口蹄疫病毒RGD基序與病毒受體互作及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

李鵬飛,杜曉華,蔣 韜 (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室/國家口蹄疫參考實驗室，甘肅 蘭州 730046；.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)是引起口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)的病原體，屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，由O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1 7種血清型組成[1]。FMD暴發(fā)會引起家畜等經(jīng)濟(jì)動物的生產(chǎn)力下降以及對受災(zāi)國家施加的動物和相關(guān)產(chǎn)品貿(mào)易限制，從而造成重大經(jīng)濟(jì)損失，也因此對國家的政治、經(jīng)濟(jì)造成巨大影響。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定必報傳染病，我國規(guī)定為一類動物傳染病。

FMDV與其他RNA病毒相似，攜帶一種容易出錯的聚合酶，從而會導(dǎo)致廣泛的遺傳異質(zhì)性，使其作為病毒準(zhǔn)種而存在，這種現(xiàn)象使病毒能夠適應(yīng)宿主快速變化的環(huán)境，這些具有異質(zhì)性的病毒類群在傳播過程中為適應(yīng)環(huán)境的不斷演化形成變異株[2]。目前大多數(shù)的FMD流行國家以免疫預(yù)防為主要防控手段。但一方面FMDV不同血清型間缺乏交叉保護(hù),致使通過疫苗免疫單一手段難以獲得有效防控。另一方面由于抗原變異造成的變體之間的不完全保護(hù)也使得接種控制該疫病的工作變得復(fù)雜化[3]。FMDV吸附宿主細(xì)胞表面受體是FMDV感染的起始，在受體的介導(dǎo)下FMDV粒子通過內(nèi)化作用等途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞完成其生命周期。隨著病毒的不斷進(jìn)化，它們能夠使用蛋白質(zhì)、碳水化合物和糖脂等多種細(xì)胞表面分子作為受體[4]。研究證實，F(xiàn)MDV可能優(yōu)先感染舌棘層的棘細(xì)胞，導(dǎo)致受感染細(xì)胞通過凋亡而死亡，并且細(xì)胞感染FMDV后凋亡過程可能同時開始[5]。VP1蛋白是FMDV顆粒表面的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在其易變的G-H環(huán)上不僅含有病毒主要的抗原位點，而且含有一個高度保守的RGD基序(精氨酸-苷氨酸-天門冬氨酸)，該基序是病毒粒子與細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白結(jié)合引起感染的主要結(jié)合位點。研究發(fā)現(xiàn)RGD可通過觸發(fā)構(gòu)象改變，直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時整聯(lián)蛋白作為宿主細(xì)胞跨膜蛋白，除參與細(xì)胞吸附作用外，當(dāng)受到外界刺激后也會啟動一系列復(fù)雜調(diào)節(jié)細(xì)胞程序，包括細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步了解FMDV的RGD誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡分子機制，本研究就FMDV RGD受體結(jié)合域，F(xiàn)MDV受體及相互作用誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡最新進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 FMDV RGD受體結(jié)合域

FMDV吸附宿主細(xì)胞受體是其感染的前提條件，病毒通過與易感宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合來啟動感染。宿主組織和特定細(xì)胞表面受體決定病毒的感染途徑和傳播方式以及其對宿主的致病特征[6]。對FMDV配體和宿主細(xì)胞受體的研究不僅有助于了解FMDV細(xì)胞受體，更有助于闡明FMDV的宿主嗜性、感染途徑、復(fù)制過程和發(fā)病機制，為FMD的預(yù)防、控制和治療提供策略。

FMD完整的病毒粒子為正二十面體對稱結(jié)構(gòu),由VP1、VP2、VP3、VP4 4種結(jié)構(gòu)蛋白各60個拷貝組成,RNA分子被包裹在內(nèi)。VP1-VP3 3種蛋白質(zhì)暴露在病毒顆粒表面且聚集成蛋白質(zhì)三聚體復(fù)合物，較小的結(jié)構(gòu)蛋白VP4隱藏于內(nèi)部[7]。FMDV粒子光滑衣殼的1個顯著特征是VP1上1個暴露的柔性GH環(huán)(～30殘基)，該環(huán)及其內(nèi)嵌的RGD(Arg-Gly-Asp)基序(在O血清型中為殘基145～147)構(gòu)成宿主體液免疫反應(yīng)的主要中和位點，并介導(dǎo)FMDV結(jié)合整聯(lián)蛋白而感染宿主細(xì)胞[8]。除VP4外，VP1、VP2、VP3都含有抗原位點[9]。因此，這些結(jié)構(gòu)蛋白的修飾可能會改變病毒與宿主細(xì)胞的吸附能力和病毒的生物學(xué)特性。FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1暴露于病毒顆粒表面，承受的選擇壓力最大，一旦發(fā)生突變，可能就會導(dǎo)致毒株抗原性變化。研究證實，二十面體病毒在衣殼表面有一個可以識別受體的空腔，空腔覆蓋受體結(jié)合位點將使病毒逃避宿主免疫監(jiān)視[10]。FMDV也采用相似的策略。ASHKANI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV的衣殼中位于病毒顆粒VP1-VP3環(huán)區(qū)域中有高度帶電且保守的氨基酸組成的空腔，VP1通過其表面上已確定的空腔對病毒與宿主細(xì)胞的相互作用起主要作用，該空腔保留了受體介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞所需要的結(jié)合位點，同時保護(hù)它們不被免疫系統(tǒng)識別。這可能說明RGD基序通過隱藏于易變序列中，不僅使病毒避開宿主的免疫監(jiān)視，同時在抗體結(jié)合病毒入侵細(xì)胞過程中具有重要作用。

除RGD序列以外，F(xiàn)MDV還可以利用其他類似于RGD序列的三肽序列與受體相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，五重軸的突變似乎提高了整聯(lián)蛋白的使用，并允許帶有KGE的病毒代替正常的整聯(lián)蛋白結(jié)合RGD基序利用αvβ6受體[12]。FMDV Asial/JS/China/2005田間株在小鼠中傳代4次后，產(chǎn)生帶有RGD和RSD(Arg-Ser-Asp)受體識別位點基序的優(yōu)勢種群，而接種了FMDV Asial/JS/China/2005田間株的豬和牛經(jīng)過8次傳代后分離得到具有RDD(Arg-Asp-Asp)基序的優(yōu)勢種群[13]。另外，當(dāng)FMDV C-S8c1株在細(xì)胞中傳代100代時，出現(xiàn)了含有Arg-Gly-Gly(RGG)受體結(jié)合序列的突變株。當(dāng)該含有RGG的突變株在細(xì)胞中傳代50代后，出現(xiàn)了含有Gly-Gly-Gly(GGG)受體結(jié)合序列的突變株。這些結(jié)果表明，在進(jìn)化過程中FMDV除了主要依賴于RGD基序外，還能產(chǎn)生不依賴于RGD序列的有活性的感染性病毒粒子。這些病毒變異株可能使用目前未知的方法與細(xì)胞相互作用，啟動吸附和感染[14]。隨著病毒的不斷進(jìn)化，產(chǎn)生新的耐藥株導(dǎo)致疾病的流行。因此，進(jìn)一步了解病毒感染機制，尋找替代的預(yù)防方法和靶點具有重要意義。

2 FMDV受體

病毒粒子與細(xì)胞表面受體相互作用是病毒感染的第一步。研究表明，整聯(lián)蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8是FMDV田間株RGD依賴受體[15]。細(xì)胞培養(yǎng)生長通常會選擇使用硫酸乙酰肝素(HS)作為受體的病毒，HS可以通過不依賴整聯(lián)蛋白的過程引發(fā)感染。其他非整聯(lián)蛋白，非HS受體也可以介導(dǎo)FMDV感染，如已報道缺乏RGD基序的O型和C型病毒，通過使用尚未確認(rèn)的受體感染HS缺陷細(xì)胞[14，16]。因此，細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)病毒可能改變了病毒嗜性，使其具有更強的毒性和更廣的宿主范圍。

2.1 整聯(lián)蛋白受體

2.1.1整聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu) 整聯(lián)蛋白是哺乳動物細(xì)胞黏附和信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白之一。迄今為止已鑒定18種不同的α亞基和8種β亞基非共價結(jié)合構(gòu)成24種整聯(lián)蛋白異二聚體跨膜糖蛋白受體[17]。整聯(lián)蛋白可以通過結(jié)合細(xì)胞外配體或通過細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞骨架相互作用，在細(xì)胞膜上雙向傳遞信號[18]。整聯(lián)蛋白可在配體結(jié)合的高親和力構(gòu)象和低親和力構(gòu)象之間轉(zhuǎn)化，并在配體結(jié)合后傳遞胞內(nèi)信號。在非活性狀態(tài)下，整聯(lián)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域不與配體結(jié)合，以彎曲構(gòu)象的形式存在。然而，來自細(xì)胞的信號引起構(gòu)象變化，暴露外部配體結(jié)合位點，結(jié)合配體并將信號從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)[19]。整聯(lián)蛋白α亞基和β亞基都具有1個由幾個不同的結(jié)構(gòu)域組成的大的胞外結(jié)構(gòu)域、1個單一的跨膜螺旋和1個短的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外區(qū)是最大的結(jié)構(gòu)域，從80～150 kDa,而胞質(zhì)區(qū)是1個由10～70個氨基酸(aa)殘基組成的短而非常無序的結(jié)構(gòu)域，(只有β4亞基具有長的胞質(zhì)區(qū)，包含>1 000個aa殘基)[20]。整聯(lián)蛋白α亞基β-propeller、thigh結(jié)構(gòu)域和β亞基βI、hybrid、PSI、I-EGF-1結(jié)構(gòu)域形成配體結(jié)合的頭飾，即頭部和大腿；α亞基calf-1和calf-2以及β亞基I-EGF-2至I-EGF-4與β-尾部結(jié)構(gòu)域構(gòu)成小腿[21]。α鏈和β鏈的結(jié)構(gòu)域結(jié)合在一起形成一個配體結(jié)合頭，每條鏈通過一條腿連接到膜上，其結(jié)構(gòu)類似于一個“頭”連著兩條“腿”。α和β亞基N-末端形成的球形區(qū)域為胞外配體結(jié)合域[22]。

整聯(lián)蛋白β亞基βI結(jié)構(gòu)域含有多個二價金屬陽離子結(jié)合位點(MIDAS、ADMIDAS和LIMBS)，配體與整聯(lián)蛋白的結(jié)合還受到二價金屬陽離子的調(diào)節(jié)，二價金屬陽離子(Ca2+、Mg2+和Mn2+)不僅是整聯(lián)蛋白與配體結(jié)合的前提，而且還可以影響整聯(lián)蛋白的激活狀態(tài)[23]。二價金屬陽離子對配體與αv整聯(lián)蛋白上RGD位點結(jié)合的影響在同一配體的整聯(lián)蛋白和同一整聯(lián)蛋白的配體之間變化[24]。

2.1.2 FMDV與整聯(lián)蛋白受體的相互作用FMDV通過細(xì)胞受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主，這一過程是由病毒與細(xì)胞表面受體(主要是整聯(lián)蛋白)的結(jié)合啟動的。病毒通過結(jié)構(gòu)蛋白VP1上的RGD基序與細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白結(jié)合并誘導(dǎo)內(nèi)化[25]。FMDV的開放閱讀框(ORF)產(chǎn)生了14種以上的成熟蛋白(4種結(jié)構(gòu)蛋白：vp1、vp2、vp3、vp4和10種非結(jié)構(gòu)蛋白：L、2A、2B、2C、3A、3B1、3B2、3B3、3C和3D)以及部分裂解中間產(chǎn)物，這些蛋白在感染過程中的相對貢獻(xiàn)尚需進(jìn)一步研究[26]。

FMDV RGD基序的結(jié)合特異性是近年來研究的熱點。體外研究證明，F(xiàn)MDV的4種整聯(lián)蛋白受體(αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8)在頭部亞單位界面的小裂口處結(jié)合配體，晶體結(jié)構(gòu)研究顯示整聯(lián)蛋白對RGD基序的特異性識別是通過α亞基β螺旋槳結(jié)構(gòu)域與精氨酸結(jié)合，天冬氨酸通過Mg2+或Mn2+在金屬離子結(jié)合位點(MIDAS)與整聯(lián)蛋白β亞基β1結(jié)構(gòu)域結(jié)合[27]。分子模擬FMDV RGD結(jié)構(gòu)域的氨基酸與整聯(lián)蛋白氨基酸之間可能的相互作用，發(fā)現(xiàn)RGD結(jié)構(gòu)域的精氨酸(Arg143)與家牛α-整聯(lián)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(SIPLQ)的亮氨酸(Leu679)相互作用，除此之外其他氨基酸之間也存在相互作用，如FMDV與β-整聯(lián)蛋白之間的其他相互作用包括Asn47-Gln1710、Arg152-Asn1643、Gly202-Gln1187和Ser154-Lys1669；對不同牛種α-整聯(lián)蛋白外顯子區(qū)體外擴(kuò)增的研究表明，嗜性位點(SIPLQ)具有保守性，并且在病毒RGD突變?yōu)镵GD后，觀察到VP1和整聯(lián)蛋白之間的界面消失，這種相互作用的缺失表明了易感宿主對RGD的依賴性[28]。這種現(xiàn)象是由于精氨酸(R)取代賴氨酸(K)引起FMDV-VP1蛋白三維構(gòu)象的重大變化。盡管精氨酸和賴氨酸是帶正電荷的氨基酸，它們與帶負(fù)電荷的原子相互作用，但從精氨酸到賴氨酸的變化并不總是中性的，從而引起構(gòu)象變化，因為這些構(gòu)象的改變，突變的RGD區(qū)域無法進(jìn)入整聯(lián)蛋白腔，從而導(dǎo)致突變的RGD與整聯(lián)蛋白之間沒有明顯的相互作用[29]。SORGE等[30]研究含RGD的序列(NAVPNLRGDLQVLAQKVART-Hsl)與整聯(lián)蛋白αvβ6的結(jié)合特異性，結(jié)果表明該序列主要通過6Leu、10Leu、12Val和13Leu 4個殘基與整聯(lián)蛋白相互作用，并且其C端基序優(yōu)先與整聯(lián)蛋白主要作用，整聯(lián)蛋白αvβ6特異性包含位于整聯(lián)蛋白上的小的結(jié)合位點，該序列能夠到達(dá)此結(jié)合位點并抑制其與其他αv整聯(lián)蛋白相互作用。前期研究表明，整聯(lián)蛋白αvβ6的特異性肽需要在RGD LXXL/I基序之后有一個穩(wěn)定的螺旋，因為RGD之后的螺旋的完整性將RGD+1和RGD+4殘基保持在可與整聯(lián)蛋白直接相互作用的方向上[31]。為解釋RGD結(jié)構(gòu)域在FMDV宿主嗜性中的作用已進(jìn)行許多研究，但在該病毒嗜性中的作用還有待闡明。

研究表明，整聯(lián)蛋白與FMDV的結(jié)合與跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)域無關(guān)。MILLER等[32]對β6細(xì)胞質(zhì)域中各種缺失突變的研究表明，β6胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的缺失對病毒結(jié)合的影響很小，但該結(jié)構(gòu)域?qū)Σ《靖腥臼潜夭豢缮俚?，?胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域在病毒感染后的事件中起著關(guān)鍵作用。研究證實，缺少跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)域的可溶性αvβ3和αvβ6仍可作為FMDV受體[33]?？扇苄越囟绦问降呐Ｕ?lián)蛋白αvβ6通過二價陽離子依賴的相互作用結(jié)合FMDV-RGD,可以用作FMDV的捕獲試劑，并不影響病毒的結(jié)合[34]。

盡管RGD依賴的整聯(lián)蛋白受體通過RGD基序識別其配體，但FMDV-VP1蛋白G-H環(huán)中VP1側(cè)面的氨基酸殘基在FMDV感染中同樣起重要作用。如RGD依賴性整聯(lián)蛋白αvβ5和α5β1并未充當(dāng)FMDV的受體[35]。VP1 S154D突變導(dǎo)致Asia1型FMDV使用豬整聯(lián)蛋白受體αυβ6和αυβ8的能力增加。從而增加了宿主細(xì)胞中Asia1型FMDV的復(fù)制水平，增強了對宿主豬的致病性[36]。有一部分原因是由于病毒RGD側(cè)面的殘基影響整聯(lián)蛋白與配體的相互作用。

不同品種牛對FMDV的易感性不同[37]。SINGH等[38-39]先后研究了位于牛整聯(lián)蛋白(ITGB6)受體基因beta 6區(qū)域的兩個SNPs(rs13500299和rs109075046)和牛整聯(lián)蛋白(ITGAV)受體基因的一個同義SNP(rs719257875)對雜交牛FMDV易感性的影響，結(jié)果表明這些同義突變可以影響牛對FMD的易感性。這些研究將為開展FMD抗病育種提供參考。

2.2 硫酸乙酰肝素(HS)受體

2.2.1硫酸乙酰肝素(HS)受體結(jié)構(gòu) 硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)是糖胺聚糖家族成員,存在于幾乎所有哺乳動物細(xì)胞表面,是一種細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)成分,由硫酸化的(糖醛酸-葡糖胺)重復(fù)二糖單位組成，常以硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)的形式存在于生命體內(nèi)，參與多種重要的生理過程，包括細(xì)胞黏附。HSPG由核心蛋白組成，核心蛋白上共價連接著糖胺聚糖(GAG)多糖家族的陰離子硫酸乙酰肝素(HS)鏈。這些鏈由交替的D-葡萄糖胺和糖醛酸(D-葡萄糖醛酸和L-艾杜糖醛酸)組成。HS能夠可變地進(jìn)行N-和O-硫酸化，在HS特定位置NS區(qū)富含硫酸基團(tuán)重復(fù)三硫酸化雙糖結(jié)構(gòu)-IdoUA2S-Glc NS6S-,其賦予了總體高負(fù)電荷,并且它們在鏈的短鏈段中的排列產(chǎn)生蛋白質(zhì)配體的結(jié)合位點[40-41]。

2.2.2FMDV與硫酸乙酰肝素(HS)受體的相互作用 在不同生物環(huán)境中進(jìn)化的FMDV準(zhǔn)種獲得了選擇不同受體識別位點的能力，病毒與宿主細(xì)胞的早期相互作用可能對FMDV種群產(chǎn)生主要的選擇壓力，這有助于FMDV進(jìn)入細(xì)胞的進(jìn)化和功能靈活性[42]。除整聯(lián)蛋白外，在細(xì)胞培養(yǎng)中，F(xiàn)MDV可以迅速適應(yīng)利用替代細(xì)胞受體:硫酸乙酰肝素(HS)[43]和尚未確認(rèn)的替代受體[44]。細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性通常來自衣殼表面多個位點發(fā)生的少量殘基變化，通常，這些變化會導(dǎo)致正電荷的凈增加以及使用帶負(fù)電荷的分子作為受體的能力，如硫酸乙酰肝素(HS)。研究證實，VP3和VP2接近五重對稱軸處獲得帶正電荷的氨基酸殘基的細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)FMDV利用HS作為受體[45-48]。研究發(fā)現(xiàn)，在不同細(xì)胞系中連續(xù)傳代的FMDV O/SKR/JC/2014是一種細(xì)胞適應(yīng)性病毒，利用硫酸乙酰肝素(HS)作為受體，并且，通過與細(xì)胞適應(yīng)性相關(guān)的DNA測序證實VP3區(qū)域中H56R的氨基酸突變[49]。一個HS結(jié)合位點最初是使用FMDV O1BFS 1860鑒定的，該病毒與肝素(HS的結(jié)構(gòu)模擬物)形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表明，結(jié)合位點是3個外部衣殼蛋白VP1-VP3交界處的淺凹陷。允許HS結(jié)合的最重要的變化是在VP3 56處，該位點在田間病毒中通常為H，而在細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)時變?yōu)镽，以形成高親和力的HS結(jié)合位點。VP3 56處的R在凹陷處占據(jù)中心位置，并且通過與肝素上2個硫酸根基團(tuán)的離子相互作用而對結(jié)合起主要作用；另一個主要的接觸殘基是VP2的R 135，它在通過水分子與肝素二糖和靠近VP1的C末端的H(殘基195)的相互作用中起輔助作用[43]。然而現(xiàn)在已知，第2個位點病毒衣殼五重對稱軸的變化也會導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性，這些變化發(fā)生在VP1上的任一相鄰位點，并且需要引入帶正電荷的殘基[45，48]。對于一些病毒來說，五重對稱軸上的變化導(dǎo)致HS結(jié)合；而另一些則利用未知受體。此外，對于某些病毒，該位置的突變似乎增強了對整聯(lián)蛋白的使用，并允許帶有KGE的病毒代替正常的整合素結(jié)合RGD基序使用αvβ6受體[12]。

BAI等[47]認(rèn)為，非整聯(lián)蛋白依賴的FMDVs對肝素的高親和力可能是由于不同細(xì)胞系表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結(jié)構(gòu)的差異所致。BISWAL等[48]研究證實，在血清型A型FMDV衣殼蛋白VP2上131位點引入帶正電荷的賴氨酸殘基，可以增加肝素的親和力并適應(yīng)BHK-21細(xì)胞系，此外，突變病毒與細(xì)胞HS受體的相互作用發(fā)生在細(xì)胞附著過程中，一旦病毒被結(jié)合，加入肝素并不影響感染過程。根據(jù)JACKSON等[50]之前提出的假設(shè)，推斷突變的重組血清型A型病毒對BHK-21細(xì)胞的有效感染是通過病毒與HS的初始相互作用促進(jìn)的，但隨后是細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)化事件。DU等[51]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV利用多個受體，不同的毒株可以通過不同的受體感染細(xì)胞，并且他們認(rèn)為HS可能是CHA/99菌株吸附易感細(xì)胞的主要受體。

2.3 FMDV與第三類受體的相互作用FMDV很少利用尚未鑒定的第三類受體[44]。研究證實，接種FMDVA(-)(缺乏VP1 G-H環(huán)的一部分,包含RGD基序)病毒后，幼牛出現(xiàn)典型的FMDV感染臨床癥狀[52]。CHAMBERLAIN等[44]研究在VP2遠(yuǎn)離五重軸處發(fā)現(xiàn)了一個新的適應(yīng)位點，該位點氨基酸的變化導(dǎo)致FMDV(A/IRN/2/87)變體的細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性和細(xì)胞嗜性的擴(kuò)大，它們使用了既不是HS又不是整聯(lián)蛋白的新型受體。LAWRENCE等[53]研究認(rèn)為細(xì)胞膜JMJD6分子是FMDV變體不依賴于整聯(lián)蛋白和HS進(jìn)入細(xì)胞的替代感染途徑的一部分，并且當(dāng)RGD被KGE取代時，成為一個必不可少的相互作用。研究證實，F(xiàn)MDV SAT2可在很少被FMDV感染的CHO-677和CHO-745細(xì)胞系中啟動侵入并復(fù)制，這表明他可能利用一種未知的受體進(jìn)入細(xì)胞[54]。根據(jù)使用的受體不同，病毒可以通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(硫酸乙酰肝素)[55]或以網(wǎng)格蛋白依賴的方式(整聯(lián)蛋白)內(nèi)化[56]。而研究發(fā)現(xiàn)FMDV利用未知受體入侵宿主細(xì)胞時可同時利用網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞途徑和小窩蛋白依賴的內(nèi)吞路徑，并且病毒的入侵依賴發(fā)動蛋白的活動和酸性的核內(nèi)體環(huán)境[57]。研究證實，突變體JMD6-FMDV進(jìn)入CHO-677的方法是通過CCP途徑進(jìn)行的，有趣的是這一途徑不同于HS-適應(yīng)FMDV的小窩途徑，但與FMDV田間株的攝取途徑一致[58]。

3 FMDV與細(xì)胞凋亡

病毒感染誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞凋亡是機體產(chǎn)生病理變化的主要因素，它不僅是機體抗病毒的防御機制也是病毒逃避免疫應(yīng)答或誘發(fā)持續(xù)感染的一種策略。大量的研究證實,很多病毒在其感染周期通過多條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，各途徑即獨立又互相聯(lián)系,參與成分既有病毒亞單位,也有細(xì)胞組分。真核細(xì)胞主要通過死亡受體介導(dǎo)的外部凋亡途徑、內(nèi)部線粒體途徑、B粒酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑(apoptoticpathways)以及近幾年開始關(guān)注的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑[59]介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在FMDV急性感染期，干擾素介導(dǎo)的ISGs誘導(dǎo)可引起細(xì)胞凋亡，與凋亡相關(guān)的CASP7等基因僅在急性感染期間表達(dá)，且隨著感染后時間的延長其表達(dá)逐漸減弱，白細(xì)胞介素-1和-10信號通路以及程序性細(xì)胞死亡(凋亡)通路中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被富集；而促凋亡基因ALDH1A2、ANKRD1和SFRP2等在持續(xù)感染期間的特異性下調(diào)，凋亡通路受到抑制[60-61]。研究證實FMDV可利用內(nèi)源性凋亡途徑，誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化激活caspase-9，通過MHCⅠ類分子誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞DCs發(fā)生細(xì)胞凋亡，并且FMDV內(nèi)化進(jìn)入DC細(xì)胞與宿主LC3、LAMP-1和LAMP-2蛋白有關(guān)[62]。

不同研究表明，病毒可以利用凋亡過程產(chǎn)生足夠的病毒后代或促進(jìn)病毒釋放[63]。有趣的是病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在其致病性中具有誘導(dǎo)和抑制的雙重作用，細(xì)胞凋亡可能誘導(dǎo)機體對病毒感染的防御機制，也可能導(dǎo)致宿主細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。與所有病原體一樣，F(xiàn)MDV被免疫系統(tǒng)識別，主要通過Ⅰ型和Ⅲ型IFNs介導(dǎo)引起強烈的免疫反應(yīng)。為了克服這些細(xì)胞因子引起的強烈抗病毒反應(yīng)，F(xiàn)MDV已經(jīng)進(jìn)化出許多利用其小RNA基因組每個區(qū)域的策略。但是無論如何，感染后的最終結(jié)果將取決于相互競爭的宿主和病毒對細(xì)胞死亡程序的影響之間的平衡[64]。由此可見，病毒與宿主細(xì)胞之間是一場生命的拔河，細(xì)胞為了抑制病毒的擴(kuò)散促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，而病毒為了生存在感染初期會抑制細(xì)胞凋亡。誘導(dǎo)或者抑制在臨界博弈的真相將有助于揭示病毒感染啟動凋亡的分子機制與信號通路,對于研究病毒與宿主的相互作用及致病機制具有重要的意義。

3.1 FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白與細(xì)胞凋亡大量的研究結(jié)果證實FMDV的感染能夠通過多種蛋白和路徑誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡。例如，病毒蛋白FMDV 2C具有對BHK-21細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用，其中caspase 3的活性增強，外源性和內(nèi)源性Nmi蛋白都被招募，短序列(K242IVKALED250)形成α螺旋。該α螺旋介導(dǎo)Nmi與2C蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[65]。最近研究對照FLAG載體或FLAG-2C表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞和FMDV感染PK-15細(xì)胞的凋亡水平，結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染載體的PK-15細(xì)胞相比，2C在24 hpt時并未顯著誘導(dǎo)凋亡，而FMDV感染則誘導(dǎo)顯著的凋亡[66]。3C蛋白具有誘導(dǎo)BHK-21細(xì)胞凋亡的功能,3C蛋白的酶活性可以被2C蛋白的絲氨酸蛋白酶活性所調(diào)控,但其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機制尚不清楚[67]。另外,研究證明FMDV的非結(jié)構(gòu)蛋白L也能夠誘導(dǎo)牛腎細(xì)胞系凋亡，并且細(xì)胞的凋亡與致病性有關(guān),在感染細(xì)胞中L蛋白協(xié)同細(xì)胞內(nèi)蛋白酶,但不依賴caspase,抑制宿主細(xì)胞的翻譯過程,直接或間接地裂解eIF4G I[68]。由此可見，F(xiàn)MDV不僅能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且凋亡在FMDV病毒致病機理中扮演重要的角色。

3.2 FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1 RGD基序與整聯(lián)蛋白相互作用誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡研究證實，整聯(lián)蛋白作為跨膜接頭分子，當(dāng)其受到外界刺激后會迅速聚集成簇從而激活胞內(nèi)的絡(luò)氨酸激酶，從這個部位傳遞啟動一系列復(fù)雜的調(diào)節(jié)細(xì)胞的程序，包括細(xì)胞凋亡[69]。據(jù)報道，cardosin A可通過其RGD基序與人上皮細(xì)胞A549表面整聯(lián)蛋白結(jié)合，內(nèi)化到核內(nèi)體和內(nèi)溶酶體，部分滲透溶酶體膜，引起細(xì)胞凋亡，并且RGD肽的存在能夠干擾cardosin A與細(xì)胞的結(jié)合和細(xì)胞凋亡[70]。研究表明，F(xiàn)MDV重組VP1處理BHK-21細(xì)胞后，通過調(diào)控Akt信號通路能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在沒有Akt參與的條件下,VP1蛋白可以通過糖原合成激酶去磷酸化,切割caspase-3,7,9前體的方式促進(jìn)BHK-21細(xì)胞凋亡[71]。另外，F(xiàn)MDV還能利用VP1衣殼蛋白內(nèi)的RGD基序整聯(lián)蛋白受體的相互作用啟動激活凋亡通路的級聯(lián)反應(yīng)，包括Bcl2的表達(dá)降低，caspases的激活，以及線粒體中細(xì)胞色素c的釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)骨骼肌來源的樹突狀細(xì)胞(BMDCs)發(fā)生凋亡[72]。研究證實，F(xiàn)MDV VP1蛋白可誘導(dǎo)CTY細(xì)胞凋亡，并且可能存在時間依賴性[73]。這些研究結(jié)果表明RGD基序是FMDV整聯(lián)蛋白受體結(jié)合位點，除了具有結(jié)合受體的功能之外，亦能夠直接啟動凋亡程序[74]。由此可見，RGD與整聯(lián)蛋白同時在凋亡中起重要作用，但具體作用形式及機制并不清楚。BARRERA等[75]研究發(fā)現(xiàn)，與Adt.O1C.2B相比，Adt.O1C.2B.F(RGD)對臨床FMD具有更高的保護(hù)作用，這表明RGD纖維基序可能增強抗原提呈細(xì)胞嗜性。因此，RGD觸發(fā)的分子機制的研究可能會為研究與血清型相匹配的新型疫苗提供幫助，從而更加有效得預(yù)防和控制FMD。

4 展望

FMDV通過與宿主細(xì)胞受體關(guān)鍵接頭分子相互作用而啟動感染，利用其整個基因組與細(xì)胞機制相互作用，誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)先天免疫，限制宿主抗病毒分子的表達(dá)進(jìn)而抑制早期先天免疫反應(yīng)，為自己的繁殖創(chuàng)造機會以在建立適應(yīng)性免疫之前傳播，從而在感染后不久造成嚴(yán)重的發(fā)病率。FMDV進(jìn)化出異?？斓膹?fù)制速度來征服宿主，并采用多種策略逃避先天免疫。雖然人們已對FMDV的感染機制有了一定的了解，但對其與宿主相互作用及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機制并沒有系統(tǒng)而深入的研究。RGD基序通過隱藏于易變序列中，不僅使病毒避開宿主的免疫監(jiān)視，同時在抗體結(jié)合病毒入侵細(xì)胞過程中具有重要作用。RGD基序除具有結(jié)合受體的功能之外，與受體的相互作用是否直接參與啟動凋亡程序，通過病毒受體向下傳遞凋亡信號以及采用何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，還需要進(jìn)一步的科學(xué)論證。研究證實，多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白2(PCBP2)和VP0(VP2和VP4的前體蛋白,其結(jié)構(gòu)中,VP4位于VP2氨基末端的延伸部位)之間的相互作用，促進(jìn)PCBP2降解天然免疫接頭蛋白VISA,抑制IFN-β的產(chǎn)生,通過凋亡途徑促進(jìn)FMDV的復(fù)制[76]。FMDV與宿主細(xì)胞受體相互作用及其誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡分子機制不斷突破，將為新型藥物和疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)。