UPLC法測定清達顆粒和清眩降壓湯中黃芩苷的含量

林 珊，陳達鑫，蔡巧燕，張 鈴，陳靜雯，李金艷，彭 軍，褚劍鋒*

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州350122；3.福建中醫(yī)藥大學陳可冀學術(shù)思想傳承工作室，福建 福州350122；4.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州350122；5.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，福建 福州350122）

清眩降壓湯是陳可冀院士多年來用于治療高血壓的臨床經(jīng)驗方，由天麻、鉤藤、黃芩等十多味中藥組成，用于肝陽上亢的高血壓、缺血性腦血管病、眩暈等疾?。?-2］。清達顆粒由清眩降壓湯化裁而來，具有清熱瀉火、平肝潛陽作用，保留原方中黃芩、天麻、鉤藤，增加了具有清心、去熱作用的蓮子心［3］。前期研究發(fā)現(xiàn)，清眩降壓湯和清達顆粒均能降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓和抑制心腎大血管損害［4-6］。而且2個復方均能促進血管舒張，且清達顆粒的舒張作用明顯優(yōu)于清眩降壓湯［7］。為明確其中的主要藥效成分以及確保臨床療效［8］，應(yīng)建立清達顆粒的質(zhì)量控制體系。本文通過超高效液相色譜法測定和比較清達顆粒和清眩降壓湯中指標性成分黃芩苷的含量［9］，初步揭示2個復方控制血壓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為建立清達顆粒質(zhì)量標準和臨床實驗研究提供科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AR2130電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；CP225D電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ-300DB臺式數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 清達顆粒（批號20170309、20170329、20170405，江陰天江藥業(yè)有限公司）；清眩降壓湯顆粒（批號1701301、1701326、1701425，江陰天江藥業(yè)有限公司）；黃芩苷（批號B20570，上海源葉生物科技有限公司），純度大于98.0%；乙腈、甲醇（色譜純，德國MERCK公司），其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱定黃芩苷對照品，加入適量甲醇，溶解成對照品儲備液，其濃度為0.5 mg／mL。精密吸取適量儲備液，加入甲醇稀釋，搖勻，得黃芩苷對照品溶液0.05 mg／mL。

2.1.2 供試品溶液制備 稱取清達顆粒0.1 g和清眩降壓湯0.2 g，分別置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱重；超聲提取20 min，放冷，再稱重，用甲醇補重后，搖勻，取其上清液，0.22μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件的選擇與優(yōu)化

2.2.1 流動相選擇 選擇2組不同流動相系統(tǒng)：乙腈-水和乙腈-0.05%磷酸。取清達顆粒供試品溶液，分別以2種流動相梯度洗脫。結(jié)果表明，當乙腈-水為流動相時，黃芩苷的出峰時間為5.73 min，色譜峰的分離效果不好，分離度小，雜質(zhì)峰多，峰型不理想。采用乙腈-0.05%磷酸時，黃芩苷的出峰時間7.10 min，分離度達到要求，未有雜峰。故選用乙腈-0.05%磷酸。

2.2.2 檢測波長選擇 選擇3個不同的檢測波長220、280和300 nm。280 nm下所得色譜圖的色譜峰分離度較好，雜峰較少。黃芩苷色譜峰紫外吸收較大，響應(yīng)值高，基線較平穩(wěn)，故選用280 nm作為檢測波長。

2.2.3 色譜條件 色譜柱Acclaim UPLC RSLC 120 C18（2.1 mm×100 mm，2.2μm）；流動相乙腈-0.05%磷酸梯度洗脫，梯度程序：0～20 min，2%～80%乙腈；流速0.4 mL／min；柱溫30℃；檢測波長280 nm。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 參照前期研究結(jié)果［9］，取黃芩苷對照品溶液，分別配制0.01、0.02、0.03、0.05、0.07 和0.10 mg／mL進樣，記錄黃芩苷色譜峰的峰面積。標準曲線回歸方程為y＝11 736x＋33.196（r2＝0.999），說明黃芩苷標準品在0.01～0.1 mg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗 取黃芩苷對照品溶液（0.05 mg／mL），進樣量2μL，連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰峰面積，計算黃芩苷的RSD。結(jié)果表明，黃芩苷RSD為0.39%，說明本實驗所建立方法的精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 分別取清達顆粒（批號201703 09）6份和清眩降壓湯（批號1701301）6份，按上述供試品溶液方法制備，進樣量2μL，記錄色譜峰峰面積。實驗結(jié)果所得黃芩苷峰面積RSD分別為2.50%和2.89%，表明該實驗方法重復性好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 分別取清達顆粒（批號201703 09）和清眩降壓湯（批號1701301），按上述供試品溶液方法制備，在0、2、4、6、12和24 h分別進樣2μL，記錄色譜峰峰面積。實驗結(jié)果所得黃芩苷RSD分別為0.69%和0.66%，說明方法的穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 分別取0.1 g清達顆粒和0.2 g清眩降壓湯樣品各9份，按照一定比例（樣品中含有的黃芩苷∶黃芩苷對照品＝1∶0.5、1∶1、1∶2），加入一定量的黃芩苷對照品溶液制備成供試液，每種比例各制備3份。2μL進樣，記錄色譜峰的峰面積，計算回收率。黃芩苷在清達顆粒中的回收率為94.78%，RSD為2.58%，黃芩苷在清眩降壓湯中的回收率為94.56%，RSD為2.16%，說明該樣品回收率良好，結(jié)果見表1和表2。

表1 清達顆粒中含有的黃芩苷的回收率試驗

表2 清眩降壓湯中含有的黃芩苷的回收率試驗

2.3.6 供試品溶液的測定 取清達顆粒（批號20170309、20170329、20170405）和清眩降壓湯（批號1701301、1701326、1701425）各3批次，分別按照上述方法制備供試品溶液，進樣量2μL，記錄色譜峰的峰面積。結(jié)果黃芩苷含量分別為4.35 mg／g和0.83 mg／g，RSD分別為1.30%和2.06%。結(jié)果見表3、表4和圖1。

表3 清達顆粒的黃芩苷含量測定

表4 清眩降壓湯的黃芩苷含量測定

注：A黃芩苷對照品；B清達顆粒；C清眩降壓湯；1黃芩苷。

3 討 論

在前期研究，我們發(fā)現(xiàn)黃芩苷作為清眩降壓湯主要成分之一［9］，其含量較大，色譜峰分離度好，因此選用黃芩苷作為清達顆粒和清眩降壓湯的指標性成分。文獻報道黃芩苷具有抗高血壓的作用［10-11］，2個復方也都具有抗高血壓的藥效作用，并且清達顆粒的藥效要優(yōu)于清眩降壓湯。本研究結(jié)果可見，清達顆粒中黃芩苷的含量明顯高于清眩降壓湯，因此黃芩苷應(yīng)是清達顆粒和清眩降壓湯抗高血壓藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

根據(jù)文獻報道，已采用超高效液相色譜法對復方和黃芩藥材中黃芩苷進行含量分析［12-13］。在色譜條件摸索過程中，對流動相、檢測波長等參數(shù)進行比較，確立最佳色譜條件，在一定時間內(nèi)2個復方中黃芩苷實現(xiàn)良好的分離。以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，黃芩苷分離度較差，因此采用乙腈-0.05%磷酸進行梯度洗脫，結(jié)果黃芩苷色譜峰得到了很好的分離，目標峰突出，周圍雜峰相對較少，有利于復方中黃芩苷的檢測。

本研究方法準確性和重現(xiàn)性好、便于操作，可用于測定清眩降壓湯和清達顆粒中主要成分黃芩苷的含量。建立以黃芩苷為指標性成分的清達顆粒質(zhì)量標準，完善清達顆粒的質(zhì)控體系，為清達顆粒創(chuàng)新中藥的研發(fā)提供實驗數(shù)據(jù)。