脂肪酶的應(yīng)用進展

劉明麗，李崇萍，劉琨毅,，安江珊，馬燕，趙明,

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院（昆明 650201）；2.西南中藥材國家地方聯(lián)合工程研究中心，藥用植物生物學(xué)重點實驗室（昆明 650201）；3.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院五糧液與食品工程學(xué)院（宜賓 644003）

脂肪酶（Lipase EC 3.1.1.3）是一類特殊的酯酶，能水解三酰甘油酯為脂肪酸、二酸甘油酯及甘油等，其天然底物一般是不溶于水的長鏈脂肪酸?；1]。它的分子由親水、疏水兩部分組成，活性中心靠近分子疏水端，結(jié)構(gòu)中的催化活性中心是由絲氨酸-組氨酸-天冬氨酸/谷氨酸組成的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)[2]，催化反應(yīng)后可使酯類化合物的分解、合成和酯交換，從而形成芳香酯。另外，作為一種重要的生物催化劑，可催化不同底物的水解和合成反應(yīng)，這些催化反應(yīng)一般具有立體選擇性、副反應(yīng)少、反應(yīng)條件溫和、不需輔酶及可用于有機溶劑等特點[3]，這個特性保證其在食品加工、飼料工業(yè)、乳制品、生物醫(yī)藥、生物柴油、洗滌劑等多個領(lǐng)域都有著廣泛應(yīng)用。該文就微生物脂肪酶的來源與制備，以及其在食品工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用進行綜述，以期為脂肪酶的相關(guān)研究提供參考與借鑒。

1 脂肪酶的來源與制備

脂肪酶廣泛存在于動物、植物組織及多種微生物，種類最多的脂肪酶存在于微生物，而國內(nèi)外已報道的微生物脂肪酶來源有細(xì)菌、酵母和真菌等。據(jù)統(tǒng)計產(chǎn)脂肪酶的微生物屬，包括細(xì)菌28個屬，真菌23個屬[4]。由于真菌脂肪酶具有高效、反應(yīng)條件溫和、無毒等優(yōu)點遠(yuǎn)比細(xì)菌脂肪酶多，因而得到快速發(fā)展[5]。真菌脂肪酶主要源于黑曲霉（Aspergillus niger）、南極假絲酵母（Candida antarctica）、根霉（Rhizopus arrhizus）、米曲霉（Thermomyces Lanuginosus）、皺褶假絲酵母（Candida rugosa）等[6]；細(xì)菌脂肪酶主要源于假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、伯克霍爾德菌（Burkholderia）等[7]。由于微生物資源豐富、種類多、繁殖快，工業(yè)化生產(chǎn)脂肪酶的時間短，且成本低純度高，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源。

要獲得脂肪酶，首先要分離出能夠產(chǎn)酶的微生物，因此一套好的菌株分離及篩選方法顯得尤為重要。Haq等[8]從石油污染的土壤中分離到一株脂肪酶產(chǎn)生菌為短桿菌屬（Brevibacterium）；肖海群[9]從50份不同地點采集含油的土樣中，在以橄欖油為底物、溴甲酚紫為指示劑的平板培養(yǎng)基上分離、篩選到兩株脂肪酶產(chǎn)生菌，包括裂殖酵母屬和假絲酵母屬；Cai等[10]從富油土壤中分離到8株產(chǎn)脂肪酶菌株，其鑒定為假單胞菌屬。

微生物脂肪酶的生產(chǎn)主要有液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵2種方法，而大多工業(yè)生產(chǎn)上常采用液體深層培養(yǎng)法生產(chǎn)脂肪酶。為篩選高產(chǎn)脂肪酶的液態(tài)發(fā)酵工藝，劉斌等[11]采用豆餅粉和麩皮對根霉脂肪酶液態(tài)發(fā)酵條件進行研究，接種量2 mL（1×107CFU），28 ℃培養(yǎng)時，可獲得較高脂肪酶活力。穆文俠等[12]對產(chǎn)堿性脂肪酶的海洋青霉菌采用液態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)基組成包括葡萄糖，大豆油，蛋白胨等，發(fā)酵條件進行優(yōu)化后脂肪酶的活力可達(dá)17.43 U/mL。Benjamin等[13]利用液態(tài)發(fā)酵在酵母培養(yǎng)基中添加尿素、麥芽糖、橄欖油和礦物質(zhì)生產(chǎn)脂肪酶，使得脂肪酶最大合成量為12.55 U/mL。另外，為篩選高產(chǎn)脂肪酶的固態(tài)發(fā)酵工藝，Babu等[14]采用不同的混合底物對固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞外脂肪酶進行研究，優(yōu)化培養(yǎng)基的含水量、含碳量和含氮量等參數(shù)，最終脂肪酶活性最高可達(dá)9.3 U/g。Imandi等[15]研究在固體發(fā)酵條件下，利用溶脂酵母生產(chǎn)胞外脂肪酶，對培養(yǎng)基的培養(yǎng)時間、接種量、初始含水量和碳水平等參數(shù)進行優(yōu)化，使得發(fā)酵4 d后脂肪酶活性最高可達(dá)18.58 U/g。楊金梅等[16]研究茶葉固體發(fā)酵中18株散囊菌的水解酶活性，其中平板檢測中有6個菌株表現(xiàn)脂肪酶活性。因此，可以看出采用固液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)微生物脂肪酶，在工業(yè)生產(chǎn)中是較為常用的方法。

2 脂肪酶的應(yīng)用

脂肪酶作為一種重要的生物催化劑，可催化不同底物的水解和合成反應(yīng)。這個催化特性使它在食品加工、乳制品、飼料工業(yè)、生物能源、生物醫(yī)藥、洗滌劑、紡織品等領(lǐng)域均有應(yīng)用，尤其是在食品方面的應(yīng)用更為廣闊。

2.1 脂肪酶在食品工業(yè)的應(yīng)用

2.1.1 脂肪酶在面食加工中的應(yīng)用

近幾年，以酶制劑代替代學(xué)品作為面粉改良劑成為熱點。脂肪酶作為面包粉添加劑酶制劑，利用它催化甘油三酯水解生成甘油二酯、甘油一酯或甘油，可使面團的筋力增強，增大面包的體積和提高面包的入爐急脹等。Li等[17]采用動態(tài)流變儀和掃描電鏡對添加根霉脂肪酶的面團流變特性和微觀結(jié)構(gòu)進行測定，結(jié)果表明根霉脂肪酶提高含面筋的強度和彈性。魏巍等[18]研究在面粉中添加脂肪酶等酶制劑對烘焙品質(zhì)的影響，試驗結(jié)果表明脂肪酶添加量在10～20 mg/kg時老化速度較慢。錢忠英等[19]探究重組疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶能明顯增大面包比容，降低面包硬度，氣味和組織結(jié)構(gòu)的感官得分也是最佳。隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，脂肪酶在食品工業(yè)中面食方面的其他應(yīng)用將越來越廣泛。

2.1.2 脂肪酶在酒類加工中的應(yīng)用

脂肪酶被證實可合成一系列芳香酯[20-21]，可用于白酒增香或強化發(fā)酵復(fù)糟酒等。如李站勝等[22]以濃香型白酒丟糟為研究對象，研究南極假絲酵母脂肪酶B的反應(yīng)時間等工藝條件對復(fù)糟酒酯化效果的影響，結(jié)果表明添加脂肪酶的增酯增香效果好。翟磊等[23]對不同發(fā)酵階段的大曲樣品進行產(chǎn)脂肪酶的微生物菌種的篩選與鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中產(chǎn)脂肪酶微生物是形成特殊風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵，為產(chǎn)脂肪酶提供出發(fā)菌株，也為芝麻香型白酒香氣成分的解析奠定理論基礎(chǔ)。王丹丹等[24]為探究白酒中四大酯的可逆合成與分解規(guī)律，采用南極假絲酵母脂肪酶在水相和有機相中進行酯化反應(yīng)，試驗結(jié)果表明對白酒風(fēng)味酯的形成原理及生產(chǎn)合成具有參考價值。

2.1.3 脂肪酶在肉類加工中的應(yīng)用

隨著食品生物技術(shù)的發(fā)展，利用酶法合成的類似香料的風(fēng)味化合物，可在肉品加工時添加，不僅能使肉的保鮮時間加長，也可以改善肉的品質(zhì)[25]。脂肪酶作為工業(yè)重要酶制劑之一，能使酯類化合物的分解、合成從而形成芳香酯，因而在肉類加工中具有應(yīng)用潛力。封莉等[26]為提高高溫短時烘烤的中式香腸的品質(zhì)，在肉中添加脂肪酶分析中式香腸脂質(zhì)降解及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等的影響，結(jié)果表明添加脂肪酶能有效加速中式香腸中的脂肪降解和脂肪氧化，促進香腸中脂質(zhì)來源的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的生成。Krasnoshtanova[27]通過從肉制品加工副產(chǎn)品中提取酶解蛋白和脂類水解酶提高工業(yè)物質(zhì)酶解效率。You等[28]研究酶學(xué)方法在食品加工中的應(yīng)用，表明脂肪酶是可用于對傳統(tǒng)的肉制品進行改良以生產(chǎn)出更均衡的功能性肉制品。因此，在肉制品加工過程中添加脂肪酶，不僅可以增加風(fēng)味前體物質(zhì)的積累，還有利于促進肉制品風(fēng)味物質(zhì)的生成。

2.1.4 脂肪酶在茶葉加工中的應(yīng)用

趙和濤[29]分析茶葉中的酶及在制茶中的應(yīng)用，概述茶葉中水解酶的酯酶類，其中脂肪酶為重要代表。Patti等[30]采用不同來源的脂肪酶篩選Mucor miehei脂肪酶制備3-O-?；瘍翰杷兀渲邪?種合成途徑，通過制備得到3-O-棕櫚?；瘍翰杷亍Ｏ蛐穂31]采用2種不同方式超聲作用，研究脂肪酶催化茶葉籽油水解的工藝條件，最終優(yōu)化的工藝條件使水解率達(dá)72.25%。方洪楓等[32]利用混菌發(fā)酵綠茶產(chǎn)脂肪酶，研究脂肪酶活性對酯型兒茶素的水解作用，結(jié)果表明脂肪酶對EGCG和ECG的生物轉(zhuǎn)化將為兒茶素代謝途徑的研究和單體兒茶素的生產(chǎn)起到促進作用。在不同的茶葉加工過程中，不同的酶催化、氧化和水解都會導(dǎo)致茶葉品質(zhì)的形成。而茶葉脂質(zhì)作為脂肪酶的底物，在整個加工過程中脂類物質(zhì)含量與種類不同可能導(dǎo)致脂肪酶水解茶葉中部分的有效成分，但具體作用于那些脂類化合物及酯類途徑均未知，后續(xù)需進一步研究以促進酶學(xué)在茶學(xué)中的應(yīng)用與發(fā)展。

脂肪酶水解產(chǎn)物的脂肪酸類本身就具有香氣，對茶葉展現(xiàn)的香氣有重要貢獻(xiàn)，而且還是芳香揮發(fā)物的重要前體物質(zhì)，氧化降解后可產(chǎn)生其他環(huán)狀香氣產(chǎn)物，如茉莉酮和茉莉酸甲酯等[33-35]。馬超龍等[36]分析茶葉加工過程中脂肪酸氧化降解對茶葉香氣品質(zhì)的影響，其中普洱茶樣品中不飽和脂肪酸占脂肪酸總量的76.69%，對香氣品質(zhì)具有重要影響。劉勤晉等[37]分析普洱茶香味成分，其香氣成分大多為脂肪酸和其他化合物在制造過程中氧化降解的產(chǎn)物。另外，微生物參與的后發(fā)酵是普洱茶等黑茶加工的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，前期筆者課題組應(yīng)用宏蛋白組學(xué)技術(shù)，在普洱茶發(fā)酵樣品中鑒定到多個脂肪酶，這些脂肪酶是否參與發(fā)酵中脂肪酸等物質(zhì)的變化，進而影響茶葉香氣有待進一步研究[38]。

2.2 脂肪酶在飼料工業(yè)的應(yīng)用

脂肪酶是脂肪代謝最基本的酶，在飼料工業(yè)中可以改善動物內(nèi)源性消化酶不足的缺點，促進脂肪的消化及動物的快速生長。在生物體內(nèi)，脂肪酶的主要作用是消化分解外來的脂肪，促進細(xì)胞內(nèi)脂類的分解代謝。Tan等[39]研究表明在含高脂的飼料中添加脂肪酶不僅可以提高豬、禽等4%～10%的增重速度和2%～7%飼料利用率，還可以減少糞便的排泄量。楊玉靜[40]、劉德海等[41]、程瑛等[42]對脂肪酶在飼料工業(yè)的應(yīng)用與研究進行綜述，表明在飼料中添加脂肪酶酶能釋放脂肪酸，提高飼料的香味和風(fēng)味。隨著時代的發(fā)展，養(yǎng)殖人員對飼料數(shù)量的需求不斷增加，為滿足動物快速正常生長的需求，就必須要不斷提高飼料的消化與利用，使脂肪酶成為一種必需的飼料添加劑。

2.3 脂肪酶在生物能源中的應(yīng)用

脂肪酶可以催化酯交換、酯轉(zhuǎn)移、水解等反應(yīng)，主要作用是可以促進油脂水解、酯交換和酯化反應(yīng)進行[43]。在油脂工業(yè)中，生物柴油以前主要以動植物油脂為原料制造可再生能源，現(xiàn)在大力發(fā)展大型海洋藻類資源作為原料替代部分燃料，有利于解決中國能源缺少的問題。最典型的生物柴油是脂肪酸甲酯，用脂肪酶作催化劑制備生物柴油是一系列水解和酯化的過程，具有反應(yīng)條件溫和、甘油易回收和無廢物產(chǎn)生等優(yōu)點，受到越來越多的關(guān)注。Bharathiraja等[44]利用海洋大型藻類為材料，以重組畢赤酵母作為催化劑開發(fā)生物柴油，結(jié)果表明穩(wěn)定構(gòu)建的畢赤酵母生產(chǎn)生物柴油的產(chǎn)率達(dá)到85%以上，反應(yīng)結(jié)束時依然保持其脂肪酶活性。因此，采用酶法合成生物柴油是一個有潛力的生物催化過程，也是將脂肪酶用于商業(yè)生產(chǎn)生物柴油的一個重要方向。

2.4 脂肪酶在洗滌劑工業(yè)中的應(yīng)用

日常生活中洗滌劑配方中的表面活性劑主要為脂肪酶。由于許多衣物上的脂肪食品污漬大多由甘油三酯組成，而甘油三酯又是脂肪酶的天然底物，所以脂肪酶的去污效果主要表現(xiàn)在它能分解油脂生成親水性的脂肪酸[45]。Bacha等[46]從橄欖油廠土壤中分離到一株產(chǎn)熱堿性脂肪酶的菌株，在40 ℃預(yù)培養(yǎng)1 h后，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性及與各種商業(yè)洗滌劑的相容性，該結(jié)果表明該脂肪酶可作為洗滌劑配方添加劑的潛力。Chauhan等[47]采用響應(yīng)面對金黃色葡萄球菌脂酶作為洗衣粉添加劑的除油效果進行建模和優(yōu)化，得出以0.69%洗滌劑、47.37 U脂肪酶、pH 7.2、溫度37.18 ℃的工藝參數(shù)。過去十幾年的研究更多的是去了解洗滌過程中污漬去除的機理及去污效果的工藝優(yōu)化，而今后的目標(biāo)更多的應(yīng)該是傾向于挖掘更高效、更穩(wěn)定性的新型脂肪酶以應(yīng)用于工業(yè)。

作為一種生物催化劑，脂肪酶除了在上述工業(yè)中的應(yīng)用，也包括在生物醫(yī)藥、食用油脂、乳制品、紡織品、化妝品、皮革加工等工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

3 結(jié)語與展望

近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)突飛猛進的發(fā)展，脂肪酶相關(guān)研究不斷進步。目前已測定和克隆表達(dá)了米根霉[48]、南極假絲酵母[49]、黑曲霉[50-51]、枯草芽孢桿菌[52]、疏綿狀嗜熱絲孢菌[53]等眾多的微生物脂肪酶基因序列，今后可多從基因工程方面著手，研究特殊環(huán)境中耐高溫、耐酸、耐堿的微生物脂肪酶的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及其功能。特殊環(huán)境的脂肪酶可能在油脂化工、生物柴油、洗滌劑、造紙工業(yè)、皮革加工、聚合物合成等領(lǐng)域的具有更重要的應(yīng)用價值。隨著酶學(xué)研究的進步，肪酶特性研究不斷深入，脂肪酶在食品等工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用將更加廣闊。