藍莓提取物對小鼠視網膜光損傷的保護作用研究

尹利端 劉楚怡 仲米存 王長偉 杜芬 李八方

摘要 [目的]建立視網膜光損傷小鼠動物模型，通過該動物模型評價藍莓提取物對視網膜光損傷小鼠的保護作用。[方法]綜合評價不同劑量藍莓提取物對視網膜組織結構的影響，以及對視網膜MDA含量，LDH、SOD、CAT和GSH-Px活性的影響。[結果]藍莓提取物對視網膜光損傷小鼠視網膜組織有顯著的改善作用;藍莓提取物能夠顯著抑制小鼠視網膜細胞中LDH活性，能夠顯著抑制視網膜內部的脂質過氧化，還能夠顯著提高SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶的活性。[結論]藍莓提取物對保護小鼠視網膜光損傷具有顯著作用。

關鍵詞 視網膜光損傷;藍莓提取物;保護作用;抗氧化活性

中圖分類號 R 285.5文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）05-0178-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.050

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Protective Effect of Blueberry Extract on Light-induced Retinal Damage in Mice

YIN Li-duan1，LIU Chu-yi2，3，ZHONG Mi-cun1 et al

（1.Yantai New Era Health Industry Chemical Co.，Ltd.，Yantai，Shandong 264006;2.Marine Biomedical Research Institute of Qingdao，Qingdao，Shandong 266001;3.Ocean University of China，Qingdao，Shandong 266073）

Abstract [Objective] To establish an animal model of retinal light-damaged mice，and evaluate the protective effect of blueberry extract on retinal light-damaged mice through this animal model.[Method] The effects of different doses of blueberry extract on the structure of retinal tissue，as well as on the content of retinal malondialdehyde （MDA），LDH，SOD，CAT and GSH-Px enzyme activity were comprehensively evaluated.[Result]Blueberry extract could significantly improve the retinal tissue of retinal photodamaged mice.Blueberry extract could significantly inhibit the activity of lactate dehydrogenase enzyme in mouse retinal cells，could significantly inhibit lipid peroxidation inside the retina，and could also significantly increase the activity of antioxidant enzymes such as SOD，CAT and GSH-Px.[Conclusion]Blueberry extract has a significant effect on protecting the retina from light damage in mice.

Key words Light-induced retinal damage;Blueberry extract;Protective effect;Antioxidant activity

藍莓又被稱為藍漿果、越橘，其果實中含有豐富的活性物質，包括多糖、酚類以及以糖苷的形式存在的花青素等。研究發(fā)現(xiàn)，藍莓花青素具有抗過敏、抗腫瘤、免疫調節(jié)、抗氧化、保護視力等藥理作用，安全無毒，具有較高的營養(yǎng)和藥理作用，目前已經廣泛應用于藥品、保健、食品等領域[1-2]。近年來，隨著科技的高速發(fā)展，電子光學照明設備、手機電腦等電子產品以及光學診療等設備被廣泛應用于人們的生活中，也使得視網膜光損傷這一問題逐漸引起了人們的重視[3-4]。視網膜光損傷（light-induced retinal damage ，LIRD），是指當視網膜受到過強光照或者過長時間的光刺激時，使得部分或全層的視網膜組織受損，造成難以恢復的視力損害，甚至永久性失明[5]。視網膜光損傷的致病因素可分為光致熱損傷、光致機械損傷和光致化學損傷[6]。其中，光致化學損傷是最主要且最普遍的類型。雖然人的角膜、眼房水、晶狀體可以吸收大部分近紫外光，對其進入視網膜產生阻礙，但長時間的短波可見光照射，特別是藍光波段的照射，仍會導致視網膜損傷。短波可見光能夠透過屈光間質到達視網膜，誘發(fā)視網膜細胞產生自由基，參與脂質過氧化作用，引起視網膜色素上皮細胞萎縮，致使光感受器細胞凋亡，進而導致視網膜色素變性、老年視網膜黃斑變性等一系列眼部疾病[7-9]。

視網膜光損傷的病理過程主要是視網膜感光細胞的凋亡[10]。大量自由基的產生、脂質過氧化、線粒體損害、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、細胞色素氧化酶抑制、視紫紅質作用等都可能參與光損傷視網膜的過程，最終導致視網膜感光細胞凋亡和減少，損傷視網膜組織結構和視功能[11-12]。已有文獻報道，外源性抗氧化劑對光損傷后視網膜具有一定的保護作用[13]。因此，筆者利用強藍光照射的方法[14]，建立小鼠的視網膜光損傷動物模型，并在此模型的基礎上，評價藍莓提取物對視網膜光損傷小鼠的視網膜的影響，初步探討其對小鼠視網膜光損傷保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓提取物（blueberry extract，BE），山東煙臺新時代健康產業(yè)有限公司提供;DPPH檢測試劑盒、羥自由基（OH）檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒及丙二醛（MDA）檢測試劑盒，南寧建成生物工程有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、三氯乙酸、甲醛、甘油等常用試劑均為分析純。UV-2010PC紫外分光光度計，尤尼克（上海）儀器有限公司;熒光顯微鏡，奧林巴斯Olympus公司;SPF級Balb/c小鼠，山東朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.2 藍莓提取物的制備

取速凍藍莓果，于室溫下避光解凍，準確稱取50 g，按照1∶20（m∶V）比例加入提取液，勻漿，于45 ℃水浴浸泡4 h后，超聲波輔助提取30 min，超聲功率為300 W，提取溫度為45 ℃，在3 600 r/min離心15 min，取上清液，旋轉蒸發(fā)濃縮后，真空冷凍干燥得藍莓提取物。

1.3 動物試驗過程

選擇SPF級Balb/c小鼠50只，雌雄各半，平均體重（20±2）g。隨機分為5組試驗組，分別為正常對照組、視網膜光損傷模型組、BE低劑量組、BE中劑量組和BE高劑量組，每組5只雌性、5只雄性，雌雄分籠飼養(yǎng)。分別按照各組對應樣品和計量灌胃，灌服的劑量分別為人體推薦用量的5、10和30倍，正常對照組和模型組灌胃受試物對應溶劑，連續(xù)16 d后，開始光損傷試驗。光損傷試驗：在自制光照箱中安裝2個32 W的藍光燈管[13]，使光照箱中心向各方向平均光強度為（5 000±200） lx，溫度24～28 ℃。光照前暗適應24 h，接著將除正常組外其他各組給予1%阿托品滴眼散瞳，之后即刻放入光照箱進行12 h持續(xù)光照，光照完畢立即進入暗箱12 h，如此重復3次，累計光損傷36 h。光損傷試驗過程中仍然持續(xù)每日灌胃，累計灌胃21 d。最后一次光損傷周期完成暗環(huán)境48 h后，斷頸處死，取眼球待用。

1.4 視網膜形態(tài)學觀察

視網膜組織光損傷會使視網膜組織形態(tài)發(fā)生變化，該組織形態(tài)學觀察，可觀察到各劑量BE組對視網膜組織微觀結構的影響。組織取材后，經PBS清洗，多聚甲醛固定、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋連續(xù)切片后，進行HE染色，用于光鏡檢測，觀察各組視網膜組織形態(tài)，測量視網膜石蠟切片外核層厚度，測量位置為距視神經 240 μm、視網膜損傷最重處。

1.5 光損傷動物視網膜蛋白含量及抗氧化性指標的測定

冰浴條件下摘取眼球，沿赤道部剖開，去除眼前節(jié)，剝離視網膜組織，準確稱取組織質量，以0.1%TBS冷緩沖液為勻漿介質，用組織勻裝機制成10%組織勻漿后，離心取上清，BCA法測定眼球組織中總蛋白含量，并按照南京建成的MDA檢測試劑盒、LDH活力檢測試劑盒、SOD活力檢測試劑盒、GSH-Px活力檢測試劑盒和CAT活力檢測試劑盒說明書，分別測定視網膜中MDA含量、LDH活力、SOD活力、GSH-Px活力和CAT活力，每個樣品重復3次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用 Microsoft Office Excel 2003 進行繪圖，統(tǒng)計學分析采用 SPSS 19.0軟件進行，以t 檢驗進行顯著性分析，P<0.05 差異性顯著，P<0.01 差異性極顯著。所有數(shù)據(jù)均以±S表示。

2 結果與分析

2.1 藍莓提取物對小鼠視網膜組織形態(tài)的影響 觀察視網膜HE染色切片，比較各組視網膜的組織結構和形態(tài)學的差異。如圖1所示，正常組的視網膜組織結構完整，細胞層數(shù)及數(shù)量較多，染色均勻飽滿，視網膜各層細胞分布均勻、排列整齊、細胞貼合緊湊，層次分界清楚，神經節(jié)細胞層、內核層及外核層細胞的形態(tài)圓潤飽滿。與正常組相比，模型組的視網膜完整性欠缺，視網膜厚度明顯變薄，外核層和內核層的細胞層數(shù)顯著減少，分布不均、細胞排列散亂，且細胞間隙變大，表現(xiàn)出皺縮現(xiàn)象。與模型組相比，各BE劑量組的視網膜結構排列更整齊，外核層厚度明顯增加，隨著添加劑量的增大，視網膜結構層次、細胞整齊度及各層細胞層數(shù)也隨之增大。與正常組相比，BE中、高劑量組外核層厚度恢復至正常組水平，但整齊性仍不及正常組。可見中、高劑量藍莓提取物對視光損傷小鼠視網膜組織有顯著的改善作用。

2.2 藍莓提取物對光損傷小鼠眼球外核層厚度的影響

以距視神經 240 μm處外核層厚度為標準，對各組小鼠視網膜外核層厚度進行檢測，結果如表1所示。模型組視網膜上外核層厚度僅為正常組的50.1%，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組相比，不同劑量組BE的外核層厚度均有不同程度的增加，其中BE高劑量組的小鼠視網膜外核層最高。說明BE具有修復光損傷小鼠視網膜外核層的作用。

2.3 藍莓提取物對光損傷小鼠視網膜LDH活性的影響 從表1可以看出，與正常組相比，模型組小鼠視網膜LDH活性顯著升高;與模型組相比，BE不同劑量組的LDH活性顯著降低，且隨著BE灌胃劑量的增加，LDH活性逐漸降低。但各BE組的LDH活性與正常組仍存在顯著差異。說明BE對光損傷視網膜組織LDH活性有顯著的抑制作用。LDH能在氧氣不足的情況下經糖酵解催化丙酮酸產生乳酸，而乳酸的過量堆積對機體有一定的毒害作用，引起機體各組織器官病變。因此，BE可以通過降低LDH活性來減緩視網膜組織病變。

2.4 藍莓提取物對光損傷小鼠視網膜抗氧化酶系的影響

從表2可以看出，與模型組相比，BE各劑量組的SOD活性均極顯著增加（P<0.01），說明3種劑量BE均能夠顯著提高光損傷小鼠視網膜SOD的活性。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著重要作用，可促進超氧化物陰離子自由基的歧化反應，從而保護細胞免受損傷。有研究報道，可見光照射能透過屈光間質到達視網膜，誘發(fā)視網膜細胞產生自由基，并參與脂質過氧化作用[13]。光照可以使細胞內SOD水平下降，而灌胃BE的小鼠視網膜細胞SOD活性較模型組上升，其原因可能是BE能夠將超氧陰離子自由基轉變?yōu)镺 2和H 2O，清除其毒性，減輕并防止過氧化，從而達到保護視網膜的作用。

對各組視網膜CAT活性的檢測結果表明，與正常組相比，模型組小鼠視網膜CAT活性極顯著降低;與模型組相比，BE中、高劑量組CAT活性極顯著升高（P<0.01），說明其能夠提高光損傷造成的視網膜CAT活性降低，增強抗氧化能力。

GSH-Px是一種在細胞內能清除有害的過氧化物代謝產物的酶，能夠阻斷脂質過氧化的連鎖反應，從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。與模型組相比，灌胃21 d中、高劑量BE后，光損傷小鼠視網膜中GSH-Px活性極顯著升高（P <0.01），當劑量高于20倍時，其GSH-Px的活性與正常組無顯著性差異。說明一定劑量BE可促進體內自由基的清除，幫助機體維持GSH-Px的活性，從而對視網膜的結構和功能起到保護作用。

2.5 藍莓提取物對光損傷小鼠視網膜MDA含量的影響

MDA是脂質過氧化的產物，其含量的高低間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。測定各組視網膜光損傷小鼠眼球MDA含量，結果發(fā)現(xiàn)（表2），與正常組相比，模型組小鼠視網膜MDA含量極顯著升高 （P<0.01）;與模型組相比，BE各劑量組的視網膜MDA含量均極顯著降低 （P<0.01）。說明BE對小鼠視網膜內部的脂質過氧化具有有效的抑制作用。

3 結論

該研究分析了藍莓提取物在保護視網膜藍光損傷中的作用。首先制備藍莓提取物，并建立視網膜藍光損傷小鼠動物模型，進而利用該模型發(fā)現(xiàn)藍莓提取物可使視網膜光損傷小鼠的視網膜結構排列更整齊，外核層厚度明顯增加，對光損傷視網膜中LDH活性和MDA含量有顯著的抑制作用，且可顯著提高光損傷小鼠視網膜細胞中SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶活性。綜合以上結果，藍莓提取物對小鼠視網膜光損傷具有明顯的保護作用。

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