小美旱楊初代培養(yǎng)研究

代金玲 烏日罕 李佳琪 華佳文 白玉娥

摘要 以小美旱楊一年生幼嫩莖段為外植體，研究了不同消毒時(shí)間、不同基本培養(yǎng)基類型、不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比下小美旱楊初代培養(yǎng)的情況。結(jié)果表明：莖段表面消毒以75%乙醇30 s+0.1%HgCl 2 12 min為佳;MS培養(yǎng)基中腋芽的萌發(fā)率高于1/2MS和WPM培養(yǎng)基;初代培養(yǎng)最適的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為0.10 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，誘導(dǎo)率為91.67%。

關(guān)鍵詞 小美旱楊;莖段;腋芽誘導(dǎo);初代培養(yǎng)

中圖分類號(hào) S 723文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2021）05-0125-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.035

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Primary Culture Technology of Populus populars

DAI Jin-ling， WU Ri-han， LI Jia-qi et al

（College of Forestry， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010019）

Abstract Taking the stems as explants， the disinfection methods， basic medium and different hormone affecting the initial culture of Populus populars were studied. The results showed that the best disinfection method was using 0.1%HgCl 2 for 12 minutes， it had lower contaminated rate and mortality rate. MS medium was the best one for primary culture， the germination time and growth conditions were better than other mediums. The highest percentage of auxillary bud induction （91.67%） was obtained on MS medium with 0.10 mg/L 6-BA and 0.10 mg/L NAA.

Key words Populus populars;Stem segment;Auxillary bud induction;Primary culture

楊樹是我國(guó)主要的速生造林樹種之一，其蓄積量大、分布范圍廣，對(duì)解決用材問(wèn)題和改善生態(tài)環(huán)境起著十分重要的作用[1]。小美旱楊（Populus populars）為楊樹的一個(gè)雜交種，屬高大喬木，主干通直圓滿、尖削度小、樹皮灰褐色、下部縱裂、側(cè)枝基部與主干呈35°～ 45°角，具有耐干旱、耐鹽堿、抗寒抗病性強(qiáng)、生長(zhǎng)快等優(yōu)良性狀[2]，可用于營(yíng)造速生豐產(chǎn)林、防護(hù)林及四旁植樹。小美旱楊是我國(guó)北方，特別是內(nèi)蒙古河套灌區(qū)首選的農(nóng)田防護(hù)林樹種，占當(dāng)?shù)胤雷o(hù)林總面積60%以上，已經(jīng)形成小美旱楊防護(hù)林體系[3]。

通過(guò)組織培養(yǎng)可縮短苗木生長(zhǎng)周期，提高繁殖率，有利于苗木的規(guī)?；a(chǎn)和推廣[4]。而組織培養(yǎng)技術(shù)的起始階段均涉及外植體取材、滅菌、接種等基本過(guò)程[5]。目前，對(duì)于小美旱楊的研究主要集中在耐鹽、抗旱及抗蟲等方面[6-10]，組織培養(yǎng)報(bào)道僅有數(shù)例[11-12]。該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)影響小美旱楊初代培養(yǎng)的因素進(jìn)行探索和分析，尋求初代培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)條件，旨在為今后小美旱楊離體快繁和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)東區(qū)內(nèi)的小美旱楊一年生幼嫩莖段為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體的處理和消毒。

選擇無(wú)病蟲害、生長(zhǎng)健壯的植株，取一年生枝條帶回實(shí)驗(yàn)室，用流水沖洗去除表面污物，再用毛刷蘸洗衣粉刷洗表面。將莖段剪為10 cm左右的小段，超凈工作臺(tái)中先用75%乙醇消毒30 s，無(wú)菌水沖洗5次，再用0.1%生汞（HgCl 2）消毒，HgCl 2處理時(shí)間分別為6、8、10、12和14 min。各處理均用無(wú)菌水沖洗5次，然后將莖段兩側(cè)與消毒液接觸的部位切掉，切成2 cm左右?guī)б秆康那o段，接種到培養(yǎng)基中，每升培養(yǎng)基均添加倍力凝6 g，蔗糖30 g，pH 5.95～6.00，121 ℃滅菌20 min（以下培養(yǎng)基的蔗糖含量、pH、滅菌方法均相同）。每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種1個(gè)莖段，3次重復(fù)。在培養(yǎng)的第15天，統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率和存活率。

1.2.2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)初代培養(yǎng)的影響。

基本培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)選用WPM、1/2MS、MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基不添加任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。基于“1.2.1”試驗(yàn)結(jié)果，將莖段消毒后進(jìn)行接種。每個(gè)處理20瓶，每瓶接種1個(gè)莖段，3次重復(fù)。接種后記錄腋芽萌發(fā)時(shí)間和生長(zhǎng)狀況，30 d后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率。

1.2.3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)初代培養(yǎng)的影響。

基于“1.2.2”試驗(yàn)結(jié)果，選擇適宜的基本培養(yǎng)基，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選擇6-芐基嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA），濃度梯度6-BA為0、0.05、0.10和0.20 mg/L，NAA為0、0.05、0.10和0.20 mg/L，接種30 d后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)時(shí)間、生長(zhǎng)情況及腋芽萌發(fā)率。

1.2.4 培養(yǎng)條件。

外植體接種后置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行處理和分析。生長(zhǎng)情況的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分為3個(gè)等級(jí)：第1個(gè)等級(jí)為芽細(xì)弱，生長(zhǎng)緩慢，葉色發(fā)黃（+）;第2個(gè)等級(jí)為芽長(zhǎng)勢(shì)一般，葉色淺綠（+ +）;第3個(gè)等級(jí)為芽健壯，生長(zhǎng)較快，葉色濃綠（+++）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同HgCl 2消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響

外植體消毒是獲得無(wú)菌苗的關(guān)鍵，對(duì)小美旱楊莖段采用5種HgCl 2消毒時(shí)間處理。由表1可知，0.1% HgCl 2消毒時(shí)間為6 min時(shí)，外植體污染率為100%。表明消毒時(shí)間過(guò)短，無(wú)法消除外植體上的微生物，導(dǎo)致材料全部感染。隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率大幅降低，當(dāng)消毒時(shí)間為12和14 min時(shí)，污染率分別為13.33%和18.33%，而2個(gè)處理間污染率差異不顯著。消毒時(shí)間為12～14 min均能有效消除外植體上的微生物。但消毒液對(duì)外植體有一定的毒害，處理5的死亡率高于處理4。綜合考慮，當(dāng)消毒時(shí)間為12 min時(shí)消毒效果最好，污染率和死亡率較低，外植體的存活率最高，為81.67%。

2.2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)初代培養(yǎng)的影響

在不添加任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的條件下，3種培養(yǎng)基上莖段腋芽萌發(fā)的情況存在顯著差異（表2）。MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)第10天時(shí)，部分腋芽開始慢慢膨大隨后萌發(fā)，葉片緩慢展開，在第30天統(tǒng)計(jì)萌芽率最高，為76.50%;WPM培養(yǎng)基次之，萌芽時(shí)間為13 d，萌芽率為68.75%;1/2MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)時(shí)間最長(zhǎng)，為16 d，萌芽率最低，為51.00%。因此，MS培養(yǎng)基是小美旱楊初代培養(yǎng)最適宜的基本培養(yǎng)基。

2.3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)初代培養(yǎng)的影響

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)帶芽莖段的再生起著至關(guān)重要的作用。在植物組織培養(yǎng)中，使用最多的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素，通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，可以提高腋芽的萌發(fā)率。從表3可以看出，不同濃度的6-BA和NAA組合均可誘導(dǎo)小美旱楊腋芽萌發(fā)，但是誘導(dǎo)能力存在差異。低濃度組合（6-BA 0.05 mg/L、NAA 0.05～0.20 mg/L）時(shí)，腋芽萌芽時(shí)間、萌發(fā)率及腋芽生長(zhǎng)狀況均不如對(duì)照。而當(dāng)6-BA和NAA濃度為0.20 mg/L時(shí)，由于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度較大，其對(duì)腋芽的誘導(dǎo)產(chǎn)生了抑制作用，且出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。當(dāng)6-BA為0.10 mg/L、NAA為 0.05、0.10 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率分別為86.33%和91.67%，且2個(gè)處理間差異不顯著，但是處理6腋芽的生長(zhǎng)狀況更佳，且萌芽時(shí)間更早。因此，小美旱楊最佳的初代培養(yǎng)基為MS+0.10 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。在最適激素濃度培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8 d的莖段上腋芽開始膨大伸長(zhǎng)（圖1A）;培養(yǎng)15 d的莖段基部形成愈傷組織，腋芽伸長(zhǎng)至約3 cm，葉片展開（圖1B）;培養(yǎng)25 d時(shí)腋芽生長(zhǎng)成莖段，生長(zhǎng)旺盛，葉色濃綠，葉片舒展（圖1C）。

3 結(jié)論與討論

外植體消毒是植物組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)之一。楊樹初代培養(yǎng)中，乙醇、HgCl 2和次氯酸鈉（NaClO）為最常用的消毒液，也有使用雙氧水（H 2O 2）和次氯酸鈣（Ca（ClO） 2）的報(bào)道。試驗(yàn)中采用75%乙醇30 s+0.1%HgCl 2 12 min獲得了較好的消毒效果。黃枝英等[13]以臺(tái)灣速生楊（Fast-growing Taiwan Poplar）嫩莖為材料，用0.1%和0.15%的HgCl 2 溶液分別消毒10、15 min，最后得出使用0.1%HgCl 2溶液消毒10 min 時(shí)，消毒效果最好，此時(shí)污染率為23.3%、出芽率為75.3%。木本植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，次生代謝物分泌較多，容易滋生細(xì)菌，且不易消除;研究中也有3種消毒劑同時(shí)使用的報(bào)道，孫立興等[14]在銀中楊（P.alba ‘Berolinensis）組織培養(yǎng)試驗(yàn)中選用70%乙醇30 s+0.1%HgCl 2 12～15 min+NaClO 5 min消毒。但消毒劑處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)對(duì)植物組織和細(xì)胞有殺傷作用[5]，因此要綜合考慮各方面因素，選擇適合的消毒劑和消毒時(shí)間。

MS是木本植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最為廣泛的培養(yǎng)基，其中鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽等無(wú)機(jī)鹽含量較高，微量元素種類較全[15]。近年來(lái)我國(guó)在楊樹成功離體培養(yǎng)試驗(yàn)中，多數(shù)選用MS培養(yǎng)基。該研究中MS培養(yǎng)基上腋芽萌發(fā)及生長(zhǎng)狀況優(yōu)于1/2MS、WPM，所以MS培養(yǎng)基為小美旱楊初代培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基。李慧等[16]研究了毛白楊（P.tomentosa）30號(hào)和02-9-22號(hào)在MS、1/2MS、1/4MS培養(yǎng)基上腋芽誘導(dǎo)情況，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基上腋芽誘導(dǎo)率最高，與該試驗(yàn)研究結(jié)果相同。陳淑華等[17-18]在銀新楊（P.alba×P.alba var.pyramidalis）和南方常綠楊（P.deltiodes ×P.nigra cv.Chile）初代培養(yǎng)中使用了改良的MS培養(yǎng)，得到了較好的誘導(dǎo)效果。

初代培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和配比的選擇至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，6-BA和NAA這2種激素配合使用對(duì)腋芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)效果明顯，6-BA和NAA常用濃度為0.05～1.00 mg/L。該研究中當(dāng)6-BA為0.10 mg/L、NAA為0.10 mg/L時(shí)，初代培養(yǎng)效果最好，腋芽生長(zhǎng)健壯、葉色濃綠。程云清等[19]對(duì)鞍雜楊（P.×xiaozuanica cv.Anza）莖段進(jìn)行初代培養(yǎng)，篩選出以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基為最佳。鄭艾琴等[20]以河北楊（P.hopeiensis）幼嫩莖段為外植體，篩選出適合河北楊初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.3～0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L。王桂英等[21]以巨霸楊（P.deltoids 50×P.deltoids 36）為研究對(duì)象，6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L組合對(duì)芽萌發(fā)和芽分化生長(zhǎng)有較好的促進(jìn)效果。張瑞芝等[22]篩選出歐美楊（P.nigra×P.deltoides）的最優(yōu)初代培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L。由于樹種、取材位置和時(shí)間等條件的不同，所以篩選出的基本培養(yǎng)基種類和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配也不盡相同。

在接下來(lái)的試驗(yàn)中，課題組將對(duì)繼代培養(yǎng)及再生體系的建立進(jìn)行進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)優(yōu)化了小美旱楊初代培養(yǎng)的條件，建立了離體培養(yǎng)體系，為其快繁和遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

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