龜齡集延緩果蠅衰老的作用研究

段麗娟,范慧君,邢 婕,張愛榮,高曉霞,秦雪梅*

(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;3山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國藥有限公司;*通訊作者,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)

龜齡集是我國補(bǔ)腎填精、壯陽培本的傳統(tǒng)古方,其處方復(fù)雜獨(dú)特,由二十八味中藥組成,涵括了動(dòng)物藥、植物藥和礦物藥,其功能主治為強(qiáng)身補(bǔ)腦,固腎補(bǔ)氣,增進(jìn)食欲,用于腎虧陽弱,記憶減退,夜夢(mèng)遺精,腰酸腿軟,氣虛咳嗽,五更溏瀉,食欲不振[1]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)多集中在治療少精癥、勃起障礙、腎陽虛等男性疾病[2-5]。

在《中國長壽大辭典》中,龜齡集列益壽強(qiáng)身內(nèi)服藥之首[6],也是著名的抗衰老處方[7],具有延緩衰老的作用[8],已有研究表明龜齡集可改善大鼠衰老引起的記憶障礙作用[9]。也有研究報(bào)道龜齡集可顯著延長雌雄蠶蛾的壽命[10],然而家蠶與哺乳動(dòng)物差異較大,且對(duì)龜齡集的用藥方法、用藥劑量未詳細(xì)考察。目前,龜齡集的臨床使用劑量、服用療程及受眾年齡等多始于歷史傳承,但由于實(shí)驗(yàn)周期長等客觀因素,其發(fā)揮延年益壽的作用的研究報(bào)道較少。

壽命是抗衰老作用研究中最直觀、最重要的指標(biāo),壽命實(shí)驗(yàn)(生存實(shí)驗(yàn))是衡量生命衰老規(guī)律和抗衰老效果的方法。果蠅遺傳學(xué)知識(shí)背景深厚并且具有壽命短的優(yōu)勢(shì),且果蠅具有與人類75%同源疾病相關(guān)基因,為生物實(shí)驗(yàn)的理想材料,現(xiàn)果蠅的生存實(shí)驗(yàn)已被作為延緩衰老作用的檢驗(yàn)方法之一[11-14]。

本研究使用果蠅生物模型,考察篩選給藥劑量和時(shí)長及給藥方式,最終確定龜齡集延長果蠅壽命的最佳方法,為龜齡集臨床更合理科學(xué)用藥提供參考。本研究采用逆重力爬行實(shí)驗(yàn)及抗冷應(yīng)激實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)龜齡集的抗衰老活性,為龜齡集的抗衰老作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

果蠅品系:W1118系白眼黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所提供,在25 ℃、75%相對(duì)濕度,光照周期為12 h的恒溫恒濕環(huán)境中培養(yǎng)。將CO2氣體通入果蠅培養(yǎng)瓶中將其致暈,放在通有CO2的脫脂棉上,分取雄性并收集。

1.2 試劑及儀器

龜齡集(批號(hào):20130201,規(guī)格:0.3 g/粒),由山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國藥有限公司提供,實(shí)驗(yàn)時(shí)藥物均合格。

電子天平(型號(hào):FA2004,上海良平儀器儀表有限公司);人工氣候箱(型號(hào):MGC-HP,上海一恒科技有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器(型號(hào):LDZX-30KBS,上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.3 培養(yǎng)基的配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制:參考文獻(xiàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制方法[15],將培養(yǎng)基趁熱裝入洗凈滅菌的指管(高9.4 cm,內(nèi)徑2.6 cm)中,每管加入約5 ml,于干燥實(shí)驗(yàn)室自然晾干后室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

龜齡集培養(yǎng)基的配制:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基里加入龜齡集藥粉,充分?jǐn)嚢?制成0.5,1,2,4,8 mg/ml龜齡集培養(yǎng)基。

1.4 果蠅壽命實(shí)驗(yàn)

1.4.1 不同劑量龜齡集對(duì)果蠅壽命的影響 參考文獻(xiàn)[16]方法,收集3 d內(nèi)羽化的雄性果蠅,使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)至30日齡時(shí)隨機(jī)分組,即對(duì)照組和龜齡集組(含藥劑量分別為0.5,1,2,4,8 mg/ml),果蠅30日齡時(shí)開始給藥,直至果蠅自然衰老死亡。每組約200只,隔3 d為果蠅更換1次新鮮培養(yǎng)基,每日記錄果蠅死亡狀況直至全部死亡,意外死亡果蠅不作統(tǒng)計(jì)。每組果蠅的平均存活天數(shù)計(jì)為平均壽命,每組最后剩余10%果蠅的存活天數(shù)算術(shù)平均數(shù)計(jì)為最高壽命。

1.4.2 不同給藥方式對(duì)果蠅壽命的影響 收集3 d內(nèi)羽化的雄性果蠅,使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)至30日齡時(shí)隨機(jī)分為對(duì)照組和龜齡集組(4 mg/ml)。將龜齡集給藥時(shí)長設(shè)置為15 d,設(shè)計(jì)兩種給藥方式,分別為連續(xù)給藥15 d后停藥和間隔1 d給藥,每組130只左右。分別用基礎(chǔ)培養(yǎng)基及龜齡集培養(yǎng)基喂養(yǎng),每天記錄果蠅死亡狀況,直至全部死亡,意外死亡果蠅不作統(tǒng)計(jì)。

1.5 逆重力爬行實(shí)驗(yàn)

收集3 d內(nèi)羽化的雄性果蠅,使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)至30日齡時(shí)隨機(jī)分為對(duì)照組和龜齡集組,每組果蠅約100只。對(duì)照組使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼喂,龜齡集組使用4 mg/ml的龜齡集培養(yǎng)基飼喂至40日齡時(shí),將果蠅轉(zhuǎn)入高9.4 cm,內(nèi)徑2.6 cm的空管中,其中塑料管共分為4段,每段2 cm。將待測(cè)果蠅平均裝入測(cè)定管中,饑餓2 h后輕晃管,使果蠅置于底部。統(tǒng)計(jì)30 s后爬行距離大于4 cm的果蠅數(shù)量(A),計(jì)算攀附指數(shù)(climbing index,CI)=A/總數(shù)[17]。分別測(cè)定兩組果蠅30日齡和40日齡時(shí)的攀附指數(shù),并計(jì)算兩組果蠅不同年齡下的攀附指數(shù)提高率,每組果蠅分別測(cè)定3次,每次間隔20 min。

1.6 抗冷應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

收集3 d內(nèi)羽化的雄性果蠅,使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)至30日齡時(shí)隨機(jī)分為對(duì)照組和龜齡集組,每組果蠅約100只。對(duì)照組與龜齡集組分別使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基和膳食中添加4 mg/ml的龜齡集培養(yǎng)基飼喂至40日齡時(shí),將果蠅轉(zhuǎn)移至室溫下放置的空管中進(jìn)行爬行實(shí)驗(yàn),統(tǒng)計(jì)30 s后爬行距離大于4 cm的果蠅數(shù)量,記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算攀附指數(shù)。將果蠅迅速轉(zhuǎn)移至碎冰上冷刺激10 s后,立即輕晃管進(jìn)行爬行能力測(cè)定,爬行30 s后記錄爬行距離大于4 cm的果蠅數(shù)量并計(jì)算攀附指數(shù)。計(jì)算兩組果蠅冷刺激環(huán)境下較常溫環(huán)境中攀附指數(shù)的提高率,每組果蠅分別測(cè)定3次,每次實(shí)驗(yàn)間隔20 min。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 龜齡集對(duì)果蠅壽命的影響

2.1.1 不同劑量龜齡集對(duì)果蠅壽命的影響 不同劑量龜齡集對(duì)果蠅壽命的影響結(jié)果見圖1。在果蠅30-45日齡段,0.5,4,8 mg/ml龜齡集組曲線高于對(duì)照組,其他實(shí)驗(yàn)組曲線與對(duì)照組曲線幾近重疊。而在果蠅壽命后期,各劑量組的存活率均低于對(duì)照組。推測(cè)龜齡集給藥時(shí)間不宜過長，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)將龜齡集給藥時(shí)長定為15 d。

圖1 龜齡集各劑量組與對(duì)照組生存曲線Figure 1 Lifespan curves of male Drosophila melanogaster between different Guilingji dose groups and control group

與對(duì)照組相比,0.5,4,8 mg/ml龜齡集組果蠅的平均壽命與中位壽命可不同程度地延長(見表1)。4 mg/ml龜齡集組果蠅的平均壽命和中值壽命較對(duì)照組分別延長了1.97%和4.44%,但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4 mg/ml龜齡集劑量組平均壽命和中值壽命的延長率大于0.5,8 mg/ml組,故4 mg/ml為最佳劑量,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用此劑量。

2.1.2 不同給藥方式對(duì)果蠅壽命的影響 不同給藥方式對(duì)果蠅壽命影響結(jié)果見表2,圖2。與對(duì)照組相比,采用連續(xù)給藥方式的龜齡集組果蠅存活率得到顯著提高(見圖2A)。果蠅的平均壽命、中位壽命、最高壽命較對(duì)照組分別延長了16.0%,17.0%,7.7%,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見表2)。與對(duì)照組相比,采用間隔給藥方式的龜齡集組果蠅存活率出現(xiàn)先高后低的趨勢(shì)(見圖2B)。龜齡集組較對(duì)照組可分別延長果蠅的平均壽命5.0%(P<0.01),延長中位壽命4.3%(P<0.05),而最高壽命無改善(見表2)。

表1 龜齡集不同劑量對(duì)果蠅壽命的影響

表2 龜齡集不同給藥方式對(duì)果蠅壽命的影響

A.龜齡集連續(xù)15 d給藥 B.龜齡集間隔1 d給藥圖2 龜齡集不同給藥方式果蠅生存曲線的比較Figure 2 Lifespan curves of male Drosophila melanogaster after Guilingji administration with different methods

2.2 龜齡集對(duì)果蠅爬行能力的影響

與對(duì)照組相比，龜齡集組30日齡和40日齡果蠅的攀爬能力無明顯提高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表3)。尚不能證明龜齡集給藥15 d對(duì)果蠅攀爬能力有影響。

2.3 龜齡集對(duì)果蠅冷應(yīng)激能力的影響

龜齡集對(duì)40日齡果蠅冷應(yīng)激能力的影響結(jié)果見表4。對(duì)照組與龜齡集組在常溫下攀附指數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩組果蠅常溫環(huán)境下的攀爬能力相當(dāng)。與對(duì)照組相比，龜齡集組在冷刺激下果蠅的攀附指數(shù)明顯提高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明龜齡集可提高果蠅的抗冷應(yīng)激能力。

表3 龜齡集對(duì)果蠅爬行能力的影響

表4 龜齡集對(duì)果蠅冷應(yīng)激能力的影響

3 討論

龜齡集組方依據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“天人合一”、“陰陽五行”的整體觀念,包含了植物藥(紅參、天冬、杜仲等)、動(dòng)物藥(鹿茸、海馬、雀腦等)和礦物藥(大青鹽、石燕等)。龜齡集作為藥品,臨床上按照療程用藥。而作為養(yǎng)生名方,采用四季養(yǎng)生服用法,即“四立二分二至法”,立春、立夏、立秋、立冬、春分、秋分、夏至、冬至,每個(gè)節(jié)氣按照劑量連服15 d,或二至(夏至、冬至)每個(gè)節(jié)氣按照劑量連服45 d。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不能考察時(shí)令因素對(duì)藥效的影響,但可以通過考察合適的給藥方法來評(píng)估龜齡集藥效。

龜齡集在臨床應(yīng)用時(shí)多為男性用藥,同時(shí)為避免雌性果蠅生殖等其他因素的影響,故本研究選取雄性果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本研究結(jié)合臨床,采用果蠅自然衰老模型,考察了不同的給藥劑量和給藥方式2種條件,最終得到了于果蠅模型適合的給藥方法。

3.1 果蠅模型的優(yōu)勢(shì)與給藥劑量的篩選

果蠅作為常用的衰老模式生物之一,具有生命周期短而繁殖快,飼養(yǎng)方便且諸多代謝途徑、生理功能類似于哺乳動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)。然而目前果蠅并未像大鼠、兔子等動(dòng)物一樣與人類之間有科學(xué)的藥物劑量換算標(biāo)準(zhǔn),故給藥劑量需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選確定。前期實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了0.04,0.2,1 mg/ml三個(gè)劑量組,生存曲線結(jié)果未觀察到明顯變化。根據(jù)此結(jié)果,將給藥劑量設(shè)計(jì)為0.5,1,2,4,8 mg/ml。結(jié)果顯示,0.5,4,8 mg/ml劑量可改善果蠅壽命情況,但考慮到0.5 mg/ml劑量較小,藥效發(fā)揮可能不太穩(wěn)定,而4 mg/ml和8 mg/ml兩個(gè)劑量顯示出劑量依賴性趨勢(shì),其中,4 mg/ml劑量組還可明顯提高果蠅的平均壽命和中位生存時(shí)間,故采用4 mg/ml進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

3.2 給藥時(shí)長的選擇

本課題組前期對(duì)果蠅進(jìn)行代謝組學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，果蠅在壽命為30日齡時(shí)屬于中年階段，30日齡果蠅已經(jīng)開始步入衰老[16]。故選擇從30日齡開始給藥，這也與龜齡集在臨床使用中一般為中老年用藥的經(jīng)驗(yàn)一致。

在劑量篩選實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)龜齡集可提高果蠅30-45日齡的存活率，推測(cè)龜齡集給藥時(shí)長不宜過長。因此，將給藥時(shí)長設(shè)置為15 d。

3.3 給藥方式的考察

中華民族在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下,形成了一套完整的養(yǎng)生體系。二十四節(jié)氣反映了大自然的氣候變化,中醫(yī)學(xué)將二十四節(jié)氣與陰陽學(xué)說相結(jié)合,以陰陽相衡為原則,在四立二分二至?xí)r服用養(yǎng)生補(bǔ)健方以達(dá)到延年益壽、滋心肺潤五臟的目的?？紤]到臨床實(shí)際使用的“四時(shí)養(yǎng)生”服用法,實(shí)驗(yàn)中還比較了隔天給藥的給藥法,但其延長壽命結(jié)果不明顯。推測(cè)由于果蠅壽命周期過短,尚不能模擬人類機(jī)體隨節(jié)氣更迭而產(chǎn)生的變化,故不能體現(xiàn)中醫(yī)按照節(jié)令給藥的科學(xué)性。

3.4 爬行實(shí)驗(yàn)與冷應(yīng)激實(shí)驗(yàn)的作用

機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力和冷應(yīng)激能力是衰老的兩個(gè)指標(biāo)，本研究采用攀附指數(shù)評(píng)價(jià)龜齡集對(duì)果蠅機(jī)能的影響。龜齡集對(duì)40日齡果蠅的運(yùn)動(dòng)能力無明顯提高作用，推測(cè)可能果蠅在40日齡時(shí)由于機(jī)體的衰老，龜齡集只能有限地提高果蠅的運(yùn)動(dòng)能力。而且本研究還通過測(cè)定40日齡果蠅在冷刺激下的攀附指數(shù)評(píng)價(jià)龜齡集對(duì)果蠅抗冷應(yīng)激能力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明龜齡集可提高果蠅的抗冷應(yīng)激能力。

綜上所述,龜齡集可延長果蠅壽命,龜齡集的最佳給藥方式為在果蠅30日齡時(shí)給藥,連續(xù)15 d后停藥。龜齡集可改善果蠅抗冷應(yīng)激能力,龜齡集確實(shí)具有延緩衰老藥效。在后期研究中可采集各年齡段的生物樣本使用代謝組學(xué)技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等新技術(shù),增加抗氧化酶活力的測(cè)定等其他指標(biāo)輔助驗(yàn)證龜齡集延緩衰老的作用,進(jìn)一步探討龜齡集抗衰老機(jī)制。