紫外誘變和抗性篩選選育那西肽高產(chǎn)菌株

梁景樂，張善飛，李子勇，李云飛，陳寧

那西肽是活躍鏈霉菌（streptomyces actuosus）產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，與硫鏈絲菌素（thiostrepton）、鹽屋霉素（siomycin）及硫肽霉素（thiopeptin）等抗生素結(jié)構(gòu)相似，均屬于含硫多肽類抗生素[1]。那西肽最先于 20 世紀(jì) 60年代發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在作為一種畜禽專用的抗生素在多個(gè)國家允許使用。盡管我國于 2019年頒布文件，禁止該抗生素長期添加于飼料中用于畜禽促生長，但是由于該類抗生素結(jié)構(gòu)的特異性，對(duì)這類抗生素的工藝研究工作仍是方興未艾[2]。

目前工業(yè)化生產(chǎn)的那西肽菌株主要通過誘變育種獲得[3]。李依韋等[4]利用紫外誘變與化學(xué)誘變得到產(chǎn)量提高16.65% 的高產(chǎn)菌株。秦艷飛等[5]通過紫外-氯化鋰誘變并結(jié)合氨基酸抗性篩選得到高產(chǎn)菌株，產(chǎn)量提高 72.5%。公維亮等[6]通過等離子（ARTP）誘變與雙親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出效價(jià)提高 15% 的那西肽高產(chǎn)菌株。隨著生物技術(shù)的發(fā)展成熟，基因工程技術(shù)也被應(yīng)用于菌種選育，但由于其對(duì)技術(shù)和設(shè)備要求比較高，過程復(fù)雜，費(fèi)用較大，且成功率較低，誘變育種仍是工業(yè)菌種選育最為有效的手段[7]。本文采用紫外誘變和鏈霉素抗性篩選對(duì)本菌種中心保存的一株工業(yè)化生產(chǎn)用那西肽生產(chǎn)菌進(jìn)行處理，獲得了那西肽產(chǎn)量明顯提高的正突變的菌株，并對(duì)這些菌株的發(fā)酵能力和穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，為那西肽菌種的工業(yè)化生產(chǎn)能力的提高奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 那西肽產(chǎn)生菌：活躍鏈霉菌streptomyces actuosusSL201905010，由山東勝利生物工程有限公司菌種中心保存于-80 ℃ 冰箱甘油管中。

1.1.2 主要試劑和儀器 酵母浸出粉購自國藥集團(tuán)有限公司；硫酸鏈霉素購自美國 Sigma 公司。紫外線誘變箱購自濟(jì)南杰康凈化設(shè)備廠；封閉式搖床和培養(yǎng)箱均購自上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；低速離心機(jī)購自湘儀離心機(jī)儀器有限公司；e2695 高效液相色譜分析儀購自美國 Waters 公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 基礎(chǔ)斜面培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉 20，KNO31，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，瓊脂 20，pH = 7.5。種子瓶培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 30，玉米漿 20，酵母浸出粉 10，黃豆餅粉 10，MgSO4·7H2O 0.5，(NH4)2SO45，輕質(zhì)碳酸鈣 5，pH 7.5。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉 50，葡萄糖 20，玉米漿 20，酵母粉 10，黃豆粉 10，MgSO4·7H2O 0.5，(NH4)2SO45，KNO30.5，輕質(zhì)碳酸鈣 3，pH 7.5。單菌和斜面培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度 27.5～28.5 ℃，相對(duì)濕度為 40%～60%，培養(yǎng)周期 168 h，待孢子成熟后保存?zhèn)溆?。種子瓶培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度 27.5～28.5 ℃，相對(duì)濕度為 40%～60%，搖床轉(zhuǎn)速 220 r/min，搖床振幅 5 cm，培養(yǎng)周期 48～60 h，待種子液生長外觀黏稠時(shí)可以接種發(fā)酵瓶。發(fā)酵瓶培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度 27.5～28.5 ℃，相對(duì)濕度為 40%～60%，搖床轉(zhuǎn)速 220 r/min，搖床振幅 5 cm，培養(yǎng)周期 240 h 后放瓶檢測(cè)效價(jià)。

1.2 方法

1.2.1 單孢子懸液的制備 向培養(yǎng)好的孢子斜面中加入10 ml 無菌生理鹽水，用接種環(huán)將孢子輕輕刮下，將其轉(zhuǎn)移至含有玻璃珠的大試管中，振蕩均勻打散孢子，經(jīng)脫脂棉過濾得到單孢子溶液，稀釋至 106～107個(gè)/ml 備用。

1.2.2 紫外誘變致死曲線的繪制 取 1.2.1 制備的單孢子溶液進(jìn)行紫外誘變，紫外燈功率 15 W，照射波長 254 nm，照射距離 30 cm，照射時(shí)間分別設(shè)為 0、15、30、45、60、75、90、105、120 s。誘變后的單孢子溶液經(jīng)生理鹽水適當(dāng)稀釋后，取 0.1 ml 涂布于基礎(chǔ)斜面培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng)168 h 后，計(jì)算單菌落數(shù)，并計(jì)算致死率。致死率（%）=（誘變前平板菌落數(shù)-誘變后平板菌落數(shù)）/誘變前平板菌落數(shù)×100%。

1.2.3 鏈霉素最低抑制濃度的測(cè)定 將適當(dāng)稀釋后的孢子懸液分別涂布在含有不同濃度鏈霉素（2、3、4、5 和10 μg/ml）的斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 168 h，計(jì)算單菌數(shù)，確定未長菌落的平板的鏈霉素濃度，即為鏈霉素最低抑制濃度。

1.2.4 紫外誘變和抗性篩選 根據(jù)致死率曲線，選擇合適的照射條件，對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理；然后將處理后的單孢子溶液涂布于含有 5 μg/ml 鏈霉素的斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 168 h，篩選抗生素抗性突變株。

1.2.5 抗性突變菌株的培養(yǎng) 將篩選出的抗生物抗性突變株用接種環(huán)挑至基礎(chǔ)配方斜面中，培養(yǎng)成熟后，用接種鏟挑取 2～3 cm2生長好的孢子斜面至種子瓶中，培養(yǎng)好后按照10% 接種量轉(zhuǎn)至發(fā)酵瓶中，每組單菌做三個(gè)發(fā)酵平行，取平均值，同時(shí)以出發(fā)菌株作為對(duì)照，培養(yǎng) 240 h。

1.2.6 那西肽含量 HPLC 分析 取那西肽發(fā)酵液 1 ml加入 9 ml 丙酮，超聲提取 30 min 后，離心去除沉淀，取上清液用流動(dòng)相稀釋至 10 ml 后，使用高效液相色譜法[8]測(cè)定效價(jià)。

1.2.7 遺傳穩(wěn)定性考察 首先對(duì)獲得的高產(chǎn)菌株（第一代）進(jìn)行平板傳代培養(yǎng)，考察 1～5 代搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)那西肽產(chǎn)量，同時(shí)對(duì)其成熟斜面不同保存時(shí)間進(jìn)行搖瓶驗(yàn)證那西肽產(chǎn)量。

2 結(jié)果

2.1 紫外誘變致死曲線的繪制

根據(jù) 1.2.2 的方法進(jìn)行誘變，以照射時(shí)間為變量，測(cè)定紫外誘變致死曲線。如圖1 所示，照射時(shí)間與菌株SL201905010 的致死率之間有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著紫外照射時(shí)間的不斷延長，致死率不斷上升。當(dāng)照射時(shí)間達(dá)到 90 s 時(shí)，致死率達(dá)到 93.5%，照射時(shí)間 105 s 的致死率接近 100%。致死率在 90% 左右時(shí)正突變率較高，故本實(shí)驗(yàn)選擇照射時(shí)間 90 s 進(jìn)行紫外誘變。

圖1 紫外誘變致死曲線

2.2 鏈霉素最低抑制濃度的測(cè)定

由表1 可知，隨著鏈霉素濃度的增加，單菌生長速度明顯滯后，單菌數(shù)量逐漸減少，孢子豐滿程度降低，當(dāng)平板（稀釋倍數(shù) 10-5）中鏈霉素濃度達(dá)到 5 μg/ml，平板上就沒有單菌生長，因此鏈霉素對(duì)那西肽生產(chǎn)菌的最低抑制濃度為5 μg/ml，故本實(shí)驗(yàn)選擇平板鏈霉素濃度 5 μg/ml 進(jìn)行抗性篩選。

表1 鏈霉素濃度對(duì)單菌落的影響

2.3 紫外誘變和抗性篩選

將孢子懸液經(jīng)紫外誘變（90 s）后，稀釋倍數(shù)至 10-4、10-5、10-6，涂布于鏈霉素抗性篩選平板，避光培養(yǎng)成熟后，共計(jì)分離 205 株抗性菌株，通過初篩得到 18 株產(chǎn)量較高的菌株，然后對(duì)這 18 株菌株進(jìn)行復(fù)篩得到 6 株產(chǎn)量較高的菌株，結(jié)果見表2。

表2 紫外誘變抗性篩選高產(chǎn)突變株復(fù)篩結(jié)果

2.4 突變株穩(wěn)定性考察結(jié)果

取復(fù)篩中產(chǎn)量較高的三株（US19-46、US19-57 和US19-181）在基礎(chǔ)斜面上連續(xù)傳代 5 次進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)。由表3 可知三株突變株隨著傳代次數(shù)的增加，效價(jià)呈下降趨勢(shì)，但幅度不大，穩(wěn)定性相對(duì)較好，其中 US19-57穩(wěn)定性最好。

表3 突變菌株傳代次數(shù)穩(wěn)定性分析

由表3 可知，變異系數(shù)可表示其變異程度的大小，三株突變菌株中 US19-46、US19-57 和 US19-181 的變異系數(shù)分別為 9.4%、2.1% 和 4.5%，其中 US19-57 的變異系數(shù)最小，傳代穩(wěn)定性好。US19-46 效價(jià)最高，但是穩(wěn)定性較差，所以選擇 US19-57 進(jìn)行保藏試驗(yàn)。將培養(yǎng)好的US19-57 斜面放置于 4 ℃ 冰箱保藏，測(cè)定不同保藏時(shí)間的發(fā)酵效價(jià)。由表4 可知，以新鮮成熟斜面作為對(duì)照，保藏于 4 ℃ 冰箱，3 個(gè)月內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。另外根據(jù)其單菌形態(tài)和斜面孢子豐滿程度均較好，綜合認(rèn)為該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

表4 突變菌株 US19-57 保藏時(shí)間穩(wěn)定性分析

3 討論

抗生素是一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，合成的機(jī)制非常復(fù)雜，涉及到初級(jí)代謝和次級(jí)代謝多種酶系進(jìn)行調(diào)控。那西肽是一類可以從鏈霉菌中產(chǎn)生的包含多個(gè)噻唑環(huán)的硫多肽類抗生素，屬于活性很強(qiáng)的硫鏈絲菌類抗生素[9]。鏈霉菌通過合成抗生素基因表達(dá)分析并表達(dá)自身抗性[10]。有大量報(bào)道稱抗生素抗性基因可能與抗生素結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因存在著一定的聯(lián)系[11]，抗生素產(chǎn)生菌中的抗性基因與抗生素合成的結(jié)構(gòu)基因緊密連鎖，可發(fā)生共突變，即抗性突變總是伴隨著產(chǎn)量突變[12]。還有研究表明，向微生物核糖體或 RNA 聚合酶中引入特定的突變有助于其次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高。這些特定的突變往往導(dǎo)致菌株對(duì)一些抗生素產(chǎn)生抗性，因此可以以抗性突變?yōu)橹羔樈⒂N方法[13]。這些均從理論上支持了該選育方法的可行性。本次菌種選育過程中，利用紫外誘變和鏈霉素抗性篩選育種法，克服了篩選的盲目性和不定向性，大大減少了篩選的工作量，提高了菌種的選育效率，篩選出了一株遺傳穩(wěn)定性較好的高產(chǎn)菌株，那西肽產(chǎn)量提高33.5%。因此本篩選模型也可對(duì)其他鏈霉素育種有一定的借鑒意義。對(duì)于誘變使那西肽產(chǎn)量提高的具體原因還不是很清楚，還需要進(jìn)一步的研究，另外在選育過程中建立高通量的篩選方法，從大量的突變體中篩選出來正突變體也是下一步的研究方向。通過對(duì)活躍鏈霉菌streptomyces actuosusSL201905010 進(jìn)行紫外誘變和鏈霉素抗性篩選進(jìn)行復(fù)合育種，成功選育出一株穩(wěn)定性較好的高產(chǎn)菌株 US19-57。該菌株搖瓶發(fā)酵那西肽產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高 33.5%，傳代 5代變異系數(shù) 2.1%，對(duì)那西肽的工業(yè)化生產(chǎn)具有重大意義，表明該育種方法是獲得那西肽高產(chǎn)菌株的有效途徑。