從免疫失衡研究補(bǔ)陽還五湯干預(yù)膿毒癥大鼠心肌損傷的機(jī)制

吳 暉，邵 丹，梁志奇，吳 丹

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州350004）

膿毒癥全球發(fā)病率約29.5%并呈上升趨勢(shì)［1］，每年大約530萬例患者死于嚴(yán)重膿毒癥［2］。心臟是膿毒癥最常受累的臟器之一，合并心肌損傷可加重膿毒癥病程進(jìn)展，增加臟器衰竭和死亡風(fēng)險(xiǎn)［3］。前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯能改善膿毒癥患者免疫抑制狀態(tài)，減輕膿毒癥患者心肌損傷［4］，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究旨在從免疫失衡及炎癥損傷角度觀察補(bǔ)陽還五湯對(duì)膿毒癥大鼠心肌損傷的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量（350±30）g，購(gòu)自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 補(bǔ)陽還五湯組成：黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，赤芍5 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g，地龍3 g，由閩候上街致誠(chéng)醫(yī)藥商店提供，濃煎成含原生藥1 g／mL，過濾除菌分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；大鼠CD4、IL-4、IFN-γ抗體（美國(guó)Biolegend公司）；白細(xì)胞刺激劑、細(xì)胞分離液、磷酸鹽緩沖液（美國(guó)BD Pharmingen公司）；PMA工作液（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素4（IL-4）、白細(xì)胞介素10（IL-10）、肌 鈣 蛋 白I（cTnI）、腦 尿 肽（BNP）ELISA檢測(cè)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；倒置顯微鏡（日本NIKON公司）；移液器（德國(guó)eppendorf公司）；B320A離心機(jī)（中國(guó)白洋）；流式細(xì)胞儀（FACSCalbur）；酶 標(biāo) 儀（美 國(guó) 伯 樂 公 司）；DHG-9091A干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal，ligation and puncture，CLP）［5］制作膿毒癥大鼠模型。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。以10%水合氯醛（0.35 mL／100 g）腹腔注射麻醉后固定，沿腹正中線作約3 cm切口，暴露盲腸并拉出體外，用4號(hào)絲線在盲腸中段結(jié)扎，然后用18 G針頭在結(jié)扎部位與盲腸末端的中段對(duì)穿兩孔，擠出少量腸內(nèi)容物確保穿孔是開放的，然后將盲腸還納腹腔后逐層關(guān)腹，術(shù)畢在腹腔注射生理鹽水3 mL／100 g抗休克，待麻醉清醒后可自由活動(dòng)、進(jìn)食及飲水。假手術(shù)組打開腹腔輕輕翻動(dòng)盲腸后縫合腹壁切口，盲腸不作穿刺。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為模型組、假手術(shù)組、治療組、防治組各30只，再按術(shù)后24、48、72 h再各自分為3個(gè)亞組，每個(gè)亞組各10只。防治組于術(shù)前按1.5 mL／（100 g·d）予補(bǔ)陽還五湯藥液連續(xù)灌胃3 d；治療組和防治組于術(shù)后30 min按1.5 mL／（100 g·d）給予補(bǔ)陽還五湯灌胃；假手術(shù)組和模型組術(shù)后均每日給予等量生理鹽水灌胃，4組術(shù)后均連續(xù)灌胃3 d。

2.2 檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞Th1／Th2亞群 以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血2～3 mL，無菌肝素鈉抗凝采血，分離出CD4＋淋巴細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液漂洗，同時(shí)分別采用IFN-γ、IL-4標(biāo)記Th1淋巴細(xì)胞、Th2淋巴細(xì)胞，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞百分比，計(jì)算其比值，操作嚴(yán)格按照淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒說明書執(zhí)行。

2.3 取材及血清檢測(cè) 各組分別于術(shù)后24、48、72 h隨機(jī)取10只大鼠處死，腹主動(dòng)脈采血2～3 mL，以3 000 r／min離心10 min后取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)外周血TNF-α、IL-4、IL-10、IFN-γ、cTnI、BNP。

2.4 HE染色 術(shù)后72 h處死大鼠后，無菌條件下取心臟，用10%中性甲醛固定心肌組織，制作蠟塊切片，蘇木素－伊紅（HE）染色，光鏡下觀察心肌病理學(xué)改變。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 4組Th1、Th2細(xì)胞及Th1／Th2比較 見表1。

3.2 4組炎癥因子及心功能指標(biāo)比較 見表2。

3.3 HE染色 假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，無明顯的病理改變。模型組大鼠心肌細(xì)胞水腫，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與模型組大鼠相比，治療組及防治組大鼠的心肌細(xì)胞水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。

表1 4組Th1、Th2細(xì)胞及Th1／Th2比較（±s）

表1 4組Th1、Th2細(xì)胞及Th1／Th2比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

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表2 4組炎癥因子及心功能指標(biāo)比較（±s）pg／mL

表2 4組炎癥因子及心功能指標(biāo)比較（±s）pg／mL

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與治療組比較，3）P＜0.05。

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4 討 論

膿毒癥心肌損傷是導(dǎo)致膿毒癥休克及病死率增加的主要原因之一［6］。肌鈣蛋白I（cTnI）是反映心肌損傷高特異度和靈敏度的標(biāo)志物，cTnI升高程度與心肌細(xì)胞損傷程度及病情危重程度正相關(guān)［7］。BNP是由心室分泌的一種多肽類心臟激素，是心力衰竭的重要標(biāo)志物，其水平升高是膿毒癥患者心肌損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［8］。炎癥反應(yīng)是膿毒癥心肌損傷的主要機(jī)制，炎性因子通過直接或間接地?fù)p傷心肌，破壞心肌結(jié)構(gòu)及功能，導(dǎo)致心功能障礙［9］。炎癥反應(yīng)貫穿膿毒癥發(fā)病的始終，促炎／抗炎平衡是影響疾病轉(zhuǎn)歸的重要因素，與機(jī)體免疫狀態(tài)密切相關(guān)。機(jī)體免疫失衡可能是導(dǎo)致膿毒癥迅速惡化進(jìn)展的關(guān)鍵因素［10］。Th1和Th2亞 群 是機(jī)體 調(diào) 節(jié) 促炎／抗炎平衡的重要輔助性T淋巴細(xì)胞，Th1細(xì)胞主要釋放INF-γ、IL-2等因子，參與T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染免疫，抑制感染的發(fā)展。Th2細(xì)胞則主要釋放IL-4、IL-10等因子，增強(qiáng)B細(xì)胞的增殖、分化和抗體的產(chǎn)生，參與B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫，并且與免疫抑制相關(guān)，傾向于使病情惡化。生理狀態(tài)下Th1／Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥患者中存在Th1／Th2失衡，主要表現(xiàn)為Th2方向的漂移，呈現(xiàn)免疫抑制的狀態(tài)，死亡患者Th1／Th2比值顯著低于存活者［11］。Th1／Th2值降低預(yù)示膿毒癥嚴(yán)重程度加大，預(yù)后不良。本研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，膿毒癥模型組cTnI、BNP、Th2及其相關(guān)因子IL-4明顯升高，Th1、Th1／Th2及Th1相關(guān)因子IFN-γ明顯降低，Th1／Th2失衡表現(xiàn)為Th2方向的漂移，同時(shí)具有促炎作用的TNF-α明顯增加，具有抗炎作用的IL-10明顯減少，Th1／Th2失衡可能通過破壞機(jī)體細(xì)胞炎癥因子的平衡，誘發(fā)炎癥瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)［12］，造成心肌損傷。其中TNF-α大量表達(dá)可直接或間接損傷心肌細(xì)胞［13］，其可能通過激活巨噬細(xì)胞，促使其分泌IL-6、IL-8和MIF等促炎因子、脂質(zhì)介質(zhì)、活性氧等，對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致膿毒癥心肌損傷［14］。

正氣虛損是膿毒癥發(fā)生的基本前提，外毒內(nèi)侵，化變內(nèi)毒，入里化熱，煎熬津血，產(chǎn)生熱、痰、瘀等病理產(chǎn)物是膿毒癥病情進(jìn)展的重要因素［15］?！罢龤獠蛔?、毒邪內(nèi)蘊(yùn)、瘀血阻絡(luò)”是膿毒癥心肌抑制的基本病機(jī)［16］。心氣為推動(dòng)血液運(yùn)行的動(dòng)力，氣虛無力行血，則血行緩慢致絡(luò)脈瘀積，血瘀又阻遏氣機(jī)的正常運(yùn)行，因此益氣活血、扶正通絡(luò)是其主要治則。補(bǔ)陽還五湯具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)的功效，是益氣活血的代表方，以大量補(bǔ)氣藥、少量活血藥相配，使氣旺則血行，活血而不傷正，調(diào)整陰陽平衡，恢復(fù)機(jī)體功能。研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可有效改善心衰患者心室收縮功能，降低患者血清TNF-α、IL-6等炎癥細(xì)胞因子的水平［17］，還可減輕膿毒癥大鼠免疫抑制階段淋巴細(xì)胞顯著減少的狀態(tài)，改善膿毒癥大鼠癥狀［18］。補(bǔ)陽還五湯中君藥黃芪的有效成分黃芪甲苷可通過減少膿毒癥大鼠心肌中Beclin1、p62和LC3基因及蛋白的表達(dá)，抑制膿毒癥大鼠心肌自噬，減輕心臟損傷［19］。

本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用補(bǔ)陽還五湯治療膿毒癥大鼠，各時(shí)間點(diǎn)Th2、TNF-α、IL-4、cTnI、BNP均明顯低于模型組，Th1、Th1／Th2、IL-10、IFN-γ均明顯高于模型組。提示補(bǔ)陽還五湯能下調(diào)膿毒癥大鼠Th2表達(dá)，上調(diào)Th1表達(dá)，提高Th1／Th2比值，減少Th1向Th2漂移，改善免疫抑制狀態(tài)，調(diào)節(jié)炎癥因子釋放，上調(diào)IL-10水平，抑制TNF-α表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，使cTnI、BNP水平下降，減輕心臟病理改變，減輕膿毒癥大鼠心肌損傷。