產(chǎn)后卵巢靜止奶牛的血漿代謝特征

宋玉錫，張 鋒，張 江，夏 成，張洪友，徐 闖

(黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶163319)

奶牛卵巢靜止(inactive ovaries,IO)是指受到某些因素影響，導致奶牛的卵巢功能處于靜止狀態(tài)從而不能出現(xiàn)周期性的發(fā)情和排卵[1]。然而，近年來奶牛卵巢靜止的定義中涵蓋了卵泡直徑小于8 mm，無黃體和囊腫的乏情奶牛[2]。目前，隨著我國集約化牛場規(guī)模不斷擴大和單產(chǎn)持續(xù)增高，奶牛產(chǎn)后卵巢靜止所致的乏情發(fā)生率日趨升高。據(jù)報道，卵巢靜止占奶牛乏情的26.3%，而在高產(chǎn)奶牛中高達40%以上[3]。因此，卵巢靜止性乏情已成為現(xiàn)代奶牛業(yè)中高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后亟待解決的主要繁殖障礙問題。

氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析是代謝組學中最標準化的方法且因其特定的優(yōu)勢被作為代謝組學的“黃金標準”分析技術(shù)[4]。由于奶牛產(chǎn)后代謝異常與卵泡發(fā)育和卵巢靜止的發(fā)生密切相關(guān)，但有關(guān)奶牛產(chǎn)后卵巢靜止與機體代謝的關(guān)系仍不十分明確。為此，本試驗運用代謝組學的氣相-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-time of flight mass spectrometry,GC-TOF-MS)技術(shù)以期獲得卵巢靜止奶牛與正常發(fā)情奶牛的血漿差異代謝物，探究其在奶牛產(chǎn)后卵巢靜止發(fā)生中所起的作用，為今后奶牛產(chǎn)后卵巢靜止發(fā)生機制的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物本試驗在黑龍江省某散欄式自由采食全混合日糧(TMR)的大型集約化奶牛場進行。隨機選取產(chǎn)后45～60 d，年齡、胎次、體況相近的30頭試驗?zāi)膛?，通過直腸檢查和B超檢查卵巢及其卵泡大小，根據(jù)試驗?zāi)膛Ｊ欠癜l(fā)情，排除其他疾病等因素的影響，分為卵巢靜止組(IO，n=15)和發(fā)情組(E，n=15)。TMR日糧組成：精料8～9 kg、青貯17～20 kg、干草3.5～4.0 kg、脂肪300～400 g；TMR主要營養(yǎng)物質(zhì)包括：干物質(zhì)55.60%、粗蛋白16%、粗脂肪5.60%、鈣180 g、磷116 g、中性洗滌纖維39.10%、酸性洗滌纖維20.30%、產(chǎn)奶凈能7.33 MJ/DM。

1.2 血液樣品采集試驗?zāi)膛Ｓ诋a(chǎn)后45～60 d清晨榨乳前空腹進行尾靜脈采血，將10 mL血液置于抗凝管(含肝素鈉)中，混勻后3 000×g離心10 min；將上清液(血漿)以12 000×g離心10 min，分裝，-80℃保存待測。

1.3 GC-TOF-MS試驗

1.3.1代謝物提取 每個樣本各取50 μL置于EP管中，加入200 μL甲醇，再加入5 μL(溶于超純水中1 g/L)L-2-氯苯丙氨酸，渦旋30 s混勻，-20℃靜置10 min；將樣本在4℃，12 000×g離心15 min；移取180 μL上清液于EP管中，取每個樣本10 μL混合一起制成質(zhì)控(quality control,QC)樣本；將提取物置于真空濃縮器中進行干燥，干燥后加入30 μL甲氧胺鹽酸鹽試劑(溶于吡啶20 g/L)，輕輕晃動混勻，置于80℃烘箱中孵育30 min；每個樣品加入40 μL BSTFA(含有1% TMCS)，再置于70℃烘箱中孵育1.5 h；室溫冷卻后，加入5 μL FAMEs(溶于氯仿)，隨機順序上機檢測。

1.3.2上機檢測 處理好的樣品上機檢測，使用Agilent 7890氣相色譜系統(tǒng)與Pegasus HT飛行時間質(zhì)譜儀結(jié)合進行GC-TOF-MS分析。該系統(tǒng)使用涂有5%二苯基的DB-5MS毛細管柱，5%二苯基與95%二甲基聚硅氧烷(柱長30 m，內(nèi)徑250 μm，膜厚0.25 μm；J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA，USA)交聯(lián)。以不分流模式注射1 μL等分試樣的分析物。使用氦氣作為載氣，前入口吹掃流量為3 mL/min，通過柱子的氣體流量為1 mL/min。溫度設(shè)置初始為50℃ 停留1 min，再以20℃/min的速率升至310℃，停留6 min。然后，注入溫度280℃、傳輸線溫度280℃和離子源溫度250℃，電子轟擊模式下的能量為-70 eV。在溶劑延遲4.70 min后，以全掃描模式獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，m/z范圍為50～500，速率為每秒12.5個光譜。

1.3.3數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用ChromaTOF軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析[5]。應(yīng)用LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫進行質(zhì)譜及保留時間指數(shù)匹配來定性物質(zhì)。最后將QC樣本中檢出率50%以下或RSD>30%的峰去除。對原始數(shù)據(jù)進行處理以便于分析，首先基于四分位數(shù)距對偏移值過濾單個峰并去除噪音，保留單組或所有組中空值不多于50%的峰面積數(shù)據(jù)；以最小值二分之一的數(shù)值模擬方法填補原始數(shù)據(jù)中的缺失值，最后進行數(shù)據(jù)標準化和歸一化處理[6]。

1.3.4統(tǒng)計分析與差異代謝物篩選 數(shù)據(jù)整理后，首先進行主成分分析(principal component analysis,PCA)?；贕C-MS的代謝組學數(shù)據(jù)的高維度和小樣本特性，可能存在關(guān)聯(lián)的無差異變量，無法進行更好的可視化和后續(xù)分析。所以進一步進行正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal signal correction partial least-squares discriminant analysis,OPLS-DA)，以得到更可靠的代謝物組間差異與試驗組相關(guān)程度的信息。

應(yīng)用SIMCA軟件對數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換加UV格式化處理。首先，應(yīng)用OPLS-DA方法建模分析，再用7折交叉驗證模型質(zhì)量。根據(jù)交叉驗證的R2Y(模型對分類變量Y的可解釋性)和Q2(模型的可預(yù)測性)評判模型的有效性；最后，通過置換檢驗200次(n=200)，隨機改變分類變量Y的排列順序得到不同的隨機R2和Q2值，進一步檢驗?zāi)Ｐ陀行浴?/p>

應(yīng)用多元變量統(tǒng)計與單變量統(tǒng)計分析結(jié)合的方法可以從不同角度觀察數(shù)據(jù)，避免假陽性錯誤或模型過擬合[7]。

本試驗使用的閾值標準為t檢驗的P值小于0.05，同時OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(variable importance in the projection，VIP)大于1。

1.3.5差異代謝通路分析 根據(jù)多元統(tǒng)計分析與單變量分析結(jié)果最終篩選出的組間差異代謝物，通過MBRole(www.csbg.cnb.csic.es /mbrole/)網(wǎng)站的ID轉(zhuǎn)換獲得差異代謝物在KEGG的ID，在KEGG數(shù)據(jù)庫輸入差異代謝物ID及上下調(diào)關(guān)系，搜索相關(guān)代謝通路，再用代謝物通路分析網(wǎng)站MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca)對差異代謝物進行代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 代謝物總離子流圖分析與代謝物鑒定QC樣本的總離子流圖(TIC)疊圖(圖1)顯示，樣本質(zhì)譜峰的保留時間和相應(yīng)強度重現(xiàn)性良好，說明整個檢測過程中儀器穩(wěn)定。

圖1 所有QC樣本TIC疊圖

2.2 多元統(tǒng)計分析結(jié)果PCA得分圖顯示，樣本基本處于95%置信區(qū)間內(nèi)(圖2)。由于兩組間有重疊，需進一步進行OPLS-DA，結(jié)果顯示，兩組分開明顯且基本都處于95%置信區(qū)間(圖3A)。置換檢驗結(jié)果顯示(圖3B)，R2Y=0.82接近1，說明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實情況；而Q2的回歸線與縱軸的截距小于零；隨著置換保留度降低，Y變量比例增大，Q2逐漸下降；這表明原模型穩(wěn)健性良好，不存在過擬合現(xiàn)象。

2.3 差異代謝物的篩選與鑒定應(yīng)用單變量分析對代謝物進行統(tǒng)計分析，共篩選出16種血漿差異代謝物(表1)。其中，卵巢靜止組相對于發(fā)情組升高的有9種，分別是葡萄糖2、葡萄糖6-磷酸、D-果糖-2,6-二磷酸、D-半乳糖酸、甲酰乙內(nèi)脲、草氨酸、二氫羊毛甾醇、反油酸和α-生育酚；下降的有7種，分別是谷胱甘肽、L-焦谷氨酸、胸腺嘧啶脫氧核苷、3-羥基丙酸、單硬脂酸甘油酯、甘油酸、D-塔洛糖。

表1 發(fā)情組與卵巢靜止組奶牛的血漿差異代謝物

2.4 差異代謝物通路分析通過篩選的差異代謝物KEGG的ID，確立了發(fā)情奶牛與卵巢靜止奶牛血漿差異代謝物代謝通路分析圖(圖4)，分別為乙醛酸和二羧酸代謝(甘油酸)，β-丙氨酸代謝(3-羥基丙酸)，甘油脂代謝(D-半乳糖酸、甘油酸)，果糖和甘露糖代謝(葡萄糖2、D-果糖-2,6-二磷酸、葡萄糖6-磷酸)，丙酸代謝(3-羥基丙酸)，谷胱甘肽代謝(L-焦谷氨酸、谷胱甘肽)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(甘油酸)，類固醇生物合成(二氫羊毛甾醇)和嘧啶代謝(胸腺嘧啶脫氧核苷)。其中，甘油脂代謝和谷胱甘肽代謝的顏色較深，圓形較大，所以相對影響較大。

注：圖中橫坐標表示排名第一的主成分得分；縱坐標表示第二的主成分的得分；散點表示樣品

A.散點圖，橫坐標表示第一主成分的預(yù)測得分，縱坐標表示正交主成分得分;B.置換檢驗結(jié)果，橫坐標表示置換保留度，縱坐標表示R2Y或Q2的取值，虛線表示回歸線

注：氣泡所在橫坐標和氣泡大小表示該通路在拓撲分析中的影響因子大小，越大影響因子越大；氣泡所在縱坐標和氣泡顏色表示富集分析的P值(取負自然對數(shù)，即-lnP-value)，顏色越深P值越小，富集程度越顯著

3 討論

本試驗通過KEGG代謝通路對GC-MS篩選出的差異代謝物進行分析，構(gòu)建了GC-MS網(wǎng)絡(luò)代謝圖譜(圖5)。由于α-生育酚和胸腺嘧啶脫氧核苷酸與其他代謝物的關(guān)系不明，未列在網(wǎng)絡(luò)代謝圖中。

3.1 糖代謝與卵巢靜止的關(guān)系葡萄糖可以參與包括糖酵解、糖異生、己糖胺途徑和磷酸戊糖途徑在內(nèi)的多種代謝途徑。本試驗中IO奶牛血漿中葡萄糖2、葡萄糖-6-磷酸和D-果糖-2,6-二磷酸含量上升，說明IO奶牛的糖酵解或糖異生過程增強。這些糖中間代謝物的升高提示IO奶牛體內(nèi)能量缺乏，糖代謝增強為機體供能，或滿足機體泌乳合成乳糖所需。IO奶牛血漿中塔洛糖含量降低，D-半乳糖酸含量升高。塔洛糖是由纖維二糖2-差向異構(gòu)酶催化半乳糖的酮-醛異構(gòu)化生成[8]，在奶牛卵巢靜止發(fā)生中的作用未見報道。D-半乳糖酸參與半乳糖代謝，是由半乳糖通過半乳糖氧化酶轉(zhuǎn)化而來，可生成D甘油進入磷酸戊糖途徑。D-半乳糖(D-gal)是一種簡單的單糖，可以作為正常營養(yǎng)素在體內(nèi)代謝，主要用于乳糖的合成[9]。乳腺中葡萄糖轉(zhuǎn)換為半乳糖，半乳糖再與葡萄糖結(jié)合生成乳糖[9]。由此可見，IO奶牛產(chǎn)奶量高，機體乳糖合成需求增高，葡萄糖向半乳糖的轉(zhuǎn)化增強，促進了半乳糖代謝，與本試驗結(jié)果相符。

注：升高/降低是指卵巢靜止奶牛

3.2 脂代謝與卵巢靜止的關(guān)系甘油酸主要參與甘油脂代謝。甘油醛可以氧化生成甘油酸，然后在甘油脫氫酶作用下，生成甘油；也可磷酸化后生成甘油酸3磷酸，再參與糖異生或糖酵解途徑。單硬脂酸甘油酯由長鏈脂肪酸與丙三醇酯化而來。甘油酯通常指由甘油和脂肪酸經(jīng)酯化所生成的酯類，主要用于細胞內(nèi)能量儲存，與膽固醇酯細胞內(nèi)脂滴一起形成作為熱量儲庫[10]。因此，本試驗中IO奶牛血漿中甘油酸和單硬脂酸甘油酯含量降低，表明甘油脂代謝減弱，甘油酯的合成減少，脂肪儲備動員后用于合成乳脂和供能。反油酸是由油酸轉(zhuǎn)化而來的，油酸以甘油酯的形式存在于動物脂肪中。本試驗中IO奶牛血漿中反油酸含量的升高，表明機體脂肪動員增強，油酸甘油酯分解供能，從而導致反油酸增多。而脂肪動員增強后產(chǎn)生的高濃度游離脂肪酸會造成卵巢卵泡內(nèi)的脂毒性，影響卵母細胞發(fā)育，降低奶牛的生育力[11]。二氫羊毛甾醇主要參與類固醇的生物合成，類固醇在雌性生殖中起著至關(guān)重要的作用，特別是參與排卵過程和牛的卵母卵丘復(fù)合體排卵前成熟[12-13]。由此可見，本試驗中IO奶牛血漿中二氫羊毛甾醇含量升高，可能是由于類固醇合成受阻，性激素的合成受到障礙。

3.3 氨基酸代謝與卵巢靜止的關(guān)系甲酰乙內(nèi)脲參與精氨酸和脯氨酸代謝通路，是精氨酸參與尿素循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，主要用于合成肌氨酸。肌氨酸以磷酸肌酸形式儲存在肌肉中，促進三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合成[14]。本試驗中IO奶牛血漿中甲酰乙內(nèi)脲含量升高，表明尿素循環(huán)精氨酸分解增強，向磷酸肌酸的轉(zhuǎn)化增強。3-羥基丙酸參與β-丙氨酸代謝。本試驗中IO奶牛機體能量缺乏，因此體內(nèi)的丙酮酸主要用于乙酰輔酶A的生成參與三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)供能，而減少向丙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，且3-羥基丙酸向β-丙氨酸代謝增強，使得血漿中3-羥基丙酸含量降低，以便滿足機體對能量的需要。草氨酸參與嘌呤代謝，是黃嘌呤的分解代謝產(chǎn)物，而草氨酸繼續(xù)代謝為草酸和氨。草氨酸是丙酮酸的等排和等電子類似物[15]。而草氨酸生成的草酸可衍生為草酰胺并參與TCA循環(huán)。草氨酸的升高提示IO奶牛的嘌呤代謝與TCA循環(huán)可能增強。L-焦谷氨酸主要參與γ-谷氨酰循環(huán)和谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH)代謝。L-焦谷氨酸可以由谷氨酰胺分子失去氨?；纬?，也可由谷氨酸環(huán)化轉(zhuǎn)變而來[16]。γ-谷氨酰循環(huán)是六酶循環(huán)，是GSH合成和降解的主要途徑[17]。GSH的抗氧化特性可以保護細胞免受自由基損傷[18]。氧化應(yīng)激對生殖系統(tǒng)的不利影響涉及卵母細胞脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)，卵巢和子宮內(nèi)膜的損傷，從而影響生育力[19]。因此，本試驗中IO奶牛血漿中L-焦谷氨酸含量的降低，導致了谷氨酸含量也隨之降低，隨后導致其合成的GSH含量降低。這不利于卵母細胞的生長發(fā)育，可能是造成奶牛產(chǎn)后發(fā)生卵巢靜止的因素之一。

3.4 其他代謝物與卵巢靜止的關(guān)系維生素E是一種抗氧化劑，其水解產(chǎn)物為生育酚。維生素E的生物活性高度依賴于用于保留α-生育酚和排泄非α-生育酚形式的調(diào)節(jié)機制[20]。α-生育酚可作為過氧自由基清除劑來保護膜和脂蛋白中的多不飽和脂肪酸，還能促進雌性激素分泌，從而提高生育能力。維生素E不能通過自身合成，只能從食物中獲取，由于兩組試驗?zāi)膛５娘暳舷嗤?，所以兩組奶牛從食物攝取的維生素E含量應(yīng)相差不大。然而，本試驗中IO奶牛血漿中α-生育酚含量升高，提示其利用率降低。

胸腺嘧啶脫氧核苷酸主要參與嘧啶代謝，其合成需要谷氨酰胺與ATP。ATP是所有生物體中的一種通用能源，在生物過程中起著重要作用，包括膜離子通道泵的調(diào)節(jié)，DNA復(fù)制，生物合成和細胞代謝等[21]。本試驗中在卵巢靜止奶牛血漿中胸腺嘧啶脫氧核苷酸的減少，提示與機體谷氨酰胺或ATP不足，或DNA分解增強，可能與機體能量缺乏和氨基酸分解代謝增強有關(guān)，但與奶牛產(chǎn)后卵巢靜止發(fā)生的關(guān)系尚不清楚。

本研究應(yīng)用GC-TOF-MS技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計分析和單變量分析及生物信息學技術(shù)，獲得了卵巢靜止奶牛血漿中16種差異代謝物，其中卵巢靜止組相對于發(fā)情組升高的有9種，下降的有7種。其主要參與糖代謝、甘油脂代謝、氨基酸代謝、類固醇生物合成和谷胱甘肽代謝等通路。這些差異代謝物為今后奶牛卵巢靜止機制的研究提供了新的方向。