腸道菌群結(jié)構(gòu)特征在血壓大幅升高患者的預(yù)測價(jià)值

王 攀，左 琨，韓春明，鐘久昌，趙 蕾，董 瑩，張大鵬，李 晶

0 引 言

高血壓是心血管疾病和腦卒中的主要危險(xiǎn)因素，全球每年約有940萬人因高血壓死亡[1]。血壓水平與心腦血管病發(fā)病和死亡風(fēng)險(xiǎn)存在密切的因果關(guān)系。在對(duì)全球 61個(gè)40～89 歲人群的前瞻性觀察研究中，發(fā)現(xiàn)診室血壓與腦卒中、冠心病事件、心血管病死亡的風(fēng)險(xiǎn)呈連續(xù)、獨(dú)立、直接的正相關(guān)關(guān)系[2]。血壓水平與心力衰竭發(fā)生也存在因果關(guān)系。臨床隨訪資料顯示，隨著血壓水平升高，心力衰竭發(fā)生率遞增[3]。長期高血壓-左心室肥厚-心力衰竭構(gòu)成一條重要的事件鏈。同時(shí)，高血壓也是心房顫動(dòng)發(fā)生的重要原因[4]。因此，探究血壓大幅升高人群的疾病特征，對(duì)高血壓的早期預(yù)警早期診斷意義重大。

人體內(nèi)定植著超過100萬億的微生物[5]。腸道菌群參與機(jī)體的營養(yǎng)代謝、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)以及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等生理過程[6]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的紊亂失調(diào)通過改變代謝產(chǎn)物、炎癥免疫、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種途徑，參與高血壓疾病的發(fā)生發(fā)[7]。研究者發(fā)現(xiàn)，如果血壓大幅升高，老年時(shí)大腦體積明顯縮小，且容易出現(xiàn)白質(zhì)病變[8]。然而，在血壓大幅上升的人群腸道微生物的結(jié)構(gòu)特征尚未見報(bào)道。本研究通過前瞻性隨訪研究，對(duì)基線時(shí)血壓大幅上升的人群的基線時(shí)期腸道菌群微生物進(jìn)行前瞻性分析研究。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取河北省唐山開灤集團(tuán)公司員工的隊(duì)列進(jìn)行研究。以平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure， MAP)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，隨訪2年(2014年5月-2016年5月)。血壓測量采用診室血壓，取3次診室血壓測量的平均值，每次間隔5 min。納入基線時(shí)期未應(yīng)用降壓藥物首診的高血壓患者。最終納入MAP變化大于0 mmHg的研究個(gè)體，合計(jì)52例。將MAP上升的幅度≥10 mmHg患者納入上升組(33例)；將上升<10 mmHg患者納入對(duì)照組(19例)。排除癌癥、心力衰竭、腎功能衰竭、吸煙、卒中和外周動(dòng)脈疾病，糖尿病或高膽固醇血癥的患者；以及采樣前8周內(nèi)服用過抗生素或益生菌的個(gè)體。所有研究對(duì)象均已簽署知情同意書。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2018-科-18)。

1.2宏基因組測序本研究隊(duì)列樣本在前一項(xiàng)研究中已經(jīng)進(jìn)行糞便樣本的DNA提取和宏基因組測序，原始測序數(shù)據(jù)已上傳至歐洲核甘酸檔案(ENA)數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB13870)[9]。本研究納入前一項(xiàng)研究的隊(duì)列中，共計(jì)52例樣本的宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析。

1.3腸道菌群生物多樣性指數(shù)計(jì)算α多樣性分析：通過分析屬級(jí)別和種級(jí)別的多樣性指數(shù)、豐富性指數(shù)和均一性指數(shù)判定腸道菌群的α多樣性特征。α多樣性指數(shù)應(yīng)用QIIME (Version 1.7.0)計(jì)算； 豐富性指數(shù)和均一性指數(shù)應(yīng)用R software (Version, 3.3.3)中vegan package計(jì)算。β多樣性分析用于評(píng)估樣品間細(xì)菌群落復(fù)雜性的差異，使用UniFrac軟件對(duì)樣品進(jìn)行差異分析，包括UPGMA聚類樹分析、主成分分析、主坐標(biāo)分析和非度量多維定標(biāo)。

1.4腸型分析根據(jù)屬的相對(duì)豐度，采用Jensen-Shannon散度法和medoids法對(duì)各樣品的群落類型進(jìn)行聚類。使用Calinski-Harabasz index16評(píng)估集群的最佳數(shù)量。設(shè)定平均相對(duì)豐度≥10-4且在≥6個(gè)樣本中出現(xiàn)的屬將進(jìn)行最終分析。

本研究中，通過探究LVMAP和HVMAP兩組在基線時(shí)期的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異。采用PAM聚類劃分方法，根據(jù)菌屬的豐度確定腸型。根據(jù)Calinski-Harabasz (CH)索引，最佳腸型數(shù)為2種。利用JensenShannon距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析。將樣本劃分為2種不同的腸型。擬桿菌Bacteroide為腸型1中含量最高的主導(dǎo)菌屬；普氏菌Prevotella為腸型2中含量最高的主導(dǎo)菌屬。

1.5厚壁菌門與擬桿菌門細(xì)菌比值計(jì)算對(duì)測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理以獲得有效數(shù)據(jù)?；谟行?shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)行宏基因組組裝、物種注釋及豐度分析，進(jìn)而計(jì)算各樣本中厚壁菌門與擬桿菌門細(xì)菌所占豐度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行計(jì)算，非正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)以M(P25，P75)表示，組間比較采Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。并用Benjamini和Hochberg方法校正P值進(jìn)行多次檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組間基線參數(shù)比較2組患者基線參數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2患者腸道菌群生物多樣性的比較

2.2.1α多樣性本研究中α多樣性的研究結(jié)果表明，在生物多樣性方面，無論在屬級(jí)別或是種水平，兩組患者α多樣性指數(shù)(屬級(jí)別：2.72±0.43vs2.79±0.47；種級(jí)別：3.77±0.64vs3.88±0.50)，豐富性指數(shù)(屬級(jí)別：754.00±212.47vs695.00±148.24；種級(jí)別：2475.00±600.52vs2282.00±435.47)以及均一性指數(shù)(0.29±0.065vs0.282±0.07；種級(jí)別：0.49±0.07vs0.51±0.06)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖 1。提示血壓大幅升高人群在基線時(shí)期的腸道菌群的α多樣性并無顯著性改變。

表 1 各組患者基線參數(shù)比較

圖 1 上升組與對(duì)照組患者基線腸道菌群α生物多樣性比較

2.2β多樣性在本研究中β多樣性分析結(jié)果顯示，在屬級(jí)別和種級(jí)別，2組樣本在非度量多維定標(biāo)、主成分分析、主坐標(biāo)分析的散點(diǎn)分布圖中，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖 2。表明血壓大幅升高人群在基線時(shí)期的腸道菌群β多樣性與對(duì)照組相似。

圖 2 上升組與對(duì)照組患者基線腸道菌群β生物多樣性比較

2.3腸道微生物群落結(jié)構(gòu)在腸型分布的比較為探究2組患者基線時(shí)期的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異，進(jìn)一步分析2組人群在擬桿菌和普氏菌代表的兩種不同腸型中的分布情況，見圖3。擬桿菌Bacteroide為腸型1中含量最高的主導(dǎo)菌屬；普氏菌Prevotella為腸型2中含量最高的主導(dǎo)菌屬(P1=3.32e-08，P2=1.61e-14)，見圖3。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HVMAP組患者更多分布于Bacteroide腸型，而LVMAP組樣本更傾向于分布在Prevotella。2組人群在Bacteroide腸型的比例分別為43.3%和56.7%。在Prevotella腸型的比例分別為56.7%和43.3% ，見圖3。

2.4厚壁菌門/擬桿菌門比例2組人群中物種相對(duì)豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.53±0.39vs0.61±0.52，P=0.72)，見圖3。結(jié)果表明，血壓大幅升高人群在基線時(shí)期的腸道菌群厚壁菌門/擬桿菌門比例尚無顯著性改變。

圖 3 上升組與對(duì)照組患者基線腸道微生物群落腸型與比較

3 討 論

高血壓是心血管疾病最常見的可改變的危險(xiǎn)因素。2015年的一項(xiàng)研究表明，腸道菌群穩(wěn)態(tài)失調(diào)與高血壓之間具有直接的相互關(guān)聯(lián)性[11]。高血壓相關(guān)的腸道菌群穩(wěn)態(tài)的失調(diào)主要表現(xiàn)為，厚壁菌門與擬桿菌門比例升高，腸道微生物的豐富性顯著降低；產(chǎn)生醋酸鹽、丁酸鹽的腸道細(xì)菌顯著減少，而產(chǎn)生乳酸鹽的細(xì)菌顯著增加。本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明，在高血壓前期和高血壓人群中，微生物豐富度和多樣性顯著降低，與健康狀態(tài)相關(guān)的細(xì)菌減少，普氏菌和克雷伯菌過度生長[10]。此外，高血壓前期組的微生物群特征與高血壓組非常相似。近年來，越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群的紊亂失調(diào)與高血壓之間甚至存在著因果關(guān)系，腸道微生物參與了高血壓疾病的發(fā)生和發(fā)展[12]。一項(xiàng)研究中，與常規(guī)小鼠相比，無菌小鼠對(duì)AngII的升壓反應(yīng)減弱，表明腸道菌群介導(dǎo)了血管緊張素誘發(fā)的血壓升高[13]。高血壓能夠塑造宿主腸道菌群，而改變腸道微生物同時(shí)也具有調(diào)節(jié)血壓的作用。

因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過前瞻性的研究，隨訪隊(duì)列人群2年后的血壓變化，對(duì)比MAP大幅上升患者與對(duì)照組在基線時(shí)的腸道菌群結(jié)構(gòu)特征，試圖分析腸道菌群結(jié)構(gòu)變化特征對(duì)平均動(dòng)脈壓大幅上升患者的預(yù)測價(jià)值，探索潛在的促進(jìn)血壓進(jìn)行性升高的腸道微生物結(jié)構(gòu)特征，為高血壓的防治提供新的策略和思路。本研究分別納入MAP上升≥10 mmHg及<10 mmHg的患者，分析其血壓變化前的基線時(shí)期，腸道菌群的生物多樣性及腸型特點(diǎn)。結(jié)果顯示，兩組并差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明基線時(shí)MAP大幅上升人群的腸道微生物結(jié)構(gòu)特征與對(duì)照組相似，提示腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的紊亂失調(diào)的程度對(duì)平均動(dòng)脈壓大幅上升的預(yù)測價(jià)值有限。

既往多項(xiàng)研究表明，研究者認(rèn)為腸道微生物在多種疾病中具有預(yù)測和早期診斷疾病的潛力。梭桿菌，脆弱擬桿菌和腸致病性大腸桿菌均是結(jié)直腸癌的致癌菌，作為生物標(biāo)志物時(shí)具有預(yù)測價(jià)值[14]。這些研究表明，腸道微生物組可作為結(jié)直腸癌早期篩查的有效工具[15-16]。另外，橋本甲狀腺炎患者腸道菌群發(fā)生改變，且腸道菌群與臨床參數(shù)相關(guān)，提示腸道菌群組成數(shù)據(jù)可用于疾病診斷[17]。此外，懷孕前和懷孕期間的微生物群調(diào)節(jié)和修飾可能為預(yù)防和治療減少超重和肥胖的風(fēng)險(xiǎn)提供新的方向[18]。但本研究中析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組患者在基線時(shí)期腸道菌群結(jié)構(gòu)特征十分類似，對(duì)未來宿主的血壓水平上升并不具有足夠的預(yù)測價(jià)值，也提示可能存在腸道菌群以外的其他生物學(xué)特征作為血壓上升的預(yù)測生物標(biāo)志，仍待進(jìn)一步研究和探索。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，基線時(shí)平均動(dòng)脈壓大幅上升人群的腸道微生物結(jié)構(gòu)特征與對(duì)照組相似，腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的紊亂失調(diào)的程度對(duì)平均動(dòng)脈壓大幅上升的預(yù)測價(jià)值有限。