甲型流感病毒血凝素糖基化的生物學(xué)效應(yīng)

于海英，王 琨，孫藝學(xué)，叢彥龍*

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；2.長春大學(xué) 政策法規(guī)辦公室，吉林 長春 130022)

許多重要的生命活動、疾病的發(fā)生不僅與蛋白的豐度有關(guān)，更重要的是受到蛋白的翻譯后修飾調(diào)控。其中，糖基化即為蛋白的一種重要翻譯后修飾，它不僅影響蛋白的折疊、定位和轉(zhuǎn)運(yùn)，而且可以改變蛋白的分泌、抗原性、生物活性、半衰期，以及蛋白與其他生物大分子之間的相互作用[1]。

甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)的跨膜纖突蛋白——血凝素(hemagglutinin，HA)在核糖體中合成后轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在此HA依賴宿主的翻譯機(jī)制，在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下將“劫持”的細(xì)胞糖鏈以N-糖苷鍵形式連接到HA的N-連接糖基化基序(N-linked glycosylation sequon，NGS)——N-X-S/T-Y(X和Y是除P以外的任何氨基酸)[2]，從而實(shí)現(xiàn)自身蛋白的糖基化。當(dāng)HA從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)時，糖苷酶和甘露糖苷酶會對HA的糖鏈進(jìn)行修剪和重塑等再加工。需要指出的是，HA的NGS并非都要進(jìn)行糖基化修飾，具體是哪個(些)NGS會被糖基化，加載何種類型的糖鏈，以及糖鏈的加工程度，要取決于IAV感染的特定細(xì)胞[3]。

在空間結(jié)構(gòu)上，HA蛋白是一個以非共價連接的同源三聚體，每個HA單體由胞外域、跨膜域和胞質(zhì)尾區(qū)三部分組成，其中糖基化修飾只發(fā)生于HA胞外域的球狀頭部和莖區(qū)。對于不同亞型、甚至同一亞型的不同IAV毒株，位于它們HA球狀頭部的NGS的數(shù)量和位置可能存在顯著性差異，而位于莖區(qū)的NGS相對保守，變異幅度較小[4]。此外，不同位置的糖鏈對HA蛋白的功能和病毒的生物學(xué)表型亦有不同的影響[5-6]。

1 糖基化修飾影響HA蛋白的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)

HA莖區(qū)糖鏈的作用主要是穩(wěn)定HA蛋白的構(gòu)象以促進(jìn)其胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，同時提高HA蛋白的折疊效率以促進(jìn)三聚體的形成[3，7]。清除莖區(qū)的NGS會嚴(yán)重?fù)p害HA的定位、折疊和寡聚化，改變它的pH敏感性，致使其構(gòu)象不穩(wěn)。以H7N1亞型流感病毒為例，它的HA莖區(qū)至少要保留第12位或第28位的NGS才能保證HA的轉(zhuǎn)運(yùn)效率；如果同時缺失了這兩個NGS，HA的轉(zhuǎn)運(yùn)能力和融合活性將顯著下降。此外，某些重疊性的NGS，例如H2N2亞型流感病毒HA的第20～23位氨基酸殘基NNST，還可以促進(jìn)HA蛋白的正確折疊、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及其生物活性的發(fā)揮[7]。

2 HA糖基化對免疫應(yīng)答的影響

HA糖鏈數(shù)量的增多，尤其是HA頭部糖鏈數(shù)量的增加，是導(dǎo)致IAV出現(xiàn)抗原漂移的重要原因。糖鏈對HA抗原表位的遮蔽是IAV逃避宿主免疫監(jiān)視的重要手段[3]。

2.1 HA糖基化影響病毒的固有免疫應(yīng)答宿主的固有免疫系統(tǒng)通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)識別病原相關(guān)分子模式，以此區(qū)分自我分子與病原分子。PRR既可以分泌于血清和管腔分泌物中(如可溶性C型凝集素)，也可以位于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面(如膜相關(guān)C型凝集素)?？扇苄訡型凝集素主要有表面活性蛋白(surfactant protein D，SP-D)和甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)。SP-D和MBL是流感病毒的天然抑制劑，因?yàn)樗鼈兙哂幸粋€或多個高度保守的糖識別結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合HA頭部糖鏈末端的甘露糖、巖藻糖或半乳糖衍生物，由此發(fā)揮一系列的抗病毒活性，包括抑制血凝、中和病毒、聚集病毒以及拮抗IAV介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞功能障礙等[8]。而膜相關(guān)C型凝集素主要有巨噬細(xì)胞甘露糖受體(macrophage mannose receptor，MMR)、巨噬細(xì)胞半乳糖型凝集素(macrophage galactose-type lectin，MGL)和樹突狀細(xì)胞所特有的細(xì)胞間黏附分子-3結(jié)合非整合素(DC-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin，DC-SIGN)。這些分子可以作為IAV吸附或進(jìn)入Mφ和樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的受體，介導(dǎo)IAV感染巨噬細(xì)胞(macrophage，Mφ)和DC，誘導(dǎo)Mφ和DC釋放抗病毒因子和促炎性細(xì)胞因子，從而抑制病毒的早期復(fù)制，調(diào)節(jié)病毒感染后的炎癥反應(yīng)[7，9]。此外，固有免疫細(xì)胞對IAV的易感性與HA的糖基化程度有關(guān)。HA糖基化程度越高，IAV越容易感染小鼠Mφ，而糖基化程度較低的毒株的感染效率也會降低[7]。因此，了解凝集素與IAV之間的互作，可以為流感的治療和免疫預(yù)防提供新的思路。

2.2 HA糖基化影響病毒的獲得性免疫應(yīng)答作為IAV變異頻率最高的基因，HA對其頭部氨基酸的變異具有高度的耐受性[4]。無論是氨基端替換，還是糖基化修飾，都主要集中于HA頭部5個高度可變的免疫顯性抗原表位[10-11]，這可以干擾甚至阻斷抗體的中和作用。糖鏈對HA中和表位的遮蔽是IAV逃避免疫監(jiān)視的重要手段。此外，HA糖基化還可以調(diào)節(jié)抗體的交叉反應(yīng)和HA不同區(qū)域的體液免疫應(yīng)答。例如，當(dāng)在2009年H1N1亞型流感病毒的第130位添加糖鏈時，盡管該糖鏈遮蔽了HA的一個優(yōu)勢抗原表位，但是改造后的病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體不僅可以與HA的多個抗原表位結(jié)合，而且交叉反應(yīng)性也得到提高。EGGINK等[12]通過增加糖基化試圖屏蔽HA的免疫優(yōu)勢抗原表位的研究發(fā)現(xiàn)，盡管HA頭部的免疫應(yīng)答受到抑制，但是該病毒仍然能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生靶向HA莖區(qū)的高滴度抗體，用其免疫的小鼠能夠阻止其他HA莖區(qū)相同病毒的感染。此項(xiàng)研究表明，靶向HA莖區(qū)以誘導(dǎo)IAV的體液免疫應(yīng)答具有重要的研究價值。

IAV的自然感染既可以誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，又能夠刺激T細(xì)胞反應(yīng)。但T細(xì)胞主要針對IAV內(nèi)部蛋白(如PA和NP)的保守表位產(chǎn)生應(yīng)答，由此介導(dǎo)不同亞型毒株之間的交叉保護(hù)。雖然目前已知HA的CD4+和CD8+T細(xì)胞表位，并且發(fā)現(xiàn)HA糖基化的改變可以幫助IAV逃避T細(xì)胞的識別，但是關(guān)于HA糖基化如何調(diào)節(jié)T細(xì)胞的IAV應(yīng)答仍知之甚少[7，13]。有研究顯示，提高HA的糖基化程度可以干擾CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，表明糖鏈能夠抑制T細(xì)胞接近糖肽-MHC復(fù)合物，從而降低T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。當(dāng)去除HA的部分糖基化，可以暴露HA的T細(xì)胞抗原表位；但如果完全去除HA的糖基化，反而會導(dǎo)致某些T細(xì)胞抗原表位功能的喪失[7]。

3 HA糖基化影響HA的受體親和性和病毒的適應(yīng)性

如上所述，HA糖基化在病毒逃避獲得性免疫中的作用方式是遮蔽或修飾HA頭部5個高度可變的免疫顯性抗原表位。然而，這些抗原表位主要位于HA的受體結(jié)合區(qū)(receptor-binding domain，RBD)附近。當(dāng)糖鏈出現(xiàn)在RBD周邊時，可能由于大體積糖鏈的空間位阻或靜電排斥效應(yīng)而影響HA與細(xì)胞表面唾液酸受體的親和性[14]。這種影響與糖鏈和RBD之間的距離以及HA的糖基化程度有關(guān)。糖鏈距離RBD越近，HA的受體親和性受到的影響越大。如果糖基化程度降低，盡管可以提高HA的受體親和力，但是受體親和的特異性也會隨之降低。反之，當(dāng)HA的糖基化程度增加，HA與受體之間的對接也將受到更大的限制。例如，額外增加糖鏈數(shù)量會損害H2N2亞型流感病毒HA的受體親和性和融合活性，說明HA糖基化模式的改變會影響病毒的適應(yīng)性，這同時也解釋了至今尚未在人群中發(fā)現(xiàn)有HA糖基化增加的H2N2毒株的原因。除了H2亞型流感病毒，H1、H3、H5、H7和H9等亞型病毒的HA糖鏈也可以影響HA的受體親和性及其特異性[7，15]。例如，H5N1病毒HA第158位和169位糖鏈與兩種不同構(gòu)象的HA受體α-2,3-唾液酸和α-2,6-唾液酸在結(jié)合偏好上有所不同。第169位NGS缺失的病毒偏嗜結(jié)合前者，而158位NGS缺失毒更易與后者結(jié)合。

基因變異是病毒適應(yīng)環(huán)境的一種生存策略，然而，變異并不總是有利于病毒的生存。為了生存，病毒已經(jīng)進(jìn)化出了一種“分子耐受機(jī)制”，即通過同一基因或不同基因位點(diǎn)變異的疊加效應(yīng)來彌補(bǔ)某些突變對病毒適應(yīng)性造成的不利影響[16]。研究發(fā)現(xiàn)，IAV可以通過“上位突變(epistatic mutation)”這種代償性的分子耐受機(jī)制來彌補(bǔ)或修復(fù)蛋白的功能，以保持病毒的適應(yīng)性。例如，當(dāng)HA頭部RBD附近出現(xiàn)糖基化時，為了不影響HA的受體親和性，病毒會通過替換RBD或者其他位置的氨基酸，使RBD不至于被糖鏈完全遮蔽，以此保持甚至提高HA的受體親和性[6]。

在IAV的進(jìn)化過程中，HA的NGS數(shù)量有逐漸增加的趨勢，這被認(rèn)為是IAV進(jìn)化的一種選擇優(yōu)勢。然而，HA不會不加節(jié)制地進(jìn)行糖基化修飾，它必須考慮由此帶來的適應(yīng)性成本。HA糖基化修飾的前提是，需要在免疫逃逸和受體親和性之間尋求一種最佳的平衡狀態(tài)。當(dāng)HA糖基化達(dá)到臨界水平時，為了保持病毒的適應(yīng)性，IAV可以通過轉(zhuǎn)換NGS的位置，即某一位置NGS的消失伴隨著另一位置NGS的出現(xiàn)，以此對自身糖基化程度設(shè)置一個適宜的阻力。這或許指征了IAV的另一個進(jìn)化特征：在某種程度上，IAV能夠規(guī)避過度糖基化。

4 小結(jié)與展望

綜上，糖基化修飾不僅有利于HA蛋白的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和折疊，而且是IAV逃避免疫監(jiān)視、調(diào)節(jié)HA受體親和性的重要進(jìn)化手段。糖基化程度升高雖然可能幫助病毒逃避體液免疫，但卻提高了固有免疫對IAV的識別。所以，糖基化修飾也是一把雙刃劍：既有利于宿主對IAV進(jìn)行識別和清除，又是IAV逃避宿主免疫監(jiān)視的工具；從另一個角度來講也是如此，即盡管HA糖基化是IAV免疫逃逸的一種進(jìn)化優(yōu)勢，但這種優(yōu)勢顯然要以病毒的受體親和性或其他適應(yīng)性的改變作為代價。在進(jìn)化過程中，為了保持良好的適應(yīng)性，IAV必須保持適宜的HA糖基化水平，才能在免疫逃逸與受體親和性之間達(dá)成功能上的協(xié)調(diào)。因此，IAV最佳的HA糖基化模式或許是“固有免疫-獲得性免疫-病毒受體親和性”等多方共同協(xié)調(diào)的結(jié)果。

當(dāng)前，疫苗研制主要是基于遺傳學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)來確定IAV的抗原性和免疫原性，而HA的糖基化模式往往被忽略。需要關(guān)注的是，IAV的抗原漂移主要是由HA球狀結(jié)構(gòu)域上出現(xiàn)新的糖鏈所致。新的糖基化修飾不僅保護(hù)了氨基酸殘基免遭抗體結(jié)合，而且可以調(diào)節(jié)病毒的受體特異性，這些生物學(xué)特性的改變有助于保持IAV的有效傳播。盡管已知糖基化修飾在IAV逃逸獲得性免疫中發(fā)揮重要作用，但由于記憶性CD8+T細(xì)胞對IAV的清除能力明顯不足，這促使人們重新開始關(guān)注以誘導(dǎo)體液免疫為主的流感疫苗[17-18]。開展對不同IAV毒株HA特定位點(diǎn)糖基化的深入研究，將有助于我們認(rèn)識HA糖基化與抗原距離之間的關(guān)系，預(yù)測毒株的流行潛力和免疫逃逸能力，由此改進(jìn)疫苗的研制規(guī)劃。研究者已經(jīng)開始模擬HIV糖基化的自然保護(hù)作用試圖誘導(dǎo)產(chǎn)生具有廣泛交叉保護(hù)作用的中和抗體。與高度糖基化的HIV相比，IAV的糖基化尚未達(dá)到完全屏蔽HA生物學(xué)活性的空間極限[19-21]。因此，闡明IAV感染過程中糖基化修飾的機(jī)制，明確IAV最佳的糖基化模式，同時構(gòu)建出能夠生產(chǎn)此種糖基化模式的表達(dá)系統(tǒng)，最終創(chuàng)建出以糖基化修飾為靶點(diǎn)的新型流感疫苗，將意味著IAV疫苗的開發(fā)向前邁出了更為重要的一步。