CRISPR：從“盲盒”基因編輯到“精準靶向”基因組編輯的未竟之旅

施季森

(南京林業(yè)大學林木遺傳與生物技術教育部重點實驗室, 南京林業(yè)大學林學院,南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 南京 210037)

《CRISPR/Cas基因組編輯》因獲2020年諾貝爾化學獎而再度引起廣泛關注。自1970年報道基因編輯小鼠以來，約有33 850條文獻涉及基因編輯(據(jù)ScienceDirect)。2012年CRISPR/Cas9技術突破后的文獻占98.32%，其中涉農(nóng)、林植物基因(組)編輯文獻占10.63%，林木CRISPR/Cas9基因組編輯研究也迅速起步。應編輯部之約，特付短評一二，供參考。

1 林木跨入基因(組)編輯時代

木本植物雖受個體高大、生命周期長、基因組復雜等生物學特性所限，CRISPR/Cas9技術的突破，林木基因組編輯研究發(fā)展迅速。2015年，有關采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究楊樹木質(zhì)素合成通路4CL:CoA連接酶[1-2]、毛白楊PtoPDS光合作用[3]等基因功能研究的報道，開啟了林木基因組編輯研究新篇章。

本專題中侯靜等[4]介紹了CRISPR/Cas技術的發(fā)展及其在林木改良中的應用前景，為木本植物基因組編輯和應用提供了重要參考。該文成稿后，又有麻竹[5]、油棕[6]、椰棗[7], 毛果楊[8]、山銀楊雜交種[9]、銀白楊[10]、雜交楊84K無性系[11]、橡膠樹[12]、茶樹[13]，日本柳杉[14]、輻射松[15]和白云杉[16]等樹種基因組編輯研究取得新進展，分別涉及生長、材性、抗逆性和次生代謝物等重要性狀。尤其是，張金鳳課題組及其合作團隊[16]基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)和體胚發(fā)生植株再生技術平臺，同時實現(xiàn)白云杉PgDXS1基因有效編輯和突變株體胚再生技術的路線，不但對基因組超大、植株再生困難的針葉樹種，而且對其他木本植物的基因組編輯研究，均提供了參考。

本專題中王竹雯等[17]、孫佳彤等[18]則基于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，解析毛果楊(Populustrichocarpa)PtrHBI1基因[17]和bHLH106轉(zhuǎn)錄因子[18]在毛果楊營養(yǎng)生長、次生木質(zhì)部發(fā)育以及細胞壁木質(zhì)素和纖維素組分變化等方面的功能及其調(diào)控作用。發(fā)現(xiàn)PtrHBI1基因和bHLH106轉(zhuǎn)錄因子對楊樹生長、木質(zhì)部形成層發(fā)育、細胞壁纖維素含量和木質(zhì)素S/G組分變化等經(jīng)濟性狀均有重要影響。該團隊今年還報道了CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究毛果楊PtrLBD39基因在應拉木形成調(diào)控網(wǎng)絡的重要進展[8]。所有這些研究，為林木基因組編輯、基因功能、種質(zhì)創(chuàng)新和基因組選擇育種研究提供了重要參考。

2 CRISPR/Cas技術簡史和未來發(fā)展趨勢

2.1 簡史

數(shù)十年來，科學家一直努力開發(fā)經(jīng)濟、高效、可靠，能精準編輯基因組的新一代基因工程技術。20世紀70年代基因工程小鼠的成功[19]，催生了動植物基因編輯研究熱潮。然第1代基因編輯技術不能進行精準靶向編輯而受限，全世界科學家多路并發(fā)專注于精準靶向基因組編輯技術研發(fā)。1987年Ishino等[20]發(fā)現(xiàn)古細菌基因組中存在CRISPR結構后的20多年中，先后統(tǒng)一了CRISPR/Cas命名，提出了CRISPR/Cas假設，證實了CRISPR/Cas源自古細菌適應性演化中獲得天然抗病毒免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas基因系統(tǒng)樹為兩支6亞型，一支為亞型Ⅰ(Cas3)、Ⅲ(Cas10)和IV(Sef1)；另一分支為亞型Ⅱ(Cas9、Cas1、Cas2和Cas4)，Ⅴ(Cas12)和Ⅵ(Cas12)。2012年，CRISPR/Cas基因編輯技術有了顛覆性重大突破，功能強大、省時省力基因組編輯器CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9的問世[21-22]，帶動了生物CRISPR/Cas系統(tǒng)基因編組輯技術和應用研究的快速發(fā)展。

2.2 發(fā)展趨勢

CRISPR/Cas基因編輯技術由單純的基因插入/缺失，已發(fā)展成為精準全基因組DNA單堿基替換、特定或成串基因序列插入或缺失、表型組修飾，以及不同RNA功能模塊(化)搭建等一系列基因組水平精準高效靶向遺傳操作工具[23]，但面對眾多生物種類或不同改良目標，現(xiàn)有CRISPR/Cas工具在靶向和編輯效率等方面仍不能滿足基礎和應用研究的需要。當前，基因組編輯研究大體圍繞兩方向展開。

1)基因組編輯器研發(fā)。以開發(fā)或完善編輯工具為主要目標。隨著生物基因功能、基因編輯機理及其互作網(wǎng)路的深入解析，CRISPR/Cas基因(組)編輯“工具箱”不斷更新擴充。在單位點(singal locus)編輯技術體系基礎上，發(fā)展出了多位點(multiplex loci)基因編輯技術體系，如sgRNA-CRISPR/Cas9[22,6]，最近陸續(xù)報道了Cas13、Cas12a、Cas12f(Cas14)、Csm6等基因組編輯工具[23-24]。針對模型動物和醫(yī)學上，基因編輯多基于腺病毒(AAV)載體運送基因的特點，CRISPR系統(tǒng)趨向Mini化[25]。同時有學者指出，Mini 型CRISPER/Cas12f1基因編輯系統(tǒng)也適用于在植物上應用[26]。當然，對于Mini型基因組編輯工具是否更適合在木本植物上應用，還有待進一步深入研究。

2)CRISPR/Cas基因組編輯技術體系應用。植物應用方面，有兩條不同技術路線在不同團隊間競發(fā)。一些團隊側(cè)重于單堿基替換或突變、短序列功能片段編輯技術路線的應用；另一些則強調(diào)長片段序列應用的重要性。這兩條技術路線的應用，在植物上均取得了顯著的進展。筆者認為，當前雖然有一些不同的觀點，但隨著基因組編輯技術的進步，以及不同物種、性狀、層級調(diào)控網(wǎng)絡功能等問題的深入解析，無論是單位點還是多位點基因組編輯技術路線，終將走向融合，在不同物種、性狀、遺傳背景和代謝途徑等不同層級的基因組編輯方面發(fā)揮優(yōu)勢。

綜上，基因編輯研究和應用，由“盲盒”試錯之路逐漸走向“精準靶向”時代。但在林木上僅偏重于現(xiàn)有技術的應用，林木基因編輯器的研發(fā)基本上為空白。在CRISPR/Cas基因組編輯系統(tǒng)，尤其是具有不同功能或功效、適合于不同物種或不同改良性狀靶標的CRISPR/Cas變異體(variants)開發(fā)，仍是未竟之路。正如CRISPR/Cas9基因組編輯技術體系的奠基人指出的那樣：已開發(fā)的CRISPRs基因編輯工具或許只是“冰山一角”，在CRISPR/Cas核酸酶結構域這一基因編輯“武器庫”陣列中，又發(fā)現(xiàn)了一類短氨基酸序列IscB和TnpB 蛋白，有可能成為下一代基因組編輯新的強力工具[27]。我們期待高效簡化基因編輯新工具，也期待在林木多位點基因組編輯技術研發(fā)和應用方面也有所作為。