蒲地藍(lán)消炎口服液含量測定方法的研究進(jìn)展

曾祥素，歐陽波

蒲地藍(lán)消炎口服液由蒲公英、黃芩、板藍(lán)根、苦地丁4味中藥組成，具有清熱解毒、抗炎消腫的功能，臨床應(yīng)用廣泛，全國一二三級(jí)醫(yī)院覆蓋率達(dá)71%[1]。其主要用于癤腫、腮腺炎、咽炎、扁桃體炎、手足口病等，早期單用可替代抗生素，中期聯(lián)合抗生素增強(qiáng)療效，長期使用降低抗生素耐藥性[2]。目前蒲地藍(lán)消炎口服液已經(jīng)鑒定出79種化學(xué)成分并進(jìn)行了藥味歸屬，蒲公英中綠原酸、咖啡酸、菊苣酸等酚酸類成分，苦地丁中紫堇靈等生物堿類成分，板藍(lán)根中表告依春等生物堿類成分和腺苷等核苷類成分，以及黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A等黃酮類成分為其主要的活性成分[3-4]。2020版《中華人民共和國藥典》[5]只對黃芩苷和菊苣酸2種成分進(jìn)行了質(zhì)量控制。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效，近年來研究者對蒲地藍(lán)消炎口服液的含量測定方法進(jìn)行了廣泛深入的研究。本文對近年來蒲地藍(lán)消炎口服液含量測定方法進(jìn)行了匯總分析，旨在為全面控制其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供借鑒參考。蒲地藍(lán)消炎口服液含量測定方法如下：

1 測定1種化學(xué)成分

吳文華等[6]建立了高效液相色譜(HPLC)法測定蒲地藍(lán)消炎口服液中菊苣酸的含量。樣品70%乙醇直接稀釋。色譜柱：Agilent ZORBAX EclipseXDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈：0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相，流速：1.0 ml/min，柱溫30 ℃，檢測波長為326 nm，菊苣酸的線性范圍為0.0338～0.3376 μg(r=0.9999)，平均加樣回收率為98.91%，RSD為1.7%。

阮治綱等[7]使用HPLC法測定蒲地藍(lán)消炎口服液中咖啡酸的含量。樣品以5%甲酸的甲醇溶液超聲30 min。色譜柱為 ZORBAX Extend-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇—磷酸氫二鈉緩沖液(23∶77取磷酸氫二鈉1.56 g，加水使溶解成1 000 ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0)，流速為1.0 ml/min，柱溫40 ℃，檢測波長為323 nm，進(jìn)樣量10 μl?？Х人峋€性范圍在0.0336～0.6720 μg呈良好的線性關(guān)系(r=0.9999)；平均回收率為99.49%，RSD為0.35%。蔣磊等[8]用HPLC法分析測定蒲地藍(lán)消炎口服液咖啡酸的含量。樣品5%甲酸的甲醇溶液直接稀釋。色譜柱為Hypersil ODS(250 mm×4.6 mm，2.5 μm)，流動(dòng)相為甲醇—磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉1.56 g，加水使溶解成1 000 ml，再加1%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.8～4.0)，流速為1.0 ml/min，檢測波長為323 nm，進(jìn)樣量10 μl，柱溫40 ℃?？Х人嵩诰€性范圍為8.95～53.7 μg/ml，平均加樣回收率為99.99%，RSD為0.35%。上述研究者的方法對蒲地藍(lán)消炎口服液中咖啡酸含量研究進(jìn)行了有益的探索，但流動(dòng)相使用磷酸鹽相對容易對色譜柱、單向閥、柱塞泵造成損壞。

代磊[9]采用HPLC法測定了蒲地藍(lán)消炎口服液中咖啡酸的含量。樣品5%甲酸50%甲醇溶液超聲處理40 min。色譜柱：Eclipse ODS-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇—乙腈—0.05%磷酸溶液(8∶7∶85)，流速：1.0 ml/min，檢測波長：323 nm，進(jìn)樣量10 μl。結(jié)果咖啡酸在0.0348～0.348 μg(r=0.9999)內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為97.6%，RSD為1.5%。該研究對蒲公英主要有效成分咖啡酸的含量測定提供了較為簡便的分析方法。

曲楠楠[10]應(yīng)用HPLC法對蒲地藍(lán)消炎口服液中紫堇靈的含量進(jìn)行了測定。樣品甲醇超聲30 min。采用C18色譜柱，流動(dòng)相：甲醇—磷酸鹽緩沖液(濃度為0.015 mol/L，pH=6.7)(80∶20)，檢測波長：289 nm，流速：1.0 ml/min，進(jìn)樣量10 μl，柱溫：30 ℃。在該檢測條件下，紫堇靈的線性范圍為0.2004～1.002 μg(r=1)，平均加樣回收率為99.50%，RSD為0.1%，樣品10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。該方法可操作性強(qiáng)、樣品處理較簡便，對蒲地藍(lán)消炎口服液中苦地丁藥材的質(zhì)量控制提供了借鑒。

2 同時(shí)測定2種化學(xué)成分

蘇萬福等[11]采用HPLC法同時(shí)測定了蒲地藍(lán)消炎口服液黃芩中的黃芩苷和蒲公英中的菊苣酸含量。樣品加乙腈—水(20∶80)直接稀釋。色譜柱：Agilent Zorbax SB-Pheny1(75 mm×4.6 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相：水—乙腈—甲醇—磷酸(75∶15∶10∶0.2)，流速梯度洗脫，柱溫：40 ℃，波長326 nm，進(jìn)樣量10 μl。結(jié)果黃芩苷在90.58～1449.3 μg、菊苣酸在5.475～54.75 μg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，(黃芩苷r=0.9999、菊苣酸r=0.9998)。黃芩苷和菊苣酸平均回收率分別為99.72%、99.38%，RSD分別為0.92%、0.99%。現(xiàn)行藥典黃芩苷和菊苣酸是分別采用2種分析方法，而且菊苣酸單針進(jìn)樣分析時(shí)間長達(dá)65 min。而本研究實(shí)現(xiàn)了用一種方法同時(shí)測定2種成分，全部檢測時(shí)間23 min，可降低生產(chǎn)分析成本。

陳世雄等[12]通過UPLC(超高效液相色譜)法同時(shí)分析了蒲地藍(lán)消炎口服液黃芩中的黃芩苷和蒲公英中的菊苣酸含量。樣品加乙腈—水(1∶3)直接稀釋。色譜柱Waters Xbridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，波長326 nm，乙腈—0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，進(jìn)樣量10 μl。結(jié)果表明，黃芩苷在90.59～1449.36 μg濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.9999)，菊苣酸在5.48～54.85 μg濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.9998)，黃芩苷和菊苣酸平均回收率分別為105.887%、99.033%，RSD分別為1.03%、1.11%。與現(xiàn)行藥典相比，此方法也縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測效率，可提升產(chǎn)品的生產(chǎn)控制力度。

劉德勝等[13]運(yùn)用HPLC法測定了蒲地藍(lán)消炎口服液中綠原酸和咖啡酸的含量。樣品75%甲醇直接稀釋。色譜柱為Waters SμnfireTMC18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈—0.4%磷酸水溶液(9∶91)，檢測波長為327 nm，柱溫為室溫。綠原酸和咖啡酸分別在濃度14.7～3 750.0 ng/ml，68.4～4 376.0 ng/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系(r2分別為0.9974和0.9984)，平均加樣回收率分別為101.6%，101.1%。RSD都為1.3%。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測定了蒲地藍(lán)消炎口服液中君藥蒲公英清熱解毒的成分綠原酸和咖啡酸的含量，對君藥蒲公英質(zhì)量的進(jìn)一步控制具有參考價(jià)值。

張學(xué)東等[14]建立了同時(shí)測定蒲地藍(lán)消炎口服液中綠原酸和咖啡酸含量的RP-HPLC法。樣品50%甲醇直接稀釋。色譜柱為Inertsil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈—0.04%磷酸水溶液(15∶85)，柱溫35 ℃，檢測波長327 nm。實(shí)驗(yàn)表明，綠原酸和咖啡酸在質(zhì)量濃度為4.0～19.0 μg/ml時(shí)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為Y=37434.0X-45435.1(r=0.9996)、Y=111260X-152136(r=0.9998)。平均回收率分別為99.0%(RSD=1.65%)、100.1%(RSD=1.78%)。本法對蒲地藍(lán)消炎口服液中綠原酸和咖啡酸的含量測定再次提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3 同時(shí)測定5種化學(xué)成分

姜夢華等[4]通過體外抗炎活性為基礎(chǔ)結(jié)合多指標(biāo)篩選了黃芩苷、漢黃芩素、腺苷、菊苣酸和紫堇靈5種成分作為蒲地藍(lán)消炎口服液的質(zhì)量標(biāo)志物并進(jìn)行了含量測定。色譜柱為Agilent SB C18，流動(dòng)相為甲醇—0.1%磷酸水，梯度洗脫，檢測波長280 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。實(shí)驗(yàn)表明，各方法學(xué)考察結(jié)果均符合要求，所測三批樣品5個(gè)質(zhì)量標(biāo)志物的含量都較穩(wěn)定。本研究創(chuàng)新性的提出了囊括蒲地藍(lán)消炎口服液全部4味藥材的質(zhì)量標(biāo)志物，并測量了標(biāo)志物的含量，更能全面反映蒲地藍(lán)消炎口服液質(zhì)量。

4 同時(shí)測定6種化學(xué)成分

吳婷等[15]使用UPLC-MS-MS法測定了蒲地藍(lán)消炎口服液中野黃芩苷、黃芩苷、綠原酸、漢黃芩素、黃芩素和咖啡酸6種成分的含量。樣品50%甲醇直接稀釋。色譜柱為Phenomenex Luna C8(50 mm×2.0 mm，3 μm)，流動(dòng)相為甲醇—0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，體積流量為200 μl/min，進(jìn)樣量2 μl，柱溫35 ℃。質(zhì)譜采用電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測方式進(jìn)行負(fù)離子掃描。各測定成分分別在0.205～2.054、0.414～4.140、0.134～1.335、0.109～1.088、0.541～5.410、0.339～3.390 μg/ml的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r≥0.9994。平均加樣回收率96.25%～101.79%，RSD均<3.5%。此方法整個(gè)進(jìn)樣過程僅需6 min，大大縮短了進(jìn)樣時(shí)間，做到了快速高效、靈敏準(zhǔn)確，為更好地質(zhì)控蒲地藍(lán)消炎口服液提供了依據(jù)。

5 同時(shí)測定7種化學(xué)成分

董自波等[16]采用HPLC法測定了蒲地藍(lán)消炎口服液黃芩中的黃芩苷、漢黃芩素、腺苷、咖啡酸、綠原酸、菊苣酸和紫堇靈7種成分含量。樣品50%甲醇直接稀釋。采用Phenomenex Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇—0.1%三氟乙酸水溶液梯度洗脫，柱溫30 ℃，檢測波長280 nm，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量10 μl，50%甲醇直接稀釋。各成分分別在161.3～1613、0.726～7.260、4.092～40.92、2.212～22.12、2.324～23.24、38.56～385.6、1.816～18.16 mg/L的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。r≥0.9996。平均加樣回收率98.73%～102.1%，RSD均<2.6%。該研究首次覆蓋了蒲地藍(lán)消炎口服液全部4味組方藥材成分的含量測定、對全面控制蒲地藍(lán)消炎口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有參考價(jià)值，但整個(gè)進(jìn)樣時(shí)間100 min，分析時(shí)間較長。

6 同時(shí)測定8種化學(xué)成分

朱粉霞等[17]建立UPLC法同時(shí)測定了蒲地藍(lán)消炎口服液中腺苷、表告依春、咖啡酸、黃芩苷、千層紙素A苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素8種成分的含量。樣品50%甲醇超聲30 min。色譜柱為Acqμity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為甲醇—0.1%甲酸梯度洗脫，流速0.3 ml/min，柱溫30 ℃，波長為275 nm。結(jié)果各被測成分分別在1.22～122.40、0.41～41.20、0.45～45.40、12.03～1203、0.82～81.80、1.01～100.60、0.99～39.40、0.61～60.60 μg/ml的線性濃度范圍呈良好的線性關(guān)系，r≥0.9971。此法快速、準(zhǔn)確，這對化學(xué)成分復(fù)雜的中成藥的分離分析上具有明顯優(yōu)勢，這對蒲地藍(lán)消炎口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了方向與依據(jù)。

7 同時(shí)測定12種化學(xué)成分

高文雅等[18]應(yīng)用UHPLC-QqQ-MS法14 min內(nèi)同時(shí)測定了蒲地藍(lán)消炎口服液中漢黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩素、白楊素、木犀草素、咖啡酸、乙酰紫堇靈、紫堇靈、原阿片堿、水楊酸、尿嘧啶、腺苷12種成分的含量。樣品加入純水溶液稀釋然后離心取上清液。色譜柱為Agilent Extend C18(150 mm×3.0 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相為甲醇—0.1%甲酸水溶液梯度洗脫；柱溫40 ℃，流速0.3 ml/min，進(jìn)樣量2 μl。質(zhì)譜為電噴霧離子化源，動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式，正、負(fù)離子交替模式檢測。上述檢測成分分別在0.06224～16.24、33.95～530.4、0.01364～3.558、0.001157～0.3024、0.001199～0.3130、0.01464～3.821、0.0007395～0.03859、0.06083～3.174、0.002443～0.6374、0.02180～1.138、0.02299～6.000、0.006046～1.578 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2≥0.980平均加樣回收率94.6%～106.9%。研究人員使用UHPLC-QqQ-MS法所測成分覆蓋了蒲地藍(lán)消炎口服液全部4種組方中藥，樣品處理簡便，靈敏度高，檢測快速全面，對全面控制蒲地藍(lán)消炎口服液的質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，對蒲地藍(lán)消炎口服液含量的測定主要集中在各單味藥的特征性成分，其中咖啡酸、綠原酸、黃芩苷、漢黃芩苷、腺苷、紫菫靈是研究蒲地藍(lán)消炎口服液質(zhì)控的主要成分。為保證蒲地藍(lán)消炎口服液療效均一穩(wěn)定，研究能同時(shí)覆蓋全部4味組方藥材的指標(biāo)活性成分的含量測定至關(guān)重要，而不只是同時(shí)檢測多個(gè)化學(xué)成分表象的提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此篩選真正能反映蒲地藍(lán)消炎口服液內(nèi)在品質(zhì)的藥效基礎(chǔ)物質(zhì)并積極應(yīng)用新的檢測技術(shù)和方法進(jìn)行質(zhì)控，才能更加有效控制蒲地藍(lán)消炎口服液質(zhì)量。