枇杷葉總黃酮的水提工藝研究

王增斌,宋 雪,龐同匯,包俊文,于 丹,魯周民

(西北農(nóng)林科技大學 林學院，陜西 楊凌 712100)

枇杷(Eriobotryajaponica)是薔薇科枇杷屬常綠植物，因果實形狀似琵琶而得名，栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富[1]。中國是枇杷的原產(chǎn)地，也是世界上最主要的枇杷生產(chǎn)國，產(chǎn)量約占世界枇杷總產(chǎn)量的70%[2]。枇杷屬于亞熱帶常綠小喬木，國內(nèi)主要分布在福建、江蘇、浙江、湖北、四川、云南、安徽以及陜南等地[3]，國外分布于西班牙、意大利、土耳其、巴西以及日本、巴基斯坦等東南亞國家[4]。枇杷葉別名巴葉、蘆桔葉，是傳統(tǒng)中藥材，其性微寒，味苦辛，具有止咳清肺、降逆止嘔的功效，多用于肺熱咳嗽、氣逆喘急、胃熱嘔逆和煩熱口渴等治療[5]。枇杷葉中含有多種化學成分，主要包括多酚類、黃酮類、三萜酸類、倍半萜類、揮發(fā)油、糖苷類等[6]。其中，黃酮類化合物亦稱為黃堿素、黃酮體和類黃酮，廣泛存在于自然界中，數(shù)量眾多，可列為天然酚類化合物之首[7]。相關(guān)研究表明，黃酮類化合物具有抗腫瘤[8]、抗炎[9]、抗腎衰竭[10]、抗氧化[11]、降血糖[12]、自由基清除[13]的能力，應用前景廣泛。

近年來，有關(guān)植物功能成分的提取研究日益增多，提取技術(shù)也在不斷創(chuàng)新，包括水提法、醇提法等傳統(tǒng)提取技術(shù)以及超聲、微波等新型輔助提取技術(shù)。研究表明，生枇杷葉和炙枇杷葉水提物的止咳化痰平喘效果明顯優(yōu)于醇提物[14]。枇杷生長葉水提物中含有較高的黃酮類化合物，比醇提物具有更強的止咳作用；而落葉醇提物含有較高的三萜酸類物質(zhì)，祛痰效果更好[15]。目前，枇杷葉水提物研究文獻，大多是在單一固定條件下進行提取，而有關(guān)在超聲輔助條件下，對提取條件進行優(yōu)化的研究還鮮有報道。本文以枇杷枝條下部成熟葉片為試驗材料，比較系統(tǒng)地對枇杷葉總黃酮的水提工藝進行正交優(yōu)化研究，旨在為枇杷葉的進一步開發(fā)應用提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 2019年4月于西北農(nóng)林科技大學南校區(qū)枇杷園，選取枇杷樹冠四周成熟枝條下部葉片。

1.1.2 試劑 蘆丁標準品、蒸餾水、無水乙醇、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉(購自廣東光華科技股份有限公司)；以上藥品均為分析純。

1.1.3 儀器 萬分之一分析天平、便攜式電子天平、電熱恒溫鼓風干燥箱、粉碎機、數(shù)控超聲波清洗器、臺式高速離心機、紫外—可見分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 將采摘的枇杷葉刷去絨毛，清洗干凈，放入托盤，置于烘箱中60 ℃干燥至絕干。待冷卻至室溫后粉碎，過40目篩。按試驗設(shè)計，準確稱取枇杷葉粉末0.50 g，置于50 mL離心管中，加入蒸餾水，浸泡30 min后進行超聲提取。12 000×g離心10 min，取上清液0.4 mL用于總黃酮提取率測定[16-17]。

1.2.2 單因素試驗

(1)料液比對總黃酮提取率影響試驗

精確稱取0.50 g枇杷葉粉末6份，分別置于50 mL離心管中，按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入蒸餾水，浸泡30 min；在溫度30 ℃，超聲波功率100 W下提取30 min，研究料液比對總黃酮提取率的影響[18]。

(2)提取溫度對總黃酮提取率影響試驗

精確稱取0.50 g枇杷葉粉末6份，分別置于50 mL離心管中，按照料液比1∶20加入10 mL蒸餾水，浸泡30 min；改變提取溫度，分別為30、35、40、45、50、55 ℃，在超聲波功率100 W下提取30 min。研究提取溫度對總黃酮提取率的影響。

(3)提取時間對總黃酮提取率影響試驗

精確稱取0.50 g枇杷葉粉末6份，分別置于50 mL離心管中，按照料液比1∶20加入10 mL蒸餾水，浸泡30 min；在提取溫度50 ℃，超聲波功率100 W下，分別提取10、20、30、40、50、60 min。研究提取時間對總黃酮提取率的影響。

(4)超聲波功率對總黃酮提取率影響試驗

精確稱取0.50 g枇杷葉粉末6份，分別置于50 mL離心管中，按照料液比1∶20加入10mL蒸餾水，浸泡30 min；在提取溫度50 ℃下，改變超聲波功率，分別為50、60、70、80、90、100 W，提取30 min。研究超聲波功率對總黃酮提取率的影響。

1.2.3 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，固定料液比為1∶20，對提取溫度、提取時間和超聲波功率三因素采用L9(34)正交表進行試驗設(shè)計[19]，對枇杷葉總黃酮的提取工藝進行正交設(shè)計，試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3 指標測定方法

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 25.0和Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對總黃酮提取率的影響 從不同料液比條件下，枇杷葉總黃酮提取效果圖(圖1)可以看出，在試驗條件下，隨著料液比的增大，總黃酮提取率先升高，在料液比為1∶20時枇杷葉中總黃酮提取率最高，為3.20%，之后隨著料液比的增大，總黃酮提取率逐漸降低。

圖1 料液比對枇杷葉總黃酮提取率的影響

2.1.2 提取溫度對總黃酮提取率的影響 從不同提取溫度條件下的枇杷葉總黃酮提取效果圖(圖2)可看出，在試驗條件下，隨著溫度的升高，總黃酮提取率逐漸增加，并在50 ℃處達到最大值，為3.80%，可能是由于溫度升高導致分子運動加快，細胞透性增加，使得更多的黃酮類化合物從細胞中溶解出來。當溫度高于50 ℃時，隨著溫度的升高，總黃酮提取率下降，可能是由于溫度過高可能會使得某些黃酮類化合物分解。

圖2 提取溫度對總黃酮提取率的影響

2.1.3 提取時間對總黃酮提取率的影響結(jié)果 不同提取時間條件下的枇杷葉總黃酮提取效果見圖3?？梢钥闯觯谠囼灄l件下，隨著提取時間的增加，總黃酮提取率先升高，在30 min時達到最大值(3.80%)，升高的原因可能是由于黃酮類化合物的溶出需要一定的時間，時間增加使得溶出充分。隨著時間的延長，總黃酮提取率逐漸下降，分析原因可能是在空氣中暴露的時間過長，黃酮類化合物有效成分分解。

圖3 提取時間對總黃酮提取率的影響

2.1.4 超聲波功率對總黃酮提取率的影響 不同超聲波功率條件下的枇杷葉總黃酮提取率變化如圖4，可以看出，在試驗條件下，隨著超聲波功率的增加，總黃酮提取率也逐漸升高，超聲波功率為100 W時的總黃酮提取率最高，為3.75%。分析原因可能是是超聲波頻率的增加會增大細胞的破碎程度，使得更多的黃酮類化合物溶解出。

圖4 超聲波功率對總黃酮提取率的影響

2.2 正交優(yōu)化結(jié)果

從正交優(yōu)化試驗結(jié)果(表2)及其極差分析，和以總黃酮提取率為縱坐標、因素為橫坐標制作的影響因素與總黃酮提取率關(guān)系圖[22](圖5)可以看出，當提取溫度增加時，總黃酮提取率也逐漸升高；當提取時間增加時，總黃酮提取率也逐漸升高；當超聲波功率增加時，總黃酮提取率先升高后降低。該試驗條件下對總黃酮提取率影響程度的大小順序依次為：提取溫度>超聲波功率>提取時間。三種因素的最優(yōu)組合為A3B3C2，即提取溫度55 ℃、提取時間40 min、超聲波功率90 W。在此條件下，總黃酮提取率達到了4.00%，經(jīng)過三次驗證試驗，平均總黃酮提取率為4.18%。通過對正交試驗進行方差分析(表3)，其結(jié)果與極差分析一致。

表2 正交優(yōu)化試驗結(jié)果

圖5 各因素與總黃酮提取率的關(guān)系

3 結(jié)論

在料液比1∶20的情況下，確定了提取溫度、提取時間和超聲波功率這三個因素對于枇杷葉總黃酮提取率大小的影響程度：提取溫度>超聲波功率>提取時間。通過正交優(yōu)化試驗設(shè)計，最終確定了枇杷葉黃酮類化合物超聲輔助水提最佳工藝：提取溫度為55 ℃，提取時間為40 min，超聲波功率為90 W，其總黃酮提取率在此條件下達到了4.18%，可以應用于枇杷葉黃酮類化合物的生產(chǎn)。

表3 正交試驗方差分析表