“吉塞拉6號(hào)”大櫻桃砧木組培快繁技術(shù)研究

高小霞，張 森，童耀宏

(陜西果業(yè)集團(tuán)楊凌種苗科技有限公司，陜西 楊凌 712100)

生產(chǎn)上利用櫻桃矮化砧木進(jìn)行密集栽培可以實(shí)現(xiàn)早掛果、早豐產(chǎn)，達(dá)到經(jīng)濟(jì)效益最大化。目前吉塞拉系列砧木是推廣大櫻桃矮砧密植不可多得的優(yōu)良砧木[1-2]。吉塞拉6號(hào)櫻桃品種是通過(guò)雜交選育而得，母本是歐洲酸櫻桃，父本是灰毛葉櫻桃，1988年引入我國(guó)，經(jīng)過(guò)多年的區(qū)域與生產(chǎn)試驗(yàn)觀察，與大多數(shù)甜櫻桃嫁接親和，具有矮化性、早果性、早豐產(chǎn)、耐澇、抗病、土壤適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[3]，但因是三倍體雜種不能種子繁殖，通常采取的根孽、壓條、扦插等繁殖方式存在繁殖速度慢、生長(zhǎng)不一致，不能及時(shí)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)砧木苗滿足生產(chǎn)需要，限制了我國(guó)櫻桃矮砧密植栽培的發(fā)展[4]。

利用組培技術(shù)可快速大量繁殖生長(zhǎng)一致的優(yōu)質(zhì)吉塞拉砧木種苗，利于櫻桃種苗規(guī)?；a(chǎn)，同時(shí)可為未來(lái)櫻桃脫毒苗木繁育、種質(zhì)資源保存提供理論依據(jù)。目前我國(guó)櫻桃砧木組織培養(yǎng)研究已取得較好成果，殷麗青等研究發(fā)現(xiàn)，吉塞拉6號(hào)叢芽的繼代培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 0.5 mg·L-1+TDZ 0.01 mg·L-1+0.1 mg·L-1NAA+KT 0.5 mg·L-1，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1+IBA 1 mg·L-1，移栽前瓶苗需要進(jìn)行鍛煉[5]。馮社章等研究發(fā)現(xiàn)，吉塞拉5號(hào)的增殖培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，生根最優(yōu)培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.3 mg·L-1，移栽前瓶苗需在自然光環(huán)境下封閉鍛煉并開(kāi)瓶煉苗[6]。黃文江等研究吉塞拉系列葉片再生體系發(fā)現(xiàn)，適宜的葉片再生培養(yǎng)基吉塞拉6號(hào)為WPM+6-BA 5 mg·L-1+ IBA 0.5 mg·L-1，吉塞拉5號(hào)為WPM+6-BA 7 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1，再生率最高分別為100%和71.9%[7]。劉慶忠等研究吉塞拉5、6、7號(hào)三種砧木組培快繁再生體系發(fā)現(xiàn)，三者繼代培養(yǎng)基均為MS+ZT 0.1 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1，生根培養(yǎng)基均為1/2MS+IBA 0.3 mg·L-1[8]。楊俊霞等研究不同激素濃度組合對(duì)大櫻桃矮化砧木瓶苗擴(kuò)繁系數(shù)影響發(fā)現(xiàn)，吉塞拉5號(hào)、6號(hào)與7號(hào)所用的激素濃度存在差異，吉塞拉5號(hào)和6號(hào)在各自適宜的培養(yǎng)基上增殖系數(shù)可分別達(dá)到6.4和5.6[9]。李曉青等研究吉塞拉5號(hào)組織培養(yǎng)技術(shù)體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基與繼代培養(yǎng)基相同，是MS + 6-BA 0.5 g·L-1+NAA 0.2 g·L-1，適宜生根培養(yǎng)基是1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1[10]。目前吉塞拉組培研究在取得進(jìn)展的同時(shí)，生產(chǎn)中存在的玻璃化、莖尖壞死、生根率低等問(wèn)題嚴(yán)重影響種苗生產(chǎn)規(guī)模。本研究以吉塞拉6號(hào)的當(dāng)年生新梢為材料，開(kāi)展組培快繁體系研究，以期為櫻桃矮化砧木規(guī)?；a(chǎn)提供理論與實(shí)踐依據(jù)，為推廣大櫻桃矮砧密植模式奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究的試驗(yàn)材料為吉塞拉6號(hào)，取材時(shí)間是4月中旬至5月中旬，在連續(xù)3～5 d晴天后取材，選取生長(zhǎng)健壯且無(wú)病蟲(chóng)害的半木質(zhì)化枝條，去掉葉片但保留部分葉柄，將枝條剪成2～3 cm的長(zhǎng)莖段待用。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌體系的建立 將處理好的莖段用洗潔精清洗2遍后流水沖洗2 h，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌瓶中，75%酒精處理10～15 s，用無(wú)菌水清洗3遍，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞殺菌消毒8 min，無(wú)菌水清洗6遍，消毒和清洗過(guò)程中不斷震蕩，枝條與溶液充分接觸以使消毒與清洗徹底。殺菌消毒完畢后，用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水分，剝下葉柄，切除與氯化汞接觸的剪口，將長(zhǎng)莖段切成1～2 cm帶芽莖段，垂直接入培養(yǎng)基中。

1.2.2 培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基 初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基采用的基本培養(yǎng)基是改良MS，主要改變的是增加四水硝酸鈣980 mg·L-1和硫酸鉀780 mg·L-1，硝酸鉀減半為950 mg·L-1，將EDTA-Fe替換為EDDHA-Fe，含量為150 mg·L-1，其余不變。兩種培養(yǎng)基中添加蔗糖30 mg·L-1，瓊脂6 g·L-1。生根培養(yǎng)基采用1/2MS，其中是大量減半，其余不變，添加蔗糖20 g·L-1，瓊脂6 g·L-1。各培養(yǎng)基的pH均為5.8，在121 ℃條件下高溫高壓滅菌20 min。在誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)階段的光照強(qiáng)度為3 000～4 000 Lux，溫度為(24±2)℃，光照強(qiáng)度為3 000～4 000 Lux，光周期為白天/黑暗=16 h/8h。在生根階段除溫度變?yōu)?22±2) ℃外，其他條件相同。

1.2.3 不同激素配比對(duì)外植體誘導(dǎo)分化的影響試驗(yàn) 本試驗(yàn)所用激素為IBA和6-BA，6-BA濃度設(shè)置3個(gè)處理，分別為0.4、0.6和0.8 mg·L-1；IBA濃度設(shè)置3個(gè)處理，分別為0.04、0.08和0.1 mg·L-1。本試驗(yàn)共有9個(gè)處理，每個(gè)重復(fù)3次，每個(gè)處理60個(gè)外植體(每個(gè)重復(fù)20個(gè)外植體)。試驗(yàn)時(shí)將處理好的外植體分別接種至初代培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.2.4 不同激素配比對(duì)吉塞拉6號(hào)瓶苗增殖生長(zhǎng)的影響 在增殖階段使用的激素是IBA和6-BA，6-BA濃度設(shè)置3個(gè)處理，分別為0.6、0.8和1.0 mg·L-1；IBA濃度處理也為3個(gè)處理，即0.06、0.1、0.2 mg·L-1，本試驗(yàn)共設(shè)9個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)處理60株(每個(gè)重復(fù)20株)。試驗(yàn)時(shí)切下外植體萌發(fā)的新芽，垂直接入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后轉(zhuǎn)瓶并統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

1.2.5 不同生長(zhǎng)素配比對(duì)吉塞拉6號(hào)組培苗生根的影響 在生根培養(yǎng)基僅添加生長(zhǎng)素，分別是NAA和IBA，NAA濃度設(shè)置4個(gè)處理，分別為0、0.6、0.8、1.0 mg·L-1；IBA濃度設(shè)置也是4個(gè)處理，即0、0.1、0.3、0.5 mg·L-1，本試驗(yàn)共設(shè)16個(gè)處理，每個(gè)重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)20株(每個(gè)處理60株)。試驗(yàn)時(shí)選取生長(zhǎng)健壯一致的植株，切成2 cm的單芽植株，去掉基部葉片，接入各培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)15 d后計(jì)數(shù)生根情況并計(jì)算生根率。

1.2.6 生根瓶苗移栽與馴化試驗(yàn) 瓶苗在生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)15 d后便可長(zhǎng)出健壯的根系，根數(shù)4～5條，根長(zhǎng)約1 cm，不經(jīng)過(guò)閉瓶與開(kāi)瓶煉苗，直接進(jìn)行移栽馴化。將生根植株從瓶?jī)?nèi)拿出，洗掉培養(yǎng)基，栽入穴盤(pán)中，基質(zhì)配比為泥炭∶椰糠∶珍珠巖=12∶5∶3，將穴盤(pán)轉(zhuǎn)入馴化室的小拱棚內(nèi)進(jìn)行馴化，保持小拱棚內(nèi)溫度在24～26 ℃，濕度在90%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對(duì)外植體誘導(dǎo)分化的影響

外植體在初代培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1周后，各個(gè)培養(yǎng)基上均有腋芽開(kāi)始萌動(dòng)，培養(yǎng)4周后統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)基上的腋芽萌發(fā)率，結(jié)果如表1所示。從表中可以看出改良MS中添加BA 0.6 mg·L-1和IBA 0.1 mg·L-1是吉塞拉6號(hào)外植體啟動(dòng)和分化最適宜的初代培養(yǎng)基，誘導(dǎo)萌發(fā)率為92.1%。當(dāng)BA的濃度超過(guò)0.6 mg·L-1時(shí)，外植體萌發(fā)的新芽中出現(xiàn)玻璃化的現(xiàn)象，當(dāng)IBA低于0.06 mg·L-1時(shí)，新芽只有葉片長(zhǎng)出。由此說(shuō)明高濃度的細(xì)胞分裂素會(huì)引起吉塞拉瓶苗的玻璃化，生長(zhǎng)素在吉塞拉6號(hào)外植體的誘導(dǎo)分化中起重要作用，可促進(jìn)莖枝的伸長(zhǎng)。

表1 不同激素配比的外植體誘導(dǎo)分化狀況

圖1 玻璃化的外植體

圖2 正常生長(zhǎng)的外植體

2.2 不同繼代培養(yǎng)基對(duì)瓶苗增殖生長(zhǎng)的影響

本試驗(yàn)中重點(diǎn)研究BA和IBA對(duì)吉塞拉6號(hào)組培瓶苗增殖生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出不同濃度BA和IBA組合對(duì)吉塞拉6號(hào)的增殖生長(zhǎng)影響存在明顯差異。當(dāng)BA的濃度達(dá)到1 mg·L-1時(shí)，瓶苗出現(xiàn)了玻璃化現(xiàn)象；當(dāng)培養(yǎng)基中BA的濃度為0.8 mg·L-1，增殖系數(shù)隨著IBA的濃度增加，先升高后下降，植株生長(zhǎng)健壯，葉片顏色較深；IBA濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，繁殖系數(shù)最高，為3.62。以上結(jié)果說(shuō)明芽的增殖數(shù)量和生長(zhǎng)狀態(tài)取決于BA和IBA的相對(duì)比例，試驗(yàn)結(jié)果與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素的作用原理一致。在實(shí)際的組培苗規(guī)?；a(chǎn)中，需根據(jù)生產(chǎn)情況而選擇不同的培養(yǎng)基。

表2 不同繼代培養(yǎng)基的瓶苗增殖生長(zhǎng)狀況

圖3 玻璃化瓶苗

圖4 正常瓶苗

2.3 不同生長(zhǎng)素配比對(duì)瓶苗生根的影響

植物生長(zhǎng)激素中生長(zhǎng)素對(duì)瓶苗的生根起決定性作用，本試驗(yàn)重點(diǎn)研究IBA和NAA對(duì)吉塞拉6號(hào)試管苗瓶?jī)?nèi)生根的影響，結(jié)果為(表3)這2種激素均可誘導(dǎo)吉塞拉6號(hào)試管苗生根，生根率以及根系的情況并不相同，IBA誘導(dǎo)的根系細(xì)長(zhǎng)，最高生根率為25.9%；NAA誘導(dǎo)的根系粗壯且短，最高生根率為35.1%。單個(gè)激素誘導(dǎo)的植株在10 d后基部膨大，15d后有乳白色根尖冒出，20 d后根系長(zhǎng)約1～2 cm。兩種激素組合誘導(dǎo)的植株在7 d后基部膨大，10 d后根部有乳白色根尖冒出，15 d后根長(zhǎng)約1～2 cm，最高生根率為98.6%，根系粗度適中。綜上所述將2種激素組合后的誘導(dǎo)比單個(gè)激素誘導(dǎo)效果好，本試驗(yàn)較適宜激素配比為NAA 1 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1。

表3 不同生長(zhǎng)素配比的瓶苗生根狀況

圖5 IBA誘導(dǎo)的根系

圖6 NAA誘導(dǎo)的根系

圖7 激素組合誘導(dǎo)的根系

2.4 生根苗的移栽與馴化

本研究中生根瓶苗的馴化移栽不用進(jìn)行瓶?jī)?nèi)煉苗，直接將生根植株洗去培養(yǎng)基，移栽至50孔林木穴盤(pán)中，基質(zhì)中包含泥炭、椰糠和珍珠巖，配比為12∶5∶3(v∶v∶v)，1周后根部有新根長(zhǎng)出，1個(gè)月后移栽成活率達(dá)95%以上，此時(shí)可將穴盤(pán)苗轉(zhuǎn)移至硬化室使其快速生長(zhǎng)，加強(qiáng)水肥管理及病蟲(chóng)害防治，3個(gè)月后苗高便可長(zhǎng)至50 cm以上，可做嫁接的砧木苗用。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)論為適宜吉塞拉6號(hào)的初代培養(yǎng)基是改良MS+ 6-BA 0.6 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1，誘導(dǎo)率為92.5%；繼代培養(yǎng)基是改良MS+6-BA 0.8 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1，增殖系數(shù)為5.6；生根培養(yǎng)基是1/2MS+NAA 1 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1，生根率為98%；生根瓶苗移栽成活率在95%以上。

MS是吉塞拉砧木組織培養(yǎng)中的常用培養(yǎng)基，但在我們實(shí)際生產(chǎn)中作為繼代基本培養(yǎng)基，容易出現(xiàn)植株莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)壞死以及玻璃化現(xiàn)象，本試驗(yàn)采用改良MS作為基本培養(yǎng)基后，成功解決了該問(wèn)題，具體原理需進(jìn)一步探索研究。高濃度BA會(huì)引起吉塞拉瓶苗玻璃化，這與前人研究結(jié)果相同[5,9]。我們發(fā)現(xiàn)瓶苗生根需使用低濃度IBA和高濃度NAA激素組合，與前人的報(bào)道并不一致[5-7,9-10]，這可能與組培苗的內(nèi)源激素、生長(zhǎng)狀況以及培養(yǎng)基的組分等不同有關(guān)；采用這2種激素配比縮短了生根周期，植株根系一致且較短，便于移栽且栽后生長(zhǎng)快；生根瓶苗在移栽前進(jìn)行瓶?jī)?nèi)煉苗并不利于植株的生長(zhǎng)，去除該環(huán)節(jié)可提高移栽成活率，植株長(zhǎng)勢(shì)更強(qiáng)，與前人報(bào)道不同[5-10]，這可能與馴化環(huán)境與移栽后的管理有關(guān)。在實(shí)際生產(chǎn)中省略該步驟縮短了生產(chǎn)周期，節(jié)省生產(chǎn)成本至70%。本研究利用EDDHA對(duì)鐵離子有特殊螯合功效，可提高鐵鹽利用率的功用[11]，首次在吉塞拉砧木組織培養(yǎng)中使用EDDHA-螯合鐵代替了EDTA螯合鐵，促進(jìn)了植株生長(zhǎng)，使用方便。