大黃酸分散體對糖尿病大鼠肝損傷的抑制機制

呂懷恩，王文永，王 蕊，王 鵬，付靜波，張寶生，董曉宇，高玲煥

(1.唐山市豐潤區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，唐山 063000；2.華北理工大學基礎醫(yī)學院,唐山 063000)

糖尿病發(fā)生率有持續(xù)增長趨勢，2型糖尿病發(fā)病率較高，糖尿病死亡的主要原因是后期多器官損傷，其中糖尿病肝、腎損傷占比較高[1-4]。大黃酸(rhein)是大黃等中藥的活性成分，近年來研究報道較多[5]，但rhein溶出度差，吸收慢。課題組前期研究表明，以聚乙烯吡咯烷酮為載體將rhein制成固體分散體，能明顯增加rhein的溶解度，提高其生物利用度，動物實驗顯示其對高糖所致腎損傷有抑制作用[6]。rhein具有抑制乙醇損傷肝臟作用[7]，對肝臟有保護作用，但rhein對糖尿病肝臟病理改變的影響及機制的相關文獻很少，特別是大黃酸分散體(rhein-F)對糖尿病肝損傷的作用未見文獻報道。本研究應用rhein-F干預糖尿病大鼠，觀察其對肝損傷的影響并與rhein比較，為rhein-F的進一步研究奠定了實驗基礎。

1 儀器與材料

1.1儀器 GA-3型血糖儀及試紙(Sinocare)；Chemray 420 型全自動生化分析儀(美國Rayto)；200PRO 型多功能酶標儀(瑞士Tecan)；H-7650 型透射電子顯微鏡(日本日立有限公司)；光學顯微鏡(日本Olympus)；真彩病理圖像分析系統(tǒng)(高騰科技有限公司)；5180R型高速低溫離心機(德國Eppendorf)；F6-10-8G型超細勻漿機(FLUKO)；DYY-6C型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；G560E型渦旋混合器(美國Scientific Industries)；FA2104N型電子天平(上海第二天平儀器廠)；Unervirsal Hood Ⅲ型全自動曝光機(Bio-Rad Laboratories)。

1.2試藥 鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，批號18883-66-4)；大黃酸(Bio-Bustyl，湖北云鎂科技有限公司，批號478-43-3，質量分數(shù)>98%)；血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)測定試劑盒(南京建成藥業(yè)有限公司，批號分別為：C010-3-1、C009-3-1)；PVDF 膜(美國Milipore公司，批號K5EA5857D)；RIPA裂解液(Solarbio，批號R0020)；蛋白濃度測定試劑盒(APPLYGEN基因技術有限公司，批號P1511)；三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、核因子-κB (NF-κB) 和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ抗體)，均購自Santa Cruz Biotechnology.Inc；糖基化終產(chǎn)物(AGEs)酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)試劑盒(武漢基因美科技有限公司)；麥芽糖(上海信裕生物科技有限公司，批號20150127);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，淄博海瀾化工有限公司,批號20161003); 3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽 (DAB，江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號20180531)；磷酸鹽緩沖液(PBS，北京夢怡美生物科技有限公司，批號20160920)；戊二醛(上海復申生物科技有限公司，批號20181104)；洗膜緩沖液(TBST，自制)。

1.3實驗動物 Wistar大鼠50只，SPF級，雄性，體質量為(190±25) g，大鼠普通飼料及高脂飼料，均購于北京華阜康生物科技有限公司,許可證號：SCXK(京)2014-0004。實驗均在華北理工大學SPF實驗室進行。

2 實驗方法

2.1rhein-F的制備方法 按照參考文獻方法制備[6]。

2.2大鼠2型糖尿病模型的建立 大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機選取10只常規(guī)飼養(yǎng)，作為正常對照(NC)組。另外40只大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)10周，禁食20 h，尾靜脈注射12.5 g·L-1STZ(檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋)，注射量為25 mg·kg-1。NC組大鼠同時尾靜脈注射等量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。STZ注射1周后，所有大鼠禁食8 h，取尾靜脈血測定空腹血糖(FBG)，2次FBG均≥16.7 mmol·L-1的大鼠被視為造模成功，選入實驗組。

2.3分組與給藥 10只正常大鼠作為NC組。大鼠共成模36只，剔除血糖過高和體質量過高或較低的6只，剩余30只，按照血糖高低順序編號，從第1只大鼠開始，按編號順序每3只大鼠放1個籠內(nèi)(共10個籠)，之后再將每個籠內(nèi)的3只大鼠隨機分到糖尿病模型組(DM)、rhein組和rhein-F組中，每組10只。rhein組與rhein-F組給藥量均為80 mg·kg-1(所含rhein劑量相等)，rhein組與rhein-F分別用5 g·L-1的CMC-Na配成混懸液，同時NC組與DM組給予同體積CMC-Na溶液。各組大鼠每日固定同一時間給藥，連續(xù)給藥8周。

2.4觀察指標

2.4.1FBG與餐后血糖(PBG) 給藥8周后，測定大鼠禁食8 h后的FBG；給藥8周后各組大鼠禁食16 h后給藥，于0.5 h灌胃麥芽糖2 g·kg-1，分別檢測麥芽糖灌胃后1、2 h的PBG。

2.4.2血清AST、ALT、AGEs和肝臟指數(shù)(LI)的測定 給藥后禁食16 h，用100 g·L-1水合氯醛腹腔注射(3 mL·kg-1)麻醉大鼠，負壓管經(jīng)腹主動脈取血，分離血清。用全自動生化分析儀測定血清中AST和ALT活性，用Elisa法測定AGEs含量；取血后立即剖腹取肝臟，置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，用吸水紙吸干血，稱定肝質量。計算LI，LI=大鼠肝質量(g)÷大鼠體質量(g)×100%。

2.4.3肝組織病理學觀察 切取每只大鼠1/4的肝左葉，立即置于甲醛固定液中，48 h后常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝組織的病理改變；馬松染色(Masson)觀察肝臟纖維組織的增生情況。迅速切取約0.5～1.0 mm3肝組織，置于2.5 g·L-1戊二醛中，切片超薄制備，染色，透射電鏡觀察超微結構及拍照。

2.4.4免疫組織化學法測定肝組織PPAR-γ和NF-κB蛋白表達 肝組織石蠟切片3.5 μm，脫蠟水化，修復抗原，血清封閉，分別加入PPAR-γ和NF-κB抗體(1∶250)，4 ℃孵育過夜，PBS洗后二抗37 ℃孵育1 h，PBS洗后滴加DAB顯色1 min，純水中終止后染核。棕黃染色為陽性表達，用Image-Pro Plus 6.0測定積分光密度值(IOD值)。

2.4.5Western Blot檢測肝組織PPAR-γ和NF-κB蛋白表達 液氮研磨肝組織，低溫離心后取上清液，BCA蛋白定量，上樣量50 μg，80 V恒壓電泳，200 mA恒流電轉至PVDF膜，5 g·L-1牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h，一抗(PPAR-γ1∶500，NF-κB 1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，洗膜后顯影。條帶采用Image J軟件測定灰度值，與內(nèi)參GAPDH的比值表示其相對含量。

3 結果

3.1rhein-F對糖尿病大鼠FBG和PBG的影響 見表1。由表1可知，DM組的FBG和PBG明顯高于NC組(P<0.01)；rhein組和rhein-F組的FBG和PBG均明顯低于DM組(P<0.01)，空腹8 h后rhein-F組血糖略低于rhein組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。灌胃麥芽糖后rhein-F組血糖值明顯低于rhein組，特別是餐后1 h血糖明顯低于rhein組(P<0.01)。

表1 rhein-F對糖尿病大鼠FBG和PBG的影響Tab.1 Effect of rhein-F on FBG and PBG indiabetic rats

3.2rhein-F對糖尿病大鼠血清AST、ALT、AGEs和LI的影響 見表2。DM組大鼠血清ALT、AST、AGEs和LI明顯高于NC組(P<0.05 或P<0.01)，rhein組和rhein-F組的上述各指標均不同程度的低于DM組，rhein-F組降低更明顯，rhein-F組對AST和AGEs的降低明顯優(yōu)于rhein組。

表2 rhein-F對糖尿病大鼠血清AST、ALT、AGEs和LI的影響 Tab.2 Effect of rhein-F on serum AST，ALT，AGEs and LI in diabetic rats

3.3rhein-F對糖尿病大鼠肝組織病理結構的影響 HE染色：NC組(見圖1-A1)大鼠肝組織未見炎細胞浸潤和小脂滴，組織結構基本正常；DM組(見圖1-A2)大鼠肝組織結構紊亂，肝細胞出現(xiàn)脂肪變性，散在炎癥細胞浸潤和片狀出血點；rhein組(見圖1-A3)和rhein-F組(見圖1-A4)脂滴空泡和炎癥細胞明顯減少，肝組織形態(tài)結構明顯改善，rhein-F組肝組織形態(tài)結構明顯優(yōu)于rhein組。

Masson染色：NC組大鼠肝組織在門靜脈處幾乎未見亮綠染色的膠原纖維物質(見圖1-B1)；DM組肝臟組織可見較多的亮綠染色的膠原纖維，主要分布在血管和匯管區(qū)周圍(見圖1-B2)；與DM組比較，rhein組(見圖1-B3)和rhein-F組(見圖1-B4)亮綠染色組織減少。

透射電鏡：NC組大鼠肝細胞核膜光滑，核較大，包漿中內(nèi)質網(wǎng)、高爾基體等細胞器豐富，形態(tài)正常(見圖1-C1)；DM組肝細胞內(nèi)可見線粒體腫脹，空泡化，數(shù)量減少，內(nèi)質網(wǎng)擴張和斷裂，可見散在脂滴和膠原纖維(見圖1-C2)；rhein組(見圖1-C3)和rhein-F組(見圖1-C4)肝細胞超微結構明顯改善，少見脂滴和膠原纖維，rhein-F組超微結構改變較rhein組輕。

圖1 糖尿病大鼠肝臟組織的形態(tài)結構1.正常對照組；2.糖尿病模型組；3.大黃酸組；4.大黃酸分散體組；A.蘇木精-伊紅染色結果；B.馬松染色結果；C.透射電鏡結果。Fig.1 Morphological structure of liver tissues in diabetic rats1．NC group；2.DM group；3.rhein group；4.rhein-F group；A.HE staining；B.Masson staining；C.Electronic microscope.

3.4rhein-F對糖尿病大鼠肝組織PPAR-γ和NF-κB蛋白表達的影響 見圖2和表3。

圖2 糖尿病大鼠肝組織中PPAR-γ和NF-κB蛋白表達的免疫組化圖片和Western Blot條帶Fig.2 Immunohistochemistry images and Western Blot bands of PPAR-γ and NF-κB protein expression in liver tissues of diabetic rats

表3 糖尿病大鼠肝組織中PPAR-γ和NF-κB蛋白表達的免疫組化和Western Blot結果Tab.3 Immunohistochemistry and Western Blot results of PPAR-γ and NF-κB protein in liver tissues of diabetic rats

3.4.1免疫組化結果 由圖2和表3可知，NC組大鼠肝組織PPAR-γ蛋白質表達呈強陽性，可見較多棕黃色染色顆粒，以細胞漿分布為主；NF-κB蛋白在NC組肝組織中幾乎無表達；而DM組PPAR-γ和NF-κB蛋白表達量與NC組相反(P<0.01)；rhein組PPAR-γ蛋白質表達明顯高于DM組(P<0.05)，NF-κB蛋白表達明顯低于DM組(P<0.01)；rhein-F組作用強于rhein組。

3.4.2Western Blot結果 由圖2和表3可知，大鼠肝組織PPAR-γ蛋白表達條帶的灰度值NC組和rhein-F組明顯高于DM組(P<0.01)，而NF-κB蛋白的表達DM組明顯高于NC組和rhein-F組(P<0.01)；rhein-F組上調(diào)PPAR-γ蛋白表達和下調(diào)NF-κB蛋白表達的作用強于rhein組。Western Blot結果與免疫組化結果基本一致。

4 討論

多數(shù)復方中藥中均含有rhein，如三黃瀉心湯、大黃附子湯及茵陳蒿湯等[8]，其中發(fā)揮藥效的主要活性成分為rhein[9]。但由于rhein是難溶性的，使其很難充分發(fā)揮作用。因此，近年來利用藥物制劑新技術對rhein的新劑型和結構改造進行了大量研究，明顯地提高了其生物利用度[10-11]。固體分散體技術可增加難溶性藥物的溶解度和溶出速率，提高藥物的生物利用度，從而充分發(fā)揮藥物活性[12-14]。本實驗在前期研究的基礎上，觀察了rhein-F對2型糖尿病大鼠肝損傷的抑制作用，測定相關蛋白表達含量探討其作用機制，并與單純rhein比較。血糖測定結果顯示，rhein組和rhein-F組均可降低FBG，但二者之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；rhein-F組對PBG的降低更明顯，特別是對餐后1 h血糖的降低明顯強于rhein組，表明rhein-F作用更快、更強，可能與rhein-F使rhein溶出度增加、提高生物利用度有關，因此，rhein-F能更好地抑制PBG的升高。

rhein-F組對AST和AGEs的降低作用明顯強于rhein組，表明rhein-F改善糖尿病肝功能的作用強于rhein；同樣rhein-F對高糖所致肝臟病理損傷的抑制作用也強于rhein，主要表現(xiàn)在抑制肝組織脂肪變性、抑制膠原纖維增生和超微結構的改變，顯示了rhein-F有更好的肝保護作用。

進一步探討rhein的作用機制發(fā)現(xiàn)，rhein和rhein-F都可使肝組織中PPAR-γ蛋白表達水平升高、NF-κB蛋白表達水平降低；免疫組化和Western Blot方法結果基本一致，且rhein-F作用強于rhein。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB是炎癥反應的中心介質，而PPAR-γ可抑制NF-κB的活性和增加胰島素敏感性[15]。Yu C等[16]報道，rhein可通過抑制NF-κB活性達到預防內(nèi)毒素所致急性腎損傷。曾慶云等[14]研究發(fā)現(xiàn)，rhein可促進PPAR-γ蛋白表達，改善胰島素敏感度。同時rhein具有較強的抗炎、抗氧化和抗細胞外基質增生作用[17-19]。本研究表明，rhein及rhein-F抑制糖尿病肝損傷的機制可能與其上調(diào)PPAR-γ和下調(diào) NF-κB蛋白表達及降糖、抑制AGEs產(chǎn)生有關。推測rhein為過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)的激動劑，達到降糖作用和抗炎作用,從而發(fā)揮肝保護作用。

前期研究已報道rhein-F的溶解度增大，生物利用度增加，穩(wěn)定性更高[6]。STZ糖尿病模型大鼠和自發(fā)2型糖尿病db/db小鼠都灌胃給予rhein和rhein-F (二者所含rhein劑量同等)，結果顯示，二者均可減輕腎組織病理損傷，改善糖尿病腎功能[20-21]。但rhein對糖尿病肝損傷的影響研究報道較少，本實驗應用高脂飲食與STZ制備2型糖尿病大鼠模型，進一步考察了rhein-F對糖尿病肝功能及肝組織病理損傷的影響，結果顯示，rhein和rhein-F具有良好的保護組織器官的作用，與rhein相比，rhein-F具有作用更快、更強和更持久的特點，再次證明了rhein-F作用優(yōu)于rhein。

綜上所述，rhein-F可降低血糖，抑制肝臟組織病理損傷，對糖尿病肝臟有保護作用，同等劑量下作用優(yōu)于rhein。作用機制除了抗炎、抗氧化外，尚與抑制AGEs產(chǎn)生及上調(diào)PPAR-γ和下調(diào) NF-κB蛋白表達有關。