卵巢microRNA的調控作用

成 磊，劉凌斌，李佳璐，任靈通，趙永聚 (西南大學 動物科技學院 重慶市牧草與草食家畜重點實驗室/重慶市草食動物資源保護與利用工程技術研究中心，重慶 400715)

卵巢作為雌性動物生殖器官，在發(fā)育過程中會自發(fā)產(chǎn)生一些生理過程，如：卵泡發(fā)育、排卵、黃體形成與退化等，其中卵泡發(fā)育作為動態(tài)發(fā)育過程，從原始卵泡到成熟卵泡主要經(jīng)歷了征集、選擇、優(yōu)勢化和閉鎖幾個重要環(huán)節(jié)。而在卵泡發(fā)育的成熟過程中，顆粒細胞作為一種支持卵泡形成和發(fā)育的重要細胞，當細胞發(fā)生凋亡時，可誘發(fā)卵泡閉鎖和退化[1]，且顆粒細胞分泌產(chǎn)生的雌激素對動物的生理機能具有重要調節(jié)作用。除此之外，顆粒細胞與卵母細胞和卵泡內膜細胞之間的相互作用對于卵巢的發(fā)育十分重要[2]。

miRNA作為現(xiàn)階段研究最為廣泛的一類內源性非編碼RNA，其最早發(fā)現(xiàn)于線蟲體內，發(fā)現(xiàn)miRNA-lin4可與lin4基因的3′UTR互補結合，抑制lin4基因的翻譯來行使miRNA功能，進而在線蟲的發(fā)育過程中發(fā)揮作用[3]。研究表明，在卵巢發(fā)育過程中被鑒定的大多數(shù)miRNA來源于組織細胞，且在卵泡發(fā)育[4-5]、黃體形成與退化[6]、顆粒細胞增殖與凋亡[7-8]以及性腺類固醇激素合成[9]等過程中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)主要對卵泡發(fā)育、黃體形成與退化、卵母細胞成熟、顆粒細胞增殖與凋亡以及性腺類固醇激素合成過程中的相關miRNA以及作用機制進行綜述，以期為發(fā)現(xiàn)及鑒定更多與卵巢發(fā)育相關的miRNA及深入探索卵巢發(fā)育的調控網(wǎng)絡提供理論基礎。

1 miRNA對卵巢的調控作用

1.1 卵巢和卵巢特定組織miRNA表達譜的鑒定研究表明，miRNA是卵巢中最豐富的小RNA分子，在卵巢發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，所以挖掘鑒定與卵巢發(fā)育相關的miRNA是研究miRNA調控卵巢發(fā)育的前提。隨著高通量測序技術的快速發(fā)展和成本的降低，許多卵巢及卵巢特定組織的miRNA表達譜已相繼被鑒定(表1)，包括鼠[10]、鵝[11]、牛[12-15]、雞[16-17]、人[18-19]、豬[20]、山羊[21]、綿羊[22-23]等物種，這些不同物種中miRNA的發(fā)現(xiàn)將有助于對不同發(fā)育階段的卵巢及卵巢特定組織中miRNA功能的研究。AHN等[10]通過Illumina測序方法，在小鼠卵巢組織中鑒定出398個已知miRNAs和30個新型miRNAs，其中Let-7、let-7i、miR-672、miR-322、miR-503和miR-465家族是X染色體上檢測到的最豐富的X-連鎖miRNA，而miR-672、miR-503和miR-465家族在睪丸與卵巢組織中優(yōu)先表達。XU等[16]就巢鵝卵巢中miRNAs進行表達譜分析，共鑒定出1 328個保守miRNAs和22個新型miRNAs，并對差異表達的miRNAs(miR-320、miR-202、miR-146和miR-143*)進行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些miRNAs主要參與性腺類固醇激素生物合成。XIONG等[12]在牦牛生發(fā)泡期(GV)和中期Ⅱ(MⅡ)的卵母細胞中鑒定出801和1 018個特異組織表達的miRNAs，共發(fā)現(xiàn)75個miRNAs差異表達；其中MⅡ期相較于GV期，47個miRNAs表達上調，28個miRNAs表達下調，通過通路富集分析發(fā)現(xiàn)，這些miRNAs主要參與ECM(細胞外基質)—受體相互作用途徑和蛋白質消化吸收途徑。WU等[16]采用高通量測序技術，分析了產(chǎn)蛋率高和低的雞卵巢組織中miRNAs表達譜，共發(fā)現(xiàn)了17個差異表達的miRNAs，其中6個是新型miRNAs，11個是已知miRNAs；通過基因富集分析發(fā)現(xiàn)，這些已知miRNAs主要參與類固醇激素生物合成過程；并發(fā)現(xiàn)在繁殖調控相關通路中miR-200a-3p的表達顯著上調，表明該miRNA可能是影響家禽繁殖通路的關鍵調節(jié)因子，但具體的調節(jié)機制仍需進一步研究確認。

表1 卵巢或卵巢不同組織中miRNAs表達譜的鑒定

現(xiàn)階段，關于不同物種卵巢的卵泡及各個卵巢功能細胞(顆粒細胞、卵丘細胞、卵母細胞等)miRNA表達譜的研究已全面展開，研究者通過qRT-PCR技術對卵巢發(fā)育相關的miRNA進行定量分析，并結合生物信息學分析軟件、熒光素酶報告基因及Western blot等試驗驗證關鍵候選miRNA在卵巢、卵泡、黃體以及卵泡亞功能單位中的功能及調控機制，表明miRNA可作為調控卵巢發(fā)育的關鍵調控因子，其在卵巢發(fā)育過程發(fā)揮著重要作用。

1.2 miRNA對卵泡發(fā)育的調控作用卵泡發(fā)育是一個高度協(xié)調和精確調節(jié)的生理過程[24-25]，在雌性動物性機能發(fā)育的不同時期，都呈現(xiàn)出一種動態(tài)變化過程。目前關于miRNA調控卵泡發(fā)育的研究已取得很多成果(表2)，miRNA主要參與調控原始卵泡的形成與生長，如miR-143[26]、miR-145[27]、miR-376a[28]等。ZI等[25]首次在多產(chǎn)與非多產(chǎn)山羊的卵泡期卵巢中鑒定出191個差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-99a和miR-493在卵泡組織中高表達，暗示其有可能在卵泡發(fā)育中起重要作用，但具體的作用機制尚不清楚。miR-143作為促凋亡、抗增殖調控因子，研究發(fā)現(xiàn)其在小鼠原始卵泡中通過抑制前顆粒細胞增殖和下調細胞周期相關基因的表達來抑制原始卵泡的形成[26]。YANG等[27]為研究miRNA調控原始卵泡發(fā)育分子機制，在初生后3～5日齡的小鼠卵巢中鑒定出24個差異表達miRNA，通過基因富集分析表明，這些miRNA通過影響Wnt、MAPK、TGF-β、mTOR等信號通路來調控原始卵泡生長的起始，其中TGF-β信號通路對于卵泡的發(fā)育尤為重要，它可以調控卵泡發(fā)育的各個階段，而miR-145通過靶向TGF-β信號通路中的TGFBR2基因，調控原始卵泡發(fā)育和維持原始卵泡靜止。有研究新生小鼠中調控哺乳動物原始卵泡形成的miRNA-靶mRNA，發(fā)現(xiàn)miR-376a可直接作用于增殖細胞核抗原基因(PCNA)的3′UTR，過表達miR-376a后可顯著下調PCNA表達，且卵巢中卵母細胞的凋亡數(shù)量會顯著降低，原始卵泡數(shù)量會顯著增加[28]，這些研究都為研究miRNA調控卵泡生長發(fā)育提供理論基礎。雖然miRNA作為關鍵調節(jié)因子在卵泡發(fā)育過程中起著重要調節(jié)作用，但通過哪些信號通路中的哪些關鍵基因影響卵泡的發(fā)育仍是研究的難點與熱點，因為卵泡發(fā)育作為一個復雜的生理過程，在不同發(fā)育階段(原始卵泡、生長卵泡、成熟卵泡)miRNA所發(fā)揮的作用不一樣，要想徹底了解miRNA在卵泡發(fā)育過程中如何發(fā)揮作用還需進一步研究。

1.3 miRNA對卵泡閉鎖的調控作用在卵泡發(fā)育的過程中，只有1%的卵泡會發(fā)育成熟和排卵，而99%以上的卵泡在不同發(fā)育階段都會發(fā)生閉鎖退化，將該過程稱為卵泡閉鎖[29]。卵泡閉鎖是一種高度復雜的自發(fā)現(xiàn)象，是由卵母細胞周圍的顆粒細胞凋亡所致[30]。近些年研究表明，miRNA通過靶向作用于不同信號通路中的關鍵基因來調控卵泡閉鎖，進而影響顆粒細胞的凋亡(表2)[31-33]。LIN等[34]在豬正常卵泡和早期閉鎖卵泡中鑒定出23個差異表達miRNAs，并發(fā)現(xiàn)差異表達miR-26b可通過靶向作用于DNA損傷相關基因(ATM)，進而促進顆粒細胞凋亡。CAO等[35]探索不同閉鎖階段卵泡中l(wèi)et-7 miRNA家族的概況，發(fā)現(xiàn)在健康和早期閉鎖卵泡中所有l(wèi)et-7家族成員的表達顯著下調，而let-7g在逐漸閉鎖的卵泡中表達卻上調，表明let-7g在顆粒細胞的凋亡中起著重要作用。雖然已確定了許多與卵泡閉鎖相關的miRNA，但是這些miRNA通過哪些靶基因在不同物種中發(fā)揮相應功能還需進一步研究鑒定。

1.4 miRNA對卵母細胞成熟的調控作用卵母細胞的成熟是指卵母細胞獲得恢復減數(shù)分裂以及進一步發(fā)育到第2次減數(shù)分裂，為受精及胚胎發(fā)育做準備[36]。Dicer作為影響miRNA和siRNA成熟的關鍵因子，可調節(jié)轉錄水平的基因重組與基因表達。MURCHISON等[37]對小鼠卵母細胞中的Dicer敲除后發(fā)現(xiàn)紡錘體的形成和染色體聯(lián)發(fā)生異常，導致卵母細胞無法完成減數(shù)分裂，表明miRNA在卵母細胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。然而對于特定miRNA調控卵母細胞成熟機制的研究報道很少(表2)，尤其是miRNA對于卵母細胞成熟的調控。XIAO等[38]采用miRNA微陣列技術分析胰島素樣生長因子1(IGF-1)處理后的MⅠ期人卵母細胞中miRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)145個miRNAs表達上調，200個miRNAs表達下調，而被上調超過30倍的miR-133b被選做后續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)miR-133b在轉錄和翻譯水平上負調控其潛在靶點轉膠蛋白-2(TAGLN2)，影響著卵母細胞的生長和成熟。PAN等[39]發(fā)現(xiàn)在豬卵母細胞體外成熟階段，抑制miR-574的表達導致卵丘細胞擴展顯著增加，而透明質酸合成酶2(HAS2)作為卵丘細胞產(chǎn)生細胞外基質的關鍵酶，miR-574可直接靶向卵丘細胞中的HAS2基因抑制卵母細胞成熟。在對豬卵丘-卵母細胞復合體(COCs)中的miRNA研究中發(fā)現(xiàn)，miR-378在卵丘細胞MⅡ期的表達水平明顯低于GV期，且miR-378能抑制卵丘細胞中芳香化酶(CYP19A1)的表達，導致雌二醇(E2)的分泌顯著下降，這就表明抑制芳香化酶是miR-378調節(jié)COCs成熟的機制之一[40]。SONG等[41]對豬GV期和MⅡ卵母細胞中的miRNA進行了深度測序分析，共發(fā)現(xiàn)7種差異表達miRNA，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-27b-3p能夠靶向作用于PPARγ基因調控卵母細胞成熟。所以，miRNA作為一種非編碼RNA在卵母細胞成熟過程中扮演著重要作用，但對于miRNA調控卵母細胞成熟的機制研究還很少，尤其是對轉錄后水平分子機制的研究。

1.5 miRNA對黃體形成與退化的調控作用黃體是成熟卵泡排卵后，由卵泡殘余組織迅速發(fā)生深度重塑、高度血管化后形成的暫時性腺體樣結構[42]。研究表明，miRNA在黃體的形成與退化中過程扮演著重要作用(表2)[42-45]，目前已初步闡明miR-96[42]、miR-29b[43]以及miR-17-5P和let-7b[44]在黃體發(fā)育和維持中發(fā)揮著重要作用。OTSUKA等[44]為了研究miRNA在黃體形成與退化過程中的作用，將小鼠中的Dicer1敲除，造成小鼠黃體形成受損進而導致黃體功能不全無法維持妊娠，并通過蛋白質印跡分析發(fā)現(xiàn)，卵巢中l(wèi)et-7b和miR-17-5P表達下調，而TIMP1蛋白表達上調，為進一步解決Dicer1缺乏時TIMP1表達上調機制，作者構建雙熒光素酶載體，發(fā)現(xiàn)let-7b和miR-17-5P通過靶向作用于TIMP1基因從而調控黃體形成。MOHAMMED等[42]通過miRNA微陣列技術對牛卵泡和黃體組織中miRNA進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-183-96-18簇在黃體組織中相對于卵泡組織表達顯著增加，且miR-96是該簇內上調最多的miRNA，后續(xù)在人和牛黃體細胞中研究發(fā)現(xiàn)，miR-96通過靶向作用于FOXO1基因促進黃體顆粒細胞分泌產(chǎn)生孕酮。XU等[43]對miR-29b在牛黃體發(fā)育的不同階段中的表達水平以及調控黃體細胞增殖和孕酮的分泌量進行研究，發(fā)現(xiàn)miR-29b在黃體形成的早期表達最高，中期、后期時逐漸下降，退化期的表達量最低，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-29b可降低OXTR基因表達，促進孕酮的分泌和黃體細胞的增殖。同樣在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，miR-378可通過靶向IFNGR1基因調控黃體細胞凋亡[46]。

表2 miRNAs在卵泡和黃體發(fā)育中的作用

目前，雖已有大量研究表明miRNA在黃體形成與退化過程中發(fā)揮著重要作用，但對黃體中miRNA生物學影響的研究很少，尤其是對黃體組織的研究。所以特定miRNA在黃體形成與退化過程中介導的細胞增殖、凋亡以及孕激素分泌等分子機制還有待于深入研究。

2 miRNA對顆粒細胞的調控作用

顆粒細胞作為組成卵泡的重要成員，是產(chǎn)生雌激素的重要場所。目前，關于miRNA在卵泡發(fā)育中的研究主要集中在調控顆粒細胞增殖、凋亡以及性腺類固醇激素合成方面(表3)。

2.1 miRNA對顆粒細胞增殖的調控作用顆粒細胞作為卵巢組織中最易分離的細胞，也是現(xiàn)階段研究最多的生殖細胞之一。研究表明，miRNA對顆粒細胞有促增殖和抗增殖作用(表3)。在抗增殖方面，miR-383可通過抑制細胞周期相關蛋白(cyclin D1、cyclin B)和細胞周期蛋白依賴激酶(CDK1、CDK2、CDK4)的表達，將顆粒細胞周期阻滯在G0/G1期，進而抑制顆粒細胞的增殖[47]。miR-34c作為抗增殖調節(jié)因子，能與靶基因FOXO3a相互作用，抑制豬顆粒細胞增殖[48]。GENG等[49]在患有多囊卵巢綜合癥(PCOS)患者的顆粒細胞中檢測到miR-99a表達顯著下調，IGF-1R表達上調，進一步研究得出miRNA-99a通過作用于IGF-1R基因，抑制顆粒細胞增殖和促進顆粒細胞凋亡。在促進顆粒細胞增殖方面，PANDE等[50]在發(fā)情周期第19天的牛優(yōu)勢卵泡顆粒細胞中發(fā)現(xiàn)高度富集miR-424/503簇，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-424/503簇通過激活蛋白信號通路靶向Smad7基因調控牛顆粒細胞增殖和細胞周期進程。而miR-17-92簇(miR-17-5p、miR-19a、miR-20a、miR-92a)通過靶向PTEN和BMPR2基因調控牛顆粒細胞的增殖和分化[51]。KONG等[52]在PCOS患者的顆粒細胞中對miR-9是否影響顆粒細胞的增殖和凋亡進行研究，發(fā)現(xiàn)在顆粒細胞中miR-9表達顯著上調，維生素D受體(VDR)表達顯著下調，進一步研究得出miR-9通過靶向VDR促進顆粒細胞增殖和抑制顆粒細胞凋亡。同樣在PCOS患者的顆粒細胞中miR-93表達顯著上調，并通過靶向CDKN1A基因促進顆粒細胞增殖，而且發(fā)現(xiàn)高濃度的胰島素會引起miR-93表達上調、CDKN1A表達下調和促進人卵巢顆粒細胞的增殖[53]。以上在PCOS患者顆粒細胞中對miR-9、miR-93以及miRNA-99a調控顆粒細胞增殖與凋亡的研究，為研究PCOS中顆粒細胞功能障礙提供新思路。

2.2 miRNA對顆粒細胞凋亡的調控作用miRNA作為重要調控因子在顆粒細胞凋亡過程中也發(fā)揮著重要作用(表3)，可促進和抑制顆粒細胞的凋亡。在促凋亡方面，AN等[54]研究表明，增加chi-miR-4110表達可顯著降低Smad2的表達，進一步研究得出chi-miR-4110通過靶向作用于Smad2基因，促進山羊顆粒細胞凋亡。CAO等[55]研究表明，在豬卵巢卵泡閉鎖過程中l(wèi)et-7g表達水平顯著上調，將let-7g模擬物轉染到顆粒細胞時，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡相關基因(CASP3、BAX和BIM)的表達顯著上調，抗凋亡基因(BCL-2和MCL-1)則顯著下調，過表達let-7g后MAP3K1表達顯著降低，并導致FoxO1基因發(fā)生去磷酸化，進一步研究得出let-7g通過靶向作用于MAP3K1基因，促進顆粒細胞的凋亡，從而促進FoxO1表達和去磷酸化。同樣在對let-7g的另一項研究中發(fā)現(xiàn)，let-7g可直接靶向TGFBR1基因，促進顆粒細胞凋亡[56]。ZHOU等[57]研究表明，miR-150通過靶向作用于STAR基因促進顆粒細胞凋亡。miR-26b通過直接作用于Smad4基因促進豬顆粒細胞凋亡，且可間接靶向去泛素化酶9X(USP9X)來調控Smad4蛋白發(fā)生去泛素化，從而促進豬顆粒細胞凋亡[58]。在抑制顆粒細胞凋亡方面，ZHU等[59]研究表明，在豬卵泡顆粒細胞中miR-222通過靶向血小板凝血酶蛋白1(THBS1)來調節(jié)雌激素的分泌，并作為抗凋亡因子來控制顆粒細胞的凋亡。XIONG等[60]研究表明，miR-22在小鼠健康卵泡中的表達量最高且能與靶基因SIRT1結合，進而抑制小鼠顆粒細胞凋亡。miR-92a作為細胞凋亡途徑中的關鍵因子，其在豬健康卵泡中表達最高，可靶向作用于Smad7基因抑制顆粒細胞的凋亡[61]。SONG等[62]研究PCOS患者顆粒細胞中miRNA作用，發(fā)現(xiàn)在顆粒細胞中miR-186和miR-135a的表達水平顯著升高，且兩者都通過靶向雌激素受體2(ESR2)，抑制人顆粒細胞的凋亡；而且還發(fā)現(xiàn)在顆粒細胞中miR-186和miR-135a的表達水平與PCOS患者的血清E2水平呈正相關，這一研究也為了解PCOS病理生理學提供了新的見識。

表3 miRNA在顆粒細胞中的作用

2.3 miRNA對性腺類固醇激素合成的調控作用在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細胞和卵泡內膜細胞會分泌性腺類固醇激素。其中雌激素可刺激卵泡發(fā)育和誘導動物發(fā)情，孕激素可通過刺激子宮內膜腺體分泌和抑制子宮肌肉收縮而促進胚胎著床并維持妊娠。而在性腺類固醇激素的合成過程中miRNA發(fā)揮著重要調節(jié)作用(表2,3)。GAO等[63]研究表明，miR-222作用于RUNX2基因參與HCG(人絨毛膜促性腺激素)誘導的RUNX2表達，且在這一過程中miR-222促進E2的生成和山羊顆粒細胞的增殖。LIU等[64]對豬顆粒細胞中差異表達miR-1275的作用進行研究，發(fā)現(xiàn)miR-1275可促進顆粒細胞凋亡和抑制雌激素合成。孕酮受體(PGR)作為孕酮產(chǎn)生生理作用的主要甾體激素，可與miR-378-3p靶向結合抑制顆粒細胞中PGR的表達影響孕酮生成[65]。miR-150通過抑制綿羊顆粒細胞中性腺類固醇激素合成相關基因(CYP11A1和HSD3B1)的表達，抑制孕酮合成[66]。miR-205作為細胞增殖與凋亡調節(jié)因子，通過靶基因環(huán)腺苷酸反應成分結合蛋白1(CREB1)作用，抑制鼠雌激素的合成與促進顆粒細胞凋亡[67]。miR-143作為卵巢顆粒細胞增殖的關鍵調節(jié)因子，主要在小鼠顆粒細胞中表達，并可作為FSH信號通路的介質，通過靶向KRAS基因調節(jié)E2的合成和促進顆粒細胞增殖[68]。miR-133b通過下調小鼠顆粒細胞中Foxl2基因的表達，從而抑制性腺類固醇激素相關基因(STAR和CYP19A1)合成，促進E2生成[69]。對于miRNA調控性腺類固醇激素合成方面的研究主要集中在顆粒細胞中，但到底有哪些miRNA發(fā)揮直接調控作用，哪些miRNA發(fā)揮間接作用，這仍是目前研究的重點和難點，也是未來有待解決的問題之一。

3 討論

隨著miRNA在生物學領域的研究越來越多，有關miRNA在組織以及細胞中的調控機制已成為研究熱點。目前，miRNA在卵巢發(fā)育中的研究主要集中于調控卵母細胞和顆粒細胞功能上，仍處于起步階段。近幾年，越來越多與卵泡、黃體、顆粒細胞相關的miRNA通過生物信息學技術、高通量測序、miRNA微陣列等方法被挖掘鑒定，其中表達量高的miRNA與卵巢發(fā)育相關的信號通路、靶基因相互作用，形成一個復雜的、完整的卵泡發(fā)育、黃體形成與退化、顆粒細胞增殖凋亡、類固醇激素合成的調控網(wǎng)絡，間接參與到卵巢發(fā)育的過程中。但是miRNA調控卵巢發(fā)育主要是通過對靶基因的調控實現(xiàn)，因此在調控網(wǎng)絡中尋找特定miRNA的靶基因，研究其在卵泡發(fā)育、黃體形成、卵母細胞成熟、激素合成中的功能是現(xiàn)階段與未來的研究重點。

特定miRNA的功能主要受到miRNA與mRNA之間復雜相互作用的影響，這些相互作用顯示出多對一和一對多的關系，所以僅僅通過一個靶基因已很難全面闡述miRNA在特定組織和細胞中的生物學功能。因此，隨著研究者對各組織器官miRNA調控網(wǎng)絡研究的深入，在未來應將研究的方向放在miRNA對信號通路中多個因子的調控機制上，這更有助于揭示miRNA在特定組織中的生物學功能。另外，卵泡閉鎖作為卵泡發(fā)育的重要生理過程，目前在卵泡閉鎖中miRNA的篩選鑒定和作用機制研究較少，所以對于卵泡閉鎖階段miRNA的功能研究也是今后的一個研究方向。

隨著轉基因技術和基因敲除技術的日漸成熟，miRNA在細胞模型和特定組織的研究將更加深入，這也為miRNA調控卵巢發(fā)育的機制研究奠定了理論基礎。