂孔或黃斑視網(wǎng)膜前膜非高度近視患者，在玻璃體切除術(shù)中獲得玻璃體樣品，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)量玻璃體中MMP-2 的水平，通過(guò)熒光法測(cè)定MMP活性，結(jié)果顯示HM患者玻璃體中MMP-2水平[（32.40±14.90）ng/ml]明顯高于對(duì)照組[（21.42±6.74）ng/ml，P＜0.01]，同時(shí)，HM患者玻璃體樣品中的MMP活性也明顯升高[26]。隨后，2017 年，樊瑩團(tuán)隊(duì)從25 例HM與30例非高度近視進(jìn)行玻璃體切除術(shù)的患者獲取玻璃體樣本，利用ELISA測(cè)量玻璃體內(nèi)MMP-2的濃度，得到了相同的結(jié)論[27]。

其他眼科疾病對(duì)玻璃體中MMP-2 含量與活性也有研究。2017年，SonikaRathi團(tuán)隊(duì)對(duì)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變進(jìn)行研究，納入30例早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變患兒以及30例先天性白內(nèi)障患兒，術(shù)中獲取玻璃體樣本，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和酶譜法對(duì)玻璃體內(nèi)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)活化的MMP-9和（或）MMP-2水平較高，表明其在疾病發(fā)病機(jī)制中有潛在作用[28]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，2010年，德國(guó)科學(xué)家Florian Hofmaier團(tuán)隊(duì)構(gòu)建自發(fā)性葡萄炎模型的馬，以健康的馬作為對(duì)照組，使用Western印跡定量分析MMP-2和MMP-9表達(dá)，用酶譜法檢查酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在自發(fā)性葡萄炎組的玻璃體中MMP-2表達(dá)減少，活性減少，但MMP-9 表達(dá)和活性增加，這些變化反映了自發(fā)性葡萄膜炎中MMPs的變化[29]。

5 MMP-2在后極部的檢測(cè)

由于人類(lèi)眼部取材的局限性，難以獲得眼球后極部的組織，MMP-2在人類(lèi)眼球后極部的檢測(cè)較為少見(jiàn)。

2008 年，顧永昊團(tuán)隊(duì)就增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜疾病和急性視網(wǎng)膜壞死患者視網(wǎng)膜中MMP的表達(dá)情況，術(shù)后獲取視網(wǎng)膜組織，以供體眼視網(wǎng)膜組織作為正常對(duì)照，冷凍切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)3個(gè)疾病組的MMP-2表達(dá)增強(qiáng)，故MMP-2可能在病變中起重要作用[30]。

MMP-2在動(dòng)物眼睛后極部的研究十分多見(jiàn)，其中大鼠和小鼠是最常見(jiàn)的研究對(duì)象。2000年，Anders Kvanta團(tuán)隊(duì)將誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管形成的大鼠分為激光治療組與未治療組，通過(guò)原位雜交技術(shù)分析MMP-2 mRNA在疾病不同時(shí)期視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的表達(dá)。與未治療組相比，激光治療組的眼睛中，MMP-2 mRNA表達(dá)明顯增加并且主要位于巨噬細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，且侵入脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜下間隙和內(nèi)層視網(wǎng)膜，這種增加在第10天達(dá)到峰值，之后檢測(cè)到下降。該現(xiàn)象支持MMP-2 在年齡相關(guān)性黃斑變性中脈絡(luò)膜新生血管發(fā)展中的作用[31]。與之類(lèi)似，2017 年，鄒俊團(tuán)隊(duì)構(gòu)建高度近視脈絡(luò)膜新生血管的豚鼠模型，通過(guò)免疫組化與PCR對(duì)激光組與對(duì)照組眼睛中視網(wǎng)膜的MMP-2以及MMP-2 mRNA進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣支持MMP-2與高度近視脈絡(luò)膜新生血管形成密切相關(guān)[32]。

除脈絡(luò)膜新生血管以外，糖尿病視網(wǎng)膜病變也與MMP-2的異常表達(dá)相關(guān)。2007年Brahim Chaqour團(tuán)隊(duì)將高血糖致視網(wǎng)膜病變的大鼠與對(duì)照組的大鼠眼睛取出，解剖視網(wǎng)膜，通過(guò)原位酶譜法發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性較弱，MMP-2活性較低[33]。

6 MMP-2在眼科其他疾病組織中的表達(dá)

MMP-2 在正常組織中的異常表達(dá)與眼部組織異常密不可分。而眼科疾病如眼母細(xì)胞瘤、眼黑色素瘤、翼狀胬肉以及其他眼部新生物的發(fā)生發(fā)展，都與MMP-2 的表達(dá)有關(guān)[34-36]。

2011 年，龍華團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用免疫組織化學(xué)SP法和HMIAS-2000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析檢測(cè)50例眼母細(xì)胞瘤組織中MMP-2表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織切片中MMP-2陽(yáng)性表達(dá)38例，占76%；有視神經(jīng)浸潤(rùn)的腫瘤MMP-2的表達(dá)水平明顯高于無(wú)視神經(jīng)浸潤(rùn)的腫瘤，處于眼外期的腫瘤MMP-2的表達(dá)水平明顯高于眼內(nèi)期和青光眼期的腫瘤，提示MMP-2的表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)、發(fā)展有關(guān)系[34]。2017年，Wang團(tuán)隊(duì)通過(guò)原位雜交技術(shù)和免疫組化檢測(cè)6份正常脈絡(luò)膜組織和18份脈絡(luò)膜黑色素瘤組織MMP-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常脈絡(luò)膜組織相比，脈絡(luò)膜黑色素瘤組織中MMP-2 mRNA水平增加，同時(shí)，MMP-2的蛋白水平也較高，支持MMP-2的較高表達(dá)與脈絡(luò)膜黑色素瘤進(jìn)展呈正相關(guān)的觀點(diǎn)[35]。2009年，Yang團(tuán)隊(duì)采用RT-PCR和酶譜法，檢測(cè)5例正常結(jié)膜組織與15例翼狀胬肉組織和其培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞觀察MMP-2 mRNA的表達(dá)和活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)翼狀胬肉組織和成纖維細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)高于正常組織和成纖維細(xì)胞，且與翼狀胬肉的進(jìn)展程度密切相關(guān)[36]。

7 MMP-2的作用機(jī)制

MMPs能降解除多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）成分，參與分解多種細(xì)胞外基質(zhì)和降解基底膜的生理和病理過(guò)程[37]。其中MMP-2主要在組織重塑、傷口愈合、血管生成和炎癥等方面起著重要作用[3]。MMP-2 的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)十分成熟，在疾病組織中的表達(dá)表現(xiàn)出了顯著的異常，但MMP-2在疾病發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制尚未明確。

在機(jī)體遭遇創(chuàng)傷時(shí)，大量炎性細(xì)胞聚集，釋放以TNF-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-6（Interleukin-6，IL-6）為主的早期炎性介質(zhì)，啟動(dòng)全身炎性反應(yīng)。增高的TNF-α和IL-6等炎性介質(zhì)能夠促進(jìn)MMP-2的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)的MMP-2正是導(dǎo)致疾病的原因。在角膜疾病中，IL-6介導(dǎo)的MMP-2顯著上調(diào)，致使組織不斷壞死被降解，導(dǎo)致疾病發(fā)生[38]；在眼腫瘤中，這一系列炎癥反應(yīng)也有重要作用，過(guò)表達(dá)的MMP-2降解ECM，ECM的降解形成局部溶解區(qū)，構(gòu)成腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)通道，直接導(dǎo)致了腫瘤轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)，因此在侵襲性強(qiáng)的腫瘤中，MMP-2往往呈現(xiàn)高表達(dá)[39]。

蛋白質(zhì)直接執(zhí)行生物功能，其表達(dá)與濃度也直接關(guān)系著生理及病理過(guò)程的發(fā)展。在近視的基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)MMP-2 在眼組織中的濃度直接影響了鞏膜重塑，與疾病發(fā)展有密切關(guān)系。多項(xiàng)形覺(jué)剝奪導(dǎo)致近視的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，在鞏膜組織中存在MMP-2的酶原形式，而形覺(jué)剝奪這個(gè)過(guò)程打破了原有的酶原活化平衡，MMP-2的活化形式在鞏膜赤道部及后極部的濃度明顯升高，導(dǎo)致ECM大量降解，最終使后極部纖維層變薄，眼球前后徑方向拉伸[40-42]。mRNA水平也充分說(shuō)明了這一過(guò)程，在形覺(jué)剝奪的過(guò)程中，MMP-2的mRNA表達(dá)上升[43，44]。在負(fù)透鏡誘導(dǎo)的近視模型的研究中[45]，也發(fā)現(xiàn)了相同的變化過(guò)程。這是MMP-2在近視形成過(guò)程中的變化。而在角膜疾病、后發(fā)性白內(nèi)障以及其他疾病中，MMP-2的酶原活化平衡被打破，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生也是目前研究的主要機(jī)制之一[24，46]。

總之，MMP-2 作為MMPs家族中的第二個(gè)成員，在眼部正常的生理過(guò)程和異常的病理生理過(guò)程都有著不可或缺的作用。MMP-2在眼內(nèi)檢測(cè)的技術(shù)也較為成熟。但MMP-2在疾病過(guò)程中的具體機(jī)制與信號(hào)通路尚不明確，是今后研究的重要方向。

利益沖突申明本研究無(wú)任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明蔣潤(rùn)：參與選題、設(shè)計(jì)；撰寫(xiě)論文；根據(jù)編輯部的修改意見(jiàn)進(jìn)行修改。周激波：參與選題、設(shè)計(jì)；根據(jù)編輯部的修改意見(jiàn)進(jìn)行核修