兩種術式大鼠急性腎缺血再灌注損傷模型建立的對比研究

胡 彥，王鎖剛，翟瓊瑤，王 帝，汪緒祥，朱時玉，王光策

0 引 言

腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是一種臨床中常見的病理生理過程，指腎組織在缺血后再次獲得血流灌注或氧供應后所產(chǎn)生的損傷，常見于失血性休克、腎動脈阻斷以及腎移植等情況[1-2]。腎屬于人體中高灌注血流器官，對缺血及再灌注損傷十分敏感，在發(fā)生缺血再灌注損傷后會出現(xiàn)活性氧、趨化因子和炎癥反應、細胞凋亡等加劇組織損傷，是造成急性腎衰竭和移植腎功能延遲恢復的常見原因[3-7]。國內(nèi)外大量學者通過構建該動物模型來研究其發(fā)生機制及預防措施，常見的建模手術途徑為腹部切口和背部切口。本研究通過經(jīng)背部手術途徑同時阻斷雙側腎蒂成功、穩(wěn)定地建立了大鼠急性腎缺血再灌注損傷模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康SPF級SD大鼠，48只，由鄭州市華興實驗動物養(yǎng)殖場提供，實驗動物許可證號：SYXK(豫)2016-0002，6～8周齡，體重(180±20)g，雄性，標準SPF級飼料飼養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)條件為室溫20～25 ℃, 相對濕度45%～70%，保持通風。

1.2實驗試劑和儀器血肌酐、尿素氮檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，4%多聚甲醛溶液、蘇木素-伊紅染液(北京索萊寶科技有限公司)，IL-6、TNF-α試劑盒(江蘇酶免有限公司)，酶標儀(MUL TISKAN FC, 美國)，光顯微數(shù)字成像分析系統(tǒng) (Kodak，美國)，高性能冷凍臺式離心機 (ST40R，Thermo公司)，低溫冷凍切片機(HD-1800)、石蠟包埋機(HD-310B)、脫水機(HD-300)、攤片機(HD-330)，均購于湖北惠達有限公司。

1.3造模方法

1.3.1 動物分組適應性飼養(yǎng)1周,隨機數(shù)字表法將48只SD雄性大鼠隨機分為：正常對照組、腹部手術組、背部手術組，造模術后24 h 對各組大鼠采血并取材(n=8)，剩余各組大鼠術后繼予以蒸餾水灌胃處理30 d(n=8)，每天上午8點灌胃1次，同條件下飼養(yǎng)并密切觀察。

1.3.2手術過程①麻醉：術前12 h禁食，麻醉前稱量，采用3%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)腹腔注射。②游離及暴露雙側腎蒂：麻醉后，腹部手術組大鼠呈仰臥位固定于操作臺，備皮、消毒鋪巾后，從腹部正中部位切開皮膚及肌肉，切口長約4～5 cm，進入腹腔后將腸管推至一旁，充分暴露雙腎及腎蒂；背部手術組大鼠采取俯臥位從背部脊柱正中位置切開皮膚，切口長約3 cm，于雙側肋弓下緣0.5 cm(雙側距脊柱中線約0.5～1.0 cm)肌肉薄弱部位切一縱行切口，進入腹膜外間隙后見腎周脂肪組織，鈍性分離腎周脂肪組織，可見腎及腎蒂，充分暴露腎蒂；正常對照組無處理。③阻斷腎蒂方法：用無創(chuàng)微型動脈夾同時夾閉雙側腎蒂，5 min內(nèi)腎由鮮紅色變紫黑色，則夾閉成功；夾閉持續(xù)時間為45 min，取除動脈夾后，恢復腎血流灌注，可見腎顏色由紫黑色逐漸變?yōu)轷r紅色，表明腎恢復灌注良好，然后逐層縫合切口，縫閉傷口后再次碘伏消毒。

1.3.3造模成功判定夾閉雙側腎蒂后，5 min內(nèi)腎由紅棕色變成紫黑色，表明血流被阻斷；45 min后松開微型動脈夾，5 min內(nèi)腎變?yōu)榧t棕色，則認為缺血再灌注成功。

1.4實驗相關指標檢測

1.4.1 一般情況觀察SD大鼠術后24 h精神、食量、大便情況等。

1.4.2腎功能生化指標檢測采血后靜置20 min，以離心半徑9 cm、3000 r/min離心10 min后，留取上層血清，應用肌酐、尿素氮檢測試劑盒分別測定大鼠血清肌酐、尿素氮水平。

1.4.3血清IL-6、TNF-α表達水平檢測離心后取上清，根據(jù)對應的ELISA試劑盒步驟繪制出標準回歸曲線，通過各孔樣品的A值計算出IL-6、TNF-α含量。

1.4.4腎系數(shù)的測定麻醉前稱量大鼠體重，過量麻醉處死后迅速摘取雙腎，紗布擦凈后稱重，腎系數(shù)公式如下：

腎系數(shù)=雙腎質(zhì)量(g)/體重(100g)×100%

1.4.5腎組織病理學檢測取各組大鼠新鮮腎組織，4%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，包埋，制片，烘干后HE染色，在顯微鏡下觀察大鼠腎組織病理形態(tài)學改變。

1.4.6腎小管壞死半定量評分通過HE染色觀察腎皮質(zhì)及外髓區(qū)域上皮細胞壞死、刷狀緣丟失、腎小管擴張情況，每個玻片在×400高倍鏡下選取10個區(qū)域?qū)δI小管壞死百分比進行統(tǒng)計[8]，評分原則如下：0分：無損傷；1分：<10%；2分：11%～25%；3分：26%～45%；4分：46%～75%；5分：>75%。由兩名技術人員盲法進行評估平均值計算。

1.4.7體重術后30 d觀察大鼠的一般情況，每3天測量記錄體重值。

1.4.8腸梗阻發(fā)生率及腹腔感染率的比較術后30 d內(nèi)密切觀察大鼠存活情況、腸梗阻發(fā)生率及腹腔感染情況，統(tǒng)計并進行評估比較。

2 結 果

2.1 大鼠24 h一般情況比較腹部手術組、背部手術組大鼠造模手術操作均成功。正常對照組大鼠精神狀態(tài)佳，食量正常，大便呈顆粒狀；腹部手術組大鼠術后出現(xiàn)精神萎靡，活動倦怠，食量明顯減少，大便較稀，體重減輕，術后有3只大鼠傷口出現(xiàn)滲液情況,其中有2只鼠存在腹部膨隆表現(xiàn)。背部手術組大鼠造模后精神狀態(tài)良好，活動稍減弱，食量無明顯變化，大便呈顆粒狀，未出現(xiàn)腹部膨隆及傷口滲血情況。

2.2腎功能的測定與正常對照組比較，腹部及背部手術組大鼠血清肌酐、尿素氮水平明顯增高(P<0.05)。見表1。

表 1 各組大鼠血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平的比較

2.3血清IL-6、TNF-α表達水平檢測與正常對照組比較，腹部和背部手術組血清中IL-6、TNF-α 表達水平明顯升高(P<0.05)，與腹部手術組比較，背部手術組大鼠炎癥因子表達水平較低(P<0.05)。見表2。

表 2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α表達水平的比較

2.4腎系數(shù)的測定與正常對照組比較，腹部和背部手術組大鼠腎系數(shù)值顯著增加(P<0.05)，見表3。

表 3 各組大鼠腎系數(shù)的比較

2.5腎組織病理學觀察鏡下觀察發(fā)現(xiàn)手術組腎小管上皮組織腫脹明顯，大量腎小管上皮細胞萎縮、壞死溶解改變，管腔擴張程度明顯，組織間質(zhì)水腫，左、右腎損傷程度基本一致，而正常對照組腎小管上皮細胞無形態(tài)病理學改變，細胞無腫脹變形、壞死。見圖1。

①正常腎小球； ②正常腎小管上皮細胞； ③萎縮、壞死的腎小管上皮細胞； ④擴張的腎小管

2.6雙腎組織腎小管壞死半定量評分的測量計算與正常對照組比較，腹部及背部手術組腎小管壞死評分明顯增高(P<0.05)，左、右腎組織腎小管壞死評分結果趨勢基本一致。見圖2。

與正常對照組比較，*P<0.05

2.7術后30 d大鼠一般情況比較正常對照組大鼠無異常情況，背部手術組大鼠術后清醒基本正常飲食水，精神無異常，活動較正常對照組稍微減弱，食量基本正常，傷口恢復良好；腹部手術組大鼠術后24 h無明顯進食現(xiàn)象，飲水量較少，精神一般，活動較正常對照組明顯減弱，糞便形狀稀，傷口恢復相對較差，部分大鼠傷口出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象，其中2只出現(xiàn)滲液等情況。腹部手術組大鼠在術后9 d左右體重一直呈下降趨勢，背部手術組在術后3 d內(nèi)體重呈輕微下降后出現(xiàn)體重增加趨勢，對照組體重一直呈上升趨勢，見圖3。

圖 3 術后各組大鼠體重變化折線圖

2.8術后30 d大鼠存活率、腸梗阻發(fā)生率及腹腔感染率比較術后30 d背部手術組大鼠存活率明顯高于腹部手術組(P<0.05)，在造模術后腹部手術組中分別在術后第2、3、7天發(fā)現(xiàn)大鼠死亡，其中術后第2和第3天共出現(xiàn)2只大鼠因發(fā)生腸梗阻現(xiàn)象死亡，還有2只大鼠在術后第7天因出現(xiàn)腸梗阻合并嚴重腹腔感染死亡，見表4。

表 4 各組大鼠30 d存活率、腸梗阻發(fā)生率及腹腔感染率比較(%)

3 討 論

急性腎缺血再灌注損傷是導致急性腎損傷的主要原因之一，其機制復雜，成功地構建模型是實驗研究成功的第一步。常見的建模方式包括單側或雙側夾閉腎動脈、夾閉雙側腎動脈和靜脈、單側夾閉腎動脈或腎動靜脈并切除對側腎[9-11]，急性腎缺血再灌注造模缺血時間大多數(shù)控制在30～60 min之間，當缺血時間少于30 min則腎能夠迅速代償增殖來恢復其功能，當缺血持續(xù)時間超過60 min可能會導致急性腎小管壞死和腎衰竭[12]。我們團隊前期通過多次反復實驗，確定結扎腎動靜脈時間最佳時間點為45 min[13]。有學者發(fā)現(xiàn)單純阻斷腎靜脈組較單純阻斷動脈組腎功能嚴重受損，表現(xiàn)為肌酐水平升高，炎癥反應增強，其靜脈阻斷后，腎微血管面臨高動脈壓，導致毛細血管壁破裂和出血，從而引起比較嚴重的腎損傷[14]。而夾閉腎動靜脈受損程度相對于單純腎動脈組較重，但同時不會出現(xiàn)靜脈組這樣嚴重的受損情況。結扎大鼠腎動靜脈相對于單純結扎腎動脈模型更加穩(wěn)定，單純結扎腎動脈模型肌酐水平會在術后復灌24 h出現(xiàn)峰值性后出現(xiàn)快速下降情況，而結扎腎動靜脈組模型肌酐水平在術后復灌72 h內(nèi)未出現(xiàn)明顯下降趨勢，給藥物研究提供更長時間、更穩(wěn)定、更可靠的藥效平臺[15]。

本研究在該基礎上探討手術入路途徑的改良，更深一步完善模型的構建，實驗從大鼠背側入路建立急性腎缺血再灌注損傷模型，更好避免腹側手術帶來的手術壓力等不良影響。IL-6和TNF-α 是誘發(fā)早期炎癥反應的主要因子[16]，實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)背部及腹部手術組炎癥因子表達水平明顯升高，但經(jīng)背部組炎癥因子表達水平相對經(jīng)腹部組明顯降低。對比各組大鼠術后狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)背部手術組術后一般情況明顯較腹部手術組改善，術后飲食水基本無影響，3d基本恢復良好，體重呈平穩(wěn)上升的趨勢，而背部手術組出現(xiàn)明顯飲食不佳、精神狀態(tài)差等系列問題，考慮手術影響胃腸道功能，術后各組大鼠予以蒸餾水灌胃模擬常規(guī)給藥方式干預，發(fā)現(xiàn)背部手術組大鼠存活率明顯高于經(jīng)腹部組，死亡原因主要是由腸梗阻和腹腔感染所致。因此，我們認為經(jīng)背部手術途徑較腹部途徑有以下主要優(yōu)勢：①經(jīng)背部組手術切口長度小，且切口位置位于背部，感染因素較少，傷口愈合快；②大鼠腎位置位于后腹腔間隙，經(jīng)背部手術途徑能更快進入該區(qū)域并能清晰找到雙腎及腎蒂結構，不需要撥動腹腔內(nèi)的腸管及其他臟器，對腸管功能基本沒有影響，保障了術后對動物模型的進一步觀察研究；③由于腎蒂的位置更靠近背側，手術造模需預留一定的空間放置微型動脈夾進行夾閉腎動靜脈，從背部途徑在不牽扯腎的情況下即可輕易、方便的分離出腎蒂，并可以清晰看到腎動靜脈；④經(jīng)背部組大鼠術后一般狀態(tài)良好，不影響動物飲食水，不會導致營養(yǎng)不良、免疫力下降等情況影響實驗結果。⑤經(jīng)背部組大鼠造模后病理損傷程度基本同腹部組一致，但體內(nèi)炎癥水平相對較輕，在充分保證模型質(zhì)量的同時降低死亡率，節(jié)約實驗成本，也更符合動物“3R”原則。