莽草酸激酶作為抗結(jié)核分枝桿菌藥物發(fā)現(xiàn)靶標的研究進展

李蒙，代曉偉，卞聰，朱小紅，司書毅，李妍，姜威

近年來，隨著結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）單藥耐藥（SDR-TB）、多藥耐藥（MDR-TB）和廣泛耐藥（XDR-TB）菌株的不斷出現(xiàn)和蔓延，使得傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物的臨床有效率不斷下降，結(jié)核病也因此再次成為嚴重危害人類健康和公共安全的傳染性疾病[1-5]。研發(fā)新型抗結(jié)核藥物，解決結(jié)核病治療所面臨的難題成為控制結(jié)核病疫情的當務之急。針對傳統(tǒng)藥物進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化或是通過對現(xiàn)有藥物進行組合獲得新的組劑，相對而言是獲得抗結(jié)核新藥的捷徑，由此獲得的新藥在特定情況下可提高治療效率，但由于此類藥物在化學結(jié)構(gòu)和作用機制上與傳統(tǒng)藥物無明顯差異，導致其不能有效地避開 MTB 的耐藥機制，對高水平耐藥結(jié)核菌無效，仍然不能有效地治療耐藥結(jié)核病[6-9]。因此發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標進而發(fā)現(xiàn)新的先導藥物成為抗結(jié)核藥物研發(fā)的重要方向。

莽草酸途徑是細菌、真菌、藻類、高等植物等合成必需芳香族氨基酸的必需途徑，該途徑合成的分支酸是合成色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸以及葉酸、泛酸和奎寧酸等芳香型化合物的前體物質(zhì)[10]。人體內(nèi)并不存在莽草酸途徑中各個酶的編碼基因，而且目前尚未有以莽草酸途徑為靶標的抗結(jié)核藥物應用于臨床，以莽草酸途徑的關鍵酶為靶標的抗結(jié)核藥物可能具有有效、低毒且無交叉耐藥的優(yōu)勢，因此莽草酸途徑中的關鍵酶作為新型抗結(jié)核藥物靶標引起了研究者的廣泛關注[11-15]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個以莽草酸途徑中的關鍵酶為靶標的具有抗結(jié)核活性的藥物，其中多數(shù)為莽草酸激酶（shikimate kinase，SK）抑制劑，該激酶被認為是莽草酸途徑中最具有潛力的藥物研發(fā)靶標[16]。本文就近年來結(jié)核分枝桿菌莽草酸激酶（MtSK）結(jié)構(gòu)和功能相關研究及其抑制劑的發(fā)現(xiàn)等方面作簡要綜述，為新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)提供參考。

1 MtSK 結(jié)構(gòu)和功能

MtSK 蛋白分子量為 18.58 kD，由aroK基因（Rv2539c）編碼。aroK基因缺失導致 MTB 無法生長，當回補外源性的aroK基因時，突變株得以存活，證明 MtSK 是維持MTB 生長的必需蛋白[17]。在莽草酸途徑中，MtSK 催化第五步反應，它以 ATP 為高能磷酸供體，使磷?；鶊F從 ATP轉(zhuǎn)移至莽草酸，從而生成 3-磷酸莽草酸并釋放出 1 個ADP 分子[18-19]（圖1）。

圖1 MtSK 催化反應

MtSK 屬于核苷單磷酸（NMP）激酶家族，MtSK 核心是五股平行的 β-片層結(jié)構(gòu)，兩側(cè)有八個 α-螺旋結(jié)構(gòu)[20]。MtSK 包含 NMP 激酶家族共有的三個功能性結(jié)構(gòu)域：①核心結(jié)構(gòu)域，包含五股平行的 β-片層結(jié)構(gòu)和形成核苷酸結(jié)合位點的 phosphate-binding loop（P 環(huán)，G9-S17，也稱為Walker A-motif）；②LID 結(jié)構(gòu)域（G112-D124 殘基），它封閉在活性位點上，負責打開和關閉催化位點，允許酶與底物和產(chǎn)物相互作用，并具有對 ATP 結(jié)合至關重要的殘基；③NMP 結(jié)合域（T33-E61，也稱為 SB 結(jié)構(gòu)域），其功能是識別和結(jié)合莽草酸[21-22]（圖2）。最近，基于對配體結(jié)合的綜合動態(tài)分析，有人提出 MtSK 由四個結(jié)構(gòu)域組成：①ESB結(jié)構(gòu)域（擴展 SB；殘基 32-93）；②核苷酸結(jié)合（NB）結(jié)構(gòu)域，負責構(gòu)成核苷酸結(jié)合的柔性區(qū)域，包括 P 環(huán)、AB 環(huán)（殘基 148-155）和 101-110 的片段；③LID 結(jié)構(gòu)域（殘基 112-124）；④還原核心（RC）結(jié)構(gòu)域，它覆蓋 NB 結(jié)構(gòu)域和 ESB 部分結(jié)構(gòu)域（殘基 62-93）[18]。RC 結(jié)構(gòu)域是酶最剛性的部分，而 LID 和 NB 結(jié)構(gòu)域是最柔性的部分[21-23]。

圖2 MtSK 晶體結(jié)構(gòu)

莽草酸的羧基端與 R58 和 R136 結(jié)合，3-羥基端與D34 和 G80 結(jié)合，而 2-羥基與 D34 相結(jié)合[24]。Mg2+和ADP 與 P 環(huán)、LID 結(jié)構(gòu)域和腺嘌呤結(jié)合環(huán)中殘基相互作用。MtSK 在底物結(jié)合時會發(fā)生很大的構(gòu)象變化，其中 SB和 LID 結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)變化最大。在催化過程中，ATP 首先與酶結(jié)合，并誘導 LID 結(jié)構(gòu)域在活性位點上的大幅度移動。之后，莽草酸底物與活性位點結(jié)合，LID 結(jié)構(gòu)域在活性位點上方閉合，使 Arg110 和 Arg117 分別進入 ATP 和SB 結(jié)構(gòu)域。莽草酸通過 Arg136 和 Asp34 的側(cè)鏈和水網(wǎng)直接和間接結(jié)合活性位點[21,25]。

2 MtSK 抑制劑

隨著 MtSK 晶體結(jié)構(gòu)的解析和酶活性檢測方法的建立，建立在虛擬篩選和底物類似物設計、針對 MtSK 三個重要的功能結(jié)構(gòu)域開展的酶抑制劑的篩選也多有報道。目前也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個 MtSK 抑制劑，并且均表現(xiàn)出良好的抗結(jié)核活性。

2.1 基于 MtSK 晶體結(jié)構(gòu)的抑制劑的虛擬篩選和底物類似物的設計

早在 2008年，Segura-Cabrera 和 Rodríguez-Pérez[26]應用 eHiTS 6.2 軟件包模擬 MtSK 的莽草酸結(jié)合位點建立虛擬篩選方法，與來自 FAF-Drugs 數(shù)據(jù)庫的化合物進行對接，以莽草酸和競爭性抑制劑 6-S-氟代莽草酸作為陽性藥物，獲得 644 個得分高于莽草酸底物的化合物，其中 axce1得分最高。得分高的典型化合物具有巰基、三唑或四唑雜環(huán)芳烴結(jié)構(gòu)。但是此研究僅限于化合物與晶體結(jié)構(gòu)的虛擬對接和成藥性虛擬評價，并未有酶抑制活性和抗結(jié)核活性的檢測。

2010 年，Kumar 等[27]基于 MtSK 開口和閉合晶體結(jié)構(gòu)進行了莽草酸和 ADP 結(jié)合位點的關鍵氨基酸分析，并且基于此進行了二肽的合成。進一步對接分析發(fā)現(xiàn)最合適的二肽抑制劑是 NH3-Arg-Asp-COO（RD），其與 MtSK 的開口和閉口結(jié)構(gòu)以相似的方式結(jié)合，并且占據(jù)了幾乎所有可用于結(jié)合的口袋空間。RD 與 MtSK 結(jié)合的 Kd 值為 5.49 nm，比底物莽草酸的 Kd 值高出約 8000 倍，比 axce1 的 Kd值高 10 倍，因此，二肽 RD 有望成為開發(fā)抗結(jié)核藥物的先導化合物。Vianna 和 de Azevedo[28]應用 MolDOCK 虛擬篩選 MtSK 抑制劑，對 ZINK 數(shù)據(jù)庫中的 4580 個化合物中選擇打分在前 20 名的化合物，星形孢菌素是其中之一。進一步的結(jié)合位點分析發(fā)現(xiàn)這些化合物與激酶的結(jié)合主要是在莽草酸結(jié)合位點。

基于結(jié)構(gòu)的藥物虛擬篩選評分方法的命中率相對較低，單一靶標和位點的結(jié)合打分標準是原因之一，Core Site-Moiety Maps 篩選方法的重點是在靶蛋白共享保守結(jié)合位點的情況下，發(fā)現(xiàn)多個藥效團，提供有用的指標，以提高篩選的準確性。Hsu 等[29]采用 Core Site-Moiety Maps 方法篩選 MtSK 和 HpSK 抑制劑，發(fā)現(xiàn) 6 個新的 IC50低于10 μmol/L 的化合物 NSC45611、NSC162535、NSC45612、NSC45174、NSC45547 和 NSC45609，這些化合物多為 ATP和莽草酸競爭性抑制劑。同時，從 65 種已有的激酶抑制劑發(fā)現(xiàn)兩個具有抑制作用的化合物 AG538 和 GW5074。酶動力學分析表明，NSC45611、NSC162535 和 NSC45612 是ATP 和莽草酸的雙重競爭性抑制劑，AG538 是 ATP 的競爭性抑制劑。利用該方法，成功地發(fā)現(xiàn)了六種新的 HpSK 和MtSK 抑制劑（8.0 mmol/L）。65 個激酶抑制劑中的兩個也被發(fā)現(xiàn)同時抑制 HpSK 和 MtSK 活性。NSC45611、NSC162535 和 NSC45612 是 ATP 和莽草酸的競爭性抑制劑，這表明它們屬于一類新的莽草酸激酶抑制劑。

2013 年，Blanco 等[30]基于結(jié)構(gòu)和分子動力學（MD）模擬研究，分析了 MtSK/ATP/莽草酸以及 MtSK/ADP/三磷酸莽草酸結(jié)合過程中的酶的構(gòu)象變化以及與底物的相互作用關鍵位點，在闡明酶與底物或者產(chǎn)物結(jié)合的決定性因素和酶催化轉(zhuǎn)化所必需的關鍵酶運動的基礎上，設計了莽草酸的結(jié)構(gòu)類似物。類似物包括共形限制莽草酸類似物、羥基衍生物和氨基莽草酸，酶抑制活性研究發(fā)現(xiàn)這些類似物都是競爭性可逆的酶抑制劑，Ki 值在 46～1050 μmol/L。構(gòu)效關系和 MD 模擬研究表明，由于 SK 酶被設計成能夠識別天然底物熱力學上不太穩(wěn)定的構(gòu)象，因此那些能夠保持酶所識別構(gòu)象并導致 LID 和（或）SB 結(jié)構(gòu)域的流動性降低的化合物是開發(fā)酶抑制劑的一個很好的策略。

與前面的單一篩選方法不同，2016年，Mehra 等[31]利用已報道的 MtSK 抑制劑的數(shù)據(jù)進行電子相似性搜索和藥效團建模雙重篩選，在從 ChemBridge 庫 20000 個市售化合物的類似藥物中篩選到 15 個化合物進行進一步的酶活評價，其中兩個苯并噻唑衍生物 5489375 和 5311863 表現(xiàn)出較好的酶抑制活性，IC50分別為（10.69 ± 0.9）μmol/L和（46.22 ± 1.2）μmol/L。對 5489375 深入研究，發(fā)現(xiàn)它既不是 ATP 競爭性抑制劑，也不是莽草酸競爭性抑制劑，通過對 5489375 進行分子對接和 MD 模擬分析，發(fā)現(xiàn)它可能是結(jié)合在 MtSK 的變構(gòu)位點，抑制了催化產(chǎn)物的釋放，使得激酶無法恢復催化構(gòu)象，這種機制的研究為 MtSK 抑制劑的虛擬篩選提供了一種新的思路。

2.2 基于 MtSK 活性的抑制劑的發(fā)現(xiàn)

在 MtSK 催化過程中，通過檢測 ADP 和 3-磷酸莽草酸的形成或者檢測 ATP 的消耗都可以反映 MtSK 的催化活性。丙酮酸激酶（PK）能使 ADP 和磷酸烯醇式丙酮酸反應生成 ATP 和丙酮酸，后者能夠在 L-乳酸脫氫酶和 NADH 作用下生成 L-乳酸和 NAD+，在OD340nm檢測 NADH 的減少可以間接地反映 ADP 的生成量。基于此，Rajput 等[32]建立了 MtSK 的檢測方法。通過對來自ChemBridge 數(shù)據(jù)庫的 1000 個具有抗結(jié)核桿菌活性的化合物進行酶抑制活性評價，最終發(fā)現(xiàn)了 5 個 IC50低于10 μmol/L 的化合物，分別是硫代巴比妥酸鹽、萘醌、噻唑乙腈、查爾酮和噻唑烷二酮。這些化合物都是 ATP 競爭性抑制劑，分子對接發(fā)現(xiàn)它們結(jié)合在 ATP 結(jié)合位點，Arg110是關鍵作用的氨基酸。5 個化合物對標準株 H37Rv 的 MIC在 4～16 μg/ml，對 MDR 菌株也有一定的抑制活性。

2014 年，Zaher 等[33]通過 LC-MS 檢測 3-磷酸莽草酸生成的方法對 404 個具有抗結(jié)核活性的化合物進行 MtSK抑制活性的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 14 個噁二唑酰胺和2-氨基苯并噻唑類化合物，它們的 IC50在 1.94～36.04 μmol/L，細胞毒性小，SI 指數(shù)均在 10 以上。但是在 2017年，Alturki等[34]對這 14 個化合物進行分析，發(fā)現(xiàn)它們是 MtSK 的非特異性抑制劑，這些化合物在溶液中容易形成聚集體，這可能是它們酶抑制活性和體內(nèi)活性的原因。它們的抗菌活性可能與其他靶標相關，而不僅僅是 MtSK 抑制。

Mulabagal 和 Calderón[35]使用超濾液相色譜/質(zhì)譜（UF-LC/MS）檢測化合物與 MtSK 結(jié)合活性，液質(zhì)聯(lián)用（LC/MS）檢測化合物對 MtSK 的抑制活性，評估了 4 個化合物對 MtSK 蛋白的抑制作用，其中 3 個化合物是吡唑啉酮類，一個是星形孢菌素，發(fā)現(xiàn) 4 個化合物與 MtSK 能夠特異性結(jié)合，EC50在 0.07～0.3 μmol/L。

王霞等[36]應用 Kinase-Glo?Plus Luminescent Kinase Assay 試劑盒建立了 MtSK 激酶抑制劑的篩選方法，通過檢測反應體系中 ATP 的消耗量來反映 MtSK 的酶活性。該方法結(jié)合恥垢分枝桿菌表型篩選發(fā)現(xiàn)了 1 個對 MtSK蛋白有抑制作用的化合物 IMB-T5297，該化合物的 IC50為1.745 μg/ml，與 MtSK 的Kd 值為 21.51 μmol/L，對哺乳動物細胞的毒性很低，但是 IMB-T5297 對標準株 H37Rv、臨床分離耐藥株 XDR 的抑制活性也較低（MIC 分別為49.723 和 47.754 μg/ml）。

2.3 其他 MtSK 激酶抑制劑

除了有目的的 MtSK 抑制劑的發(fā)現(xiàn)，在具有抗結(jié)核活性的藥物機制研究中也發(fā)現(xiàn)多個具有 MtSK 抑制活性的化合物。

多酚類化合物是具有多種生物活性的一類天然產(chǎn)物，不同來源的多酚類化合物也被發(fā)現(xiàn)具有抗分枝桿菌的活性。在機制研究中，Pandey 等[37]發(fā)現(xiàn)多酚類化合物卡馬拉素具有MtSK 的抑制活性。該化合物對結(jié)核分枝桿菌的 IC50在 9～12 μmol/L，而 MtSK 的缺陷株則表現(xiàn)出對卡馬拉素的拮抗。體外酶活檢測發(fā)現(xiàn)，在 1.56～100 μmol/L 的濃度下，卡馬拉素表現(xiàn)出對 MtSK 的強抑制活性，在 1.56 μmol/L濃度下，抑制率高于 50%，在 50 μmol/L 濃度下，抑制率接近 100%。分子對接顯示 MtSK 與卡馬拉素的結(jié)合能為-8.8 kcal/mol，與 Ser16、Thr17 和 Arg110 表現(xiàn)出極性相互作用?？R拉素是 PKC-σ 抑制劑，但是在其作用 2 小時后，PKC-σ 由最初的低表達明顯上升，而卡馬拉素依舊能夠抑制結(jié)核桿菌的生長，因此認為卡馬拉素的生長抑制活性是兩個酶抑制的疊加結(jié)果。所有這些研究都表明 MtSK是卡馬拉素抗結(jié)核活性的重要靶標。

生物堿 manzamine 是一類分離自印度太平洋海綿的化合物，具有廣泛的生物活性。其中 manzamine A 是第一個被分離出來的該類化合物，它在體外表現(xiàn)出良好的抗結(jié)核活性，對結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 的 MIC50值為 1.5 μg/ml，與利福平相當。Simithy 等[38]在該類化合物抗結(jié)核機制的研究中，應用 LC-MS 的檢測方法從 26 個衍生物中發(fā)現(xiàn)了6 個化合物具有 MtSK 抑制活性，包括 manzamine A、8-hydroxymanzamine A、manzamine E、manzamine F、6-deoxymanzamine X 和 6-cyclohexamidomanzamine A。初步動力學評估表明，這 6 個化合物都是混合的非競爭性酶抑制劑，其中 6-cyclohexamidomanzamine A 對所有形式的MtSK（游離酶、每種酶-底物二元復合物和酶-底物三元復合物）的 Ki 值最低。6-cyclohexamidomanzamine A 與MtSK 的對接模擬預測了該化合物與 MtSK 兩種可能的結(jié)合模式，6-環(huán)己酰胺部分占據(jù)莽草酸結(jié)合位點，而在另一個位置則與共結(jié)晶的 ADP 重疊。此外，manzamine 可抑制GSK-3β 的活性，并且無細胞毒性。GSK-3β 所調(diào)控的通路與結(jié)核分枝桿菌逃逸機體免疫相關，因此這類化合物有望用于進一步的研究，從而開發(fā)出針對結(jié)核分枝桿菌病原體的新候選藥物，對于 6-cyclohexamidomanzamine A 尤其如此。

Ilimaquinone（IQ）是分離自紅海海綿的萜烯醌類化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等多種生物學活性。Simithy 等[39]發(fā)現(xiàn) IQ 能夠抑制 MtSK 的活性，并呈濃度和時間依賴性，表觀速率常數(shù) Kobs 呈線性增加。在酶反應體系中加入預先孵育的 IQ 與 MtSK，結(jié)果發(fā)現(xiàn)比后加入IQ 產(chǎn)生的抑制率要高，這一結(jié)果說明 IQ 所引起的酶抑制活性應該是緩慢的一步且不可逆失活，二階速率常數(shù)（kinact）大約是 60 L/(mol·s)。完整的 MtSK 的質(zhì)譜驗證支持 IQ 與MtSK 結(jié)合的 Michael 加成機制，而蘇氨酸和絲氨酸殘基是 IQ 依賴衍生化的主要靶點，包括 S77、T111 和 S44。IQ 也能衍生和滅活乳酸脫氫酶，但是不能結(jié)合丙酮酸激酶（PK）或結(jié)核分枝桿菌 KatG（MtKatG），因為四種酶都有大量的絲氨酸和蘇氨酸殘基，但是 IQ 的抑制活性卻并不相同，IQ 對 MtSK 的抑制也沒有十分的特異性，說明 IQ 也具有其他的作用靶位，這限制了 IQ 作為特定靶標抗菌藥物先導化合物的應用。

Sutherlandia frutescens 是南非傳統(tǒng)的中草藥，可用于結(jié)核病的治療。Masoko 等[40]從中提取的多個組分具有抗結(jié)核活性和 MtSK 抑制活性，其中純化后得到的 α-亞麻酸具有更強的 MtSK 抑制活性，IC50為 0.1 μg/ml。

3 展望

MtSK 蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析使得虛擬篩選成為可能，最初的抑制劑多是通過此方法得到。雖然虛擬篩選得到的化合物多未有后續(xù)的酶活性和抗結(jié)核活性的報道，提示這種篩選方法的局限性，但是在虛擬篩選研究中，對 MtSK 催化過程中的構(gòu)象變化、活性位點和關鍵氨基酸有了更為深刻的認識，為基于結(jié)構(gòu)的抑制劑的設計奠定了基礎，隨著計算機虛擬對接技術的發(fā)展，針對特定位點的化合物的設計將會推動MtSK 抑制劑的發(fā)現(xiàn)。

因為酶活性方法的建立，基于酶活性的抑制劑的篩選近幾年來多有報道，已有的抗結(jié)核活性的化合物也發(fā)現(xiàn)具有MtSK 抑制活性。但是不管是 LC-MS 的方法，還是基于ADP 或 ATP 檢測的方法，因為檢測儀器或者檢測過程的繁瑣，很難真正實現(xiàn)高通量篩選，而僅僅是配合表型篩選進行的小范圍篩選，因此改進酶活檢測方法對于實現(xiàn)高通量的MtSK 抑制劑篩選十分重要。

總之，目前發(fā)現(xiàn)的多個 MtSK 抑制劑具有抗結(jié)核活性，并且多個具有抗結(jié)核活性的化合物的抗結(jié)核機制也與MtSK 抑制相關，這些研究證明 MtSK 作為藥物發(fā)現(xiàn)靶標依然具有良好的前景；目前尚未有 MtSK 抑制劑應用于臨床研究，針對該靶標的先導化合物也不容易產(chǎn)生交叉耐藥，因此進一步研究 MtSK 抑制劑的高通量篩選方法，進而發(fā)現(xiàn)具有抗結(jié)核活性的先導化合物依然具有重要的意義。