納米技術(shù)和納米材料在結(jié)核防治中的應(yīng)用

劉一朵，梁正敏，趙德明，周向梅 (中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京 100193)

結(jié)核病是最致命的人畜共患病之一，他是全球十大死亡原因之一，也是世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，2018年，在全球范圍內(nèi)估計(jì)有1 000萬(wàn)人罹患結(jié)核病，而中國(guó)預(yù)估有86萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病病例，仍是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家[1]。同時(shí)，全球因牛結(jié)核病造成的損失高達(dá)30億美元，在部分發(fā)展中國(guó)家，牛結(jié)核病威脅著人類(lèi)健康[2]。由于卡介苗對(duì)于成人保護(hù)和不同地區(qū)保護(hù)力不同的局限性以及耐藥性結(jié)核不容樂(lè)觀的控制現(xiàn)狀，亟需開(kāi)發(fā)新的策略來(lái)預(yù)防和控制人畜結(jié)核病。

納米技術(shù)是目前熱門(mén)的研究方向之一，基于其制備的納米制劑在生物醫(yī)學(xué)上具有廣泛的應(yīng)用潛力。由于納米制劑的高反應(yīng)活性和大比表面積，是良好的吸附劑、催化劑和傳感器。納米遞送系統(tǒng)是指將目的藥物或者抗原成分溶解，包裹于脂質(zhì)體或高分聚合物等載體系統(tǒng)制成納米顆粒。基于納米顆粒的遞送系統(tǒng)具有優(yōu)良的機(jī)體相容性和靶向性，易于通過(guò)生物屏障，可以提高藥物的生物利用度，在結(jié)核防治方面具有良好的發(fā)展前景。同樣，基于納米技術(shù)的檢測(cè)方法作為結(jié)核診斷手段也正在受到關(guān)注。本研究綜述了納米技術(shù)在結(jié)核病治療、預(yù)防和檢測(cè)方面的應(yīng)用及優(yōu)點(diǎn)。

1 納米系統(tǒng)在結(jié)核治療中的應(yīng)用

針對(duì)敏感型結(jié)核的治療標(biāo)準(zhǔn)方案通常是一線藥物異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin,RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)和乙胺丁醇(ethambutol,EMB)聯(lián)合使用6個(gè)月，每種藥物都有毒副作用且長(zhǎng)期用藥易產(chǎn)生耐藥性和病人依從性降低的問(wèn)題。而耐藥菌株的出現(xiàn)使結(jié)核的治療更為復(fù)雜，根據(jù)WHO的數(shù)據(jù)[1]，2018年約有50萬(wàn)利福平耐藥結(jié)核病病例(其中78%為耐多藥結(jié)核病)，如何控制結(jié)核耐藥性的產(chǎn)生成為世界性難題。納米系統(tǒng)在結(jié)核治療上的研究已取得了顯著進(jìn)展,納米遞送系統(tǒng)可提高藥物的生物利用度、減少給藥劑量和頻率、增加可能的給藥途徑,增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性,且成本低,是一種具有廣泛應(yīng)用前景的新型抗結(jié)核方法。

1.1 脂質(zhì)體脂質(zhì)體是50～100 nm大小的球形微囊，通常具有脂質(zhì)雙層外殼和水相內(nèi)核。根據(jù)藥物性質(zhì)，可以選擇將藥物包裹于脂質(zhì)體的親水內(nèi)核或脂質(zhì)層，將其準(zhǔn)確遞送至靶器官或者靶細(xì)胞。脂質(zhì)體具有良好的生物可降解性和靶向性，易于透過(guò)生物膜，通過(guò)緩慢釋放藥物，從而減少了暴露于敏感組織或器官的藥量，減少毒副作用和耐藥性的產(chǎn)生，是靶向遞送藥物的理想載體。已有針對(duì)真菌感染的脂質(zhì)體兩性霉素B和針對(duì)乳腺癌的脂質(zhì)體阿霉素被批準(zhǔn)上市[3],顯示出脂質(zhì)體用于結(jié)核病治療的應(yīng)用前景。

近年研究表明脂質(zhì)體是良好的抗結(jié)核藥物遞送系統(tǒng)，包裹利福布汀的脂質(zhì)體與傳統(tǒng)利福布汀給藥相比，在小鼠感染結(jié)核模型中減少了肺臟和脾臟的載菌量，肺部病理?yè)p傷也有所減輕，而其中用二棕櫚酰磷脂酰膽堿∶二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPC∶DPPG)制備的脂質(zhì)體制劑最有效[4];MANCA等[5]發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體的脂質(zhì)成分對(duì)利福平向肺部遞送有影響，其中外殼磷脂成分更高的利福平脂質(zhì)體表現(xiàn)出更優(yōu)良的霧化性質(zhì)以及被細(xì)胞攝取的能力，可以通過(guò)呼吸道有效遞送藥物；松蘿酸(UA)是一種已被證明對(duì)結(jié)核分枝桿菌有效的天然化合物，但效力不高，F(xiàn)ERRAZ等[6]發(fā)現(xiàn)將松蘿酸包裹進(jìn)脂質(zhì)體增強(qiáng)了其抗結(jié)核分枝桿菌效力，最低抑菌質(zhì)量濃度由31.25 mg/L降至0.98 mg/L，與利福平聯(lián)用也顯示出良好的協(xié)同作用(分?jǐn)?shù)抑制濃度指數(shù)FICI=0.28)。

1.2 納米聚合物聚合物納米顆粒是天然高分子材料或合成的具有生物相容性和生物可降解性的固體納米膠體系統(tǒng)，可將藥物溶解、截留、包封或吸附在其上遞送至靶器官釋放。線性聚合物如聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等和兩親性嵌段共聚物是2種主要類(lèi)型的聚合物納米顆粒，被廣泛用于抗菌藥物的遞送。這些聚合物可以改變顆粒大小、長(zhǎng)度和表面活性劑，從而適用于不同給藥方式。目前，聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)及聚乳酸(polylactic acid,PLA)被認(rèn)為是無(wú)害、無(wú)刺激的的綠色高分子聚合物，可在體內(nèi)分解為乳酸[7],也是常用于開(kāi)發(fā)納米制劑的高分子材料。

異煙肼作為親水性抗結(jié)核藥物在PLGA中的包載率較低，F(xiàn)ARIA等[8]用檸檬酸處理異煙肼得到與其作用類(lèi)似的異煙肼檸檬酸醛(JVA)，開(kāi)發(fā)出JVA-PLGA納米顆粒，提高了藥物包封率。其研究表明JVA-PLGA可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)分枝桿菌的殺傷作用，并促進(jìn)藥物細(xì)胞內(nèi)生物利用度，可以直接與分枝桿菌相互作用，有助于以低藥量殺滅肉芽腫中的細(xì)菌。為更有效的降低用藥量，分枝桿菌細(xì)胞壁成分分枝桿菌酸(MA)被用于納米顆粒表面作為靶向配體，LEMMER等[9]設(shè)計(jì)了一種包載異煙肼的新型納米制劑MA-INH-PLGA,發(fā)現(xiàn)加入MA之后感染鳥(niǎo)分枝桿菌或牛分枝桿菌的巨噬細(xì)胞攝取納米顆粒的能力顯著增加，這可能是因?yàn)镸A作為分枝桿菌的毒力因子及其膽甾類(lèi)性質(zhì)可以與感染細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而也大大提高了藥物進(jìn)入細(xì)胞的速度及濃度。而在大鼠模型中，氣溶膠形式吸入的甘露醇修飾的利福平PLGA納米顆?？砷L(zhǎng)時(shí)間沉積于肺部并靶向巨噬細(xì)胞[10]。

1.3 納米乳納米乳或微乳是由水相、油相、乳化劑和助乳化劑按適當(dāng)?shù)谋壤纬傻牧綖?～100 nm乳滴分散在另一種溶液中的熱力學(xué)穩(wěn)定體系[11]。納米乳的類(lèi)型與普通乳劑一樣分3種，水包油(O/W)型、油包水(W/O)型及雙連續(xù)型(W/O/W或O/W/O)，納米乳可以提高難溶性藥物的溶解度，發(fā)揮緩釋作用，與脂質(zhì)體分散系相比有更高的穩(wěn)定度。MEHTA等[12]制備了以吐溫80為表面活化劑的異煙肼微乳，是一種水包油型乳液，具有成本低、穩(wěn)定性高、易于制備的優(yōu)點(diǎn)，并能控制持續(xù)緩慢釋放異煙肼。PETER等[13]開(kāi)發(fā)了氯法齊明納米乳，改善氯法齊明溶解性差和毒副作用的特點(diǎn)，并且在小鼠鳥(niǎo)分枝桿菌感染模型中，氯法齊明納米乳顯示出比脂質(zhì)體載體更好的抗菌效力。

1.4 無(wú)機(jī)納米材料作為抗菌材料，納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)遞送抗生素發(fā)揮協(xié)同作用，也可以根據(jù)特性單獨(dú)發(fā)揮作用。納米金屬或金屬氧化物材料可以作為一種易于制備的抗菌材料，減少耐藥性的產(chǎn)生。這類(lèi)材料具有多種抗菌機(jī)制，如損傷細(xì)菌細(xì)胞膜、釋放有毒的金屬離子如Zn2+、Cd2+和Ag+，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)及酶的合成等。

分枝桿菌需要吸收鐵元素來(lái)合成分枝桿菌素，針對(duì)這一特性可以開(kāi)發(fā)新的抗結(jié)核方法。NARAYANASAMY等[14]制備了Ga納米顆粒，由于鎵(Ga)與鐵(Fe)的相似性，分枝桿菌錯(cuò)誤地吸收了Ga3+從而阻斷了Fe3+的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)這一機(jī)制，Ga納米顆粒成功抑制了HIV-TB合并感染巨噬細(xì)胞中病原體的生長(zhǎng)。Ag納米材料已確認(rèn)了2種抗菌機(jī)制，包括接觸殺傷和離子介導(dǎo)的殺傷[15]。此外，ZnO納米材料的抗菌機(jī)制是產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)，從而損傷細(xì)菌膜、DNA和蛋白質(zhì)[16]。BANU等[17]評(píng)估了銀納米顆粒對(duì)耐藥結(jié)核分枝桿菌的抗菌效力，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為6.25～12.5 mg/L可以抑制結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)。HEIDARY等[18]研究了Ag、ZnO和Ag-ZnO納米顆粒對(duì)耐藥結(jié)核分枝桿菌的效力，結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用相比，Ag和ZnO納米顆粒聯(lián)合對(duì)結(jié)核分枝桿菌菌株的殺傷更大，并且對(duì)耐藥菌株的殺傷力大于對(duì)敏感菌株，表明Ag-ZnO納米顆粒能有效抵抗耐藥結(jié)核分枝桿菌。對(duì)于金屬顆粒的毒性，可以考慮在納米材料表面合成具有生物相容性的植物衍生的次生代謝產(chǎn)物涂層，以減少對(duì)人體健康的有害影響。

1.5 基于藻酸鹽的納米遞送系統(tǒng)海藻酸是一種天然多糖，也是一種優(yōu)良的高分子材料，其相對(duì)分子質(zhì)量為10～60 kDa，具有污染小、可再生、無(wú)毒性、儲(chǔ)量豐富等特點(diǎn)[19]。藻酸鹽通常與殼聚糖聯(lián)合使用在藥物遞送緩釋方面有著廣泛的應(yīng)用。藻酸鹽中存在陰離子羧基組可與陽(yáng)離子殼聚糖緊密吸附，形成穩(wěn)定的微球結(jié)構(gòu)。藻酸鹽作為水溶性聚合物在體內(nèi)清除率比脂類(lèi)載體高，但人體缺乏在分子水平降解高分子藻酸鹽的酶，所以藻酸鹽的相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)保持在50 kDa以下，以便腎臟能夠清除[20]。ZAHOOR等[21]制備了包裹異煙肼、利福平和吡嗪酰胺的霧化藻酸鹽納米顆粒，發(fā)現(xiàn)霧化15 d，所有器官(肺臟，肝臟和脾臟)中的所有藥物均高于最低抑制濃度，而游離藥物僅1 d。

2 納米系統(tǒng)在結(jié)核疫苗中的應(yīng)用

2015年，歐洲藥品管理局(EMA)認(rèn)為新型瘧疾疫苗Mosquirix可被用于非洲6周到17個(gè)月的兒童免疫接種，該疫苗含有納米級(jí)脂質(zhì)體佐劑[22]，顯示出納米制劑在開(kāi)發(fā)疫苗方面的遠(yuǎn)大前景。針對(duì)結(jié)核分枝桿菌這類(lèi)胞內(nèi)寄生菌，對(duì)能夠調(diào)節(jié)機(jī)體Th1細(xì)胞依賴(lài)性免疫的疫苗有迫切需要，這對(duì)于機(jī)體獲得持久免疫力和有效保護(hù)力有著關(guān)鍵作用。與傳統(tǒng)疫苗相比，納米疫苗具有生物相容性、非免疫原性和靶向性的特點(diǎn)，并且可以長(zhǎng)時(shí)間緩慢且持續(xù)地釋放抗原,一些納米顆粒具有易于被APC(antigen present cell)攝取的能力，在結(jié)核疫苗開(kāi)發(fā)方面顯示出足夠的潛力。

近期，納米系統(tǒng)在結(jié)核疫苗方面的應(yīng)用研究主要集中于包載或吸附結(jié)核抗原以及抗菌肽。HART等[23]利用納米級(jí)的巴西棕櫚蠟制備了包載有結(jié)核抗原Ag85B(早期表達(dá))、Acr(后期表達(dá))和HBHA(黏附素)融合蛋白的新型疫苗，在小鼠結(jié)核感染模型中能有效增強(qiáng)BCG的免疫效果，并誘導(dǎo)大量CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞增殖以及肺部組織駐留記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生。MALIK等[24]開(kāi)發(fā)了一種H1-PLGA結(jié)核疫苗，包載結(jié)核抗原Ag85B-ESAT6融合蛋白，單劑該疫苗接種6周后，與單獨(dú)Ag85B-ESAT6相比，H1-PLGA免疫的C57BL/6J小鼠血清抗體顯著增加，并且IFN-γ和TNF-α水平分別升高了約6.03和2.80倍，顯示出強(qiáng)烈的Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)?？咕氖歉鞣N動(dòng)植物等生物體非特異性免疫中的重要組成成分，既可以在免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮正向作用，又能反向調(diào)節(jié)使機(jī)體免疫功能恢復(fù)正常,經(jīng)常用于疫苗的免疫增強(qiáng)劑。SILVA等[25]將抗菌肽LLKKK18包在納米凝膠中，發(fā)現(xiàn)其能被巨噬細(xì)胞有效攝取，體內(nèi)體外試驗(yàn)均能有效降低結(jié)核分枝桿菌載量。

納米疫苗遞送系統(tǒng)具有同時(shí)將抗原和免疫增強(qiáng)劑遞送至相同樹(shù)突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的能力,聚合物納米粒子具有可調(diào)整的特性，是一種理想的載體，其中PLGA顆粒的表面經(jīng)過(guò)一定的修飾能夠誘導(dǎo)黏膜免疫，增強(qiáng)免疫效果，并能夠彌補(bǔ)亞單位疫苗口服或鼻腔給藥的弊端。本課題組選用PLGA高分子材料包封結(jié)核分枝桿菌抗原argF蛋白[26]和CFP-10蛋白[27]，制備了2種防治牛分枝桿菌感染的亞單位納米微粒，在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中驗(yàn)證了這2種納米微粒在一定程度上能有效增強(qiáng)卡介苗誘導(dǎo)的抗結(jié)核免疫力，相關(guān)納米疫苗的研究也在進(jìn)行中。

3 納米技術(shù)在結(jié)核診斷中的應(yīng)用

為了控制結(jié)核的傳播，及時(shí)和準(zhǔn)確的診斷手段至關(guān)重要。納米粒子的物理和化學(xué)性質(zhì)允許進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、靈敏和經(jīng)濟(jì)高效的診斷，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)多種基于納米技術(shù)的檢測(cè)方法。

QIN等[28]建立了一種基于熒光納米粒子的間接免疫熒光顯微鏡技術(shù)(FNP-IIFM)，使用抗結(jié)核分枝桿菌抗體識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的一抗，然后在標(biāo)記的二氧化硅納米顆粒包裹抗體結(jié)合蛋白(蛋白質(zhì)A)，隨之產(chǎn)生熒光信號(hào)進(jìn)行顯微鏡檢查，與傳統(tǒng)方法相比有更強(qiáng)的信號(hào)和光穩(wěn)定性，可以在4 h內(nèi)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物。DNA納米金探針技術(shù)是目前熱門(mén)的結(jié)核檢測(cè)研究方向，該方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，適合于發(fā)展中國(guó)家推廣。2017年，TSAI等[29]開(kāi)發(fā)了一種納米金探針技術(shù)用于結(jié)核檢測(cè)，該方法基于與檢測(cè)樣品DNA雜交的單鏈DNA探針?lè)肿拥淖饔?，DNA雜交改變了納米顆粒的表面電荷密度發(fā)生不同程度的聚集，從而影響金納米顆粒的顏色變化，通過(guò)在紙質(zhì)平臺(tái)顯色并比色,達(dá)到了1.95×10-2μg/L的檢測(cè)限。李海燕等[30]將納米金技術(shù)與基因芯片結(jié)合開(kāi)發(fā)了一種DNA納米金探針新方法，通過(guò)納米金顆粒將檢測(cè)信號(hào)放大，并通過(guò)生物素化的信號(hào)探針顯色將基因芯片上的檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)化成肉眼可見(jiàn)的信號(hào)或通過(guò)普通儀器即可掃描的信號(hào)，從而確定樣本中細(xì)菌核酸的存在。

在動(dòng)物結(jié)核檢測(cè)方面，CHEN等[31]開(kāi)發(fā)了一種金納米顆粒修飾的納米生物傳感器用于快速檢測(cè)牛奶中的牛分枝桿菌，檢測(cè)限達(dá)到了3.5×103CFU/mL，該方法將殼聚糖、金納米顆粒(AuNPs)和堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(ALP-IgG)的混合溶液滴加到玻碳電極上形成具有良好性能的堅(jiān)固膜即生物傳感器，通過(guò)抗分枝桿菌的抗體與ALP-IgG的反應(yīng)，可鑒定是否有牛分枝桿菌被固定在膜上,納米技術(shù)在結(jié)核診斷方面也有巨大潛力。

4 建議與展望

納米顆粒具有3種特點(diǎn)[32]：尺寸微小，易通過(guò)生物屏障和組織間隙，在細(xì)胞水平釋放所載藥物；表面原子處于高能狀態(tài)，常具有催化活性;避免藥物和體液直接接觸，一來(lái)減少毒副作用，二來(lái)保存所載抗原的活性，有利于抗原的持續(xù)作用。近年來(lái)的研究表明，不同納米材料在結(jié)核防治中優(yōu)缺點(diǎn)各異(表1)，在控制人畜結(jié)核方面有著巨大潛力。盡管如此，納米技術(shù)在結(jié)核上的應(yīng)用也有一些難題，如納米顆粒的安全性問(wèn)題和納米技術(shù)在潛伏性結(jié)核感染上的局限性。

表1 不同納米材料在結(jié)核防治中的優(yōu)缺點(diǎn)

粒徑、電位、表面親疏水性等理化性質(zhì)往往可以決定納米顆粒被細(xì)胞攝取和細(xì)胞作用的方式，對(duì)納米顆粒理化性質(zhì)的深入研究有助于開(kāi)發(fā)出更高效的納米遞送系統(tǒng)，增加包載藥物或抗原與細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)；開(kāi)發(fā)對(duì)人體危害小或者無(wú)害的納米系統(tǒng)，可以選擇天然綠色化合物修飾載體材料，減少納米顆粒的毒性；根據(jù)結(jié)核感染和機(jī)體免疫的特性設(shè)計(jì)納米材料，PI 等[33]根據(jù)結(jié)核分枝桿菌能逃逸溶酶體吞噬并限制藥物進(jìn)入宿主細(xì)胞這一特性設(shè)計(jì)了一種靶向巨噬細(xì)胞的異煙肼納米硒顆粒，該納米顆粒可以迅速進(jìn)入巨噬細(xì)胞釋放異煙肼，促進(jìn)細(xì)菌與溶酶體融合并與異煙肼協(xié)同殺傷細(xì)菌。

相信隨著納米技術(shù)的發(fā)展和科學(xué)研究的不斷深入，會(huì)有更多的納米藥物、納米疫苗和納米診斷方法進(jìn)入臨床，為人畜結(jié)核的防控提供更有效的藥物、疫苗和診斷方法。