玉屏風(fēng)散對肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎轉(zhuǎn)錄因子T-bet／GATA-3表達(dá)的影響

陳 宇，張國慶，曾屹生，許亞樺，蔣雙堤

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州350003）

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又稱過敏性鼻炎，主要是已致敏患者再次接觸過敏原后，由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜超敏反應(yīng)性疾病，可分為常年性和季節(jié)性兩大類，發(fā)病率高，且難以根除［1-3］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，AR在全球范圍內(nèi)患病人數(shù)超過5億，是目前臨床上耳鼻咽喉科常見病之一。基于以往的研究表明，玉屏風(fēng)散對肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎有一定的療效，但其內(nèi)在的分子機(jī)制仍未有深入的研究，故筆者通過觀察玉屏風(fēng)散對肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠IFNγ與IL-4的濃度及GATA-3、T-bet mRNA表達(dá)的影響，試圖為益氣固表法治療變應(yīng)性鼻炎提供基因分子水平的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡SD大鼠，雄性，體質(zhì)量300 g左右，SPF級，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Ⅴ級卵清蛋白、Even Blue（美國Sigma公司，批號：SLBN6684V、MKBQ3656V）；Ⅱ級卵白蛋白、Scott藍(lán)化液、大鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液（北京索萊寶科技有限公司，批號：912E051、G1865、P8630）；生理鹽水（福州辰星藥業(yè)有限公司，批號：1708262705）；氫氧化鋁（廣東西隴化工有限公司，1710270）；艾條（南陽香艾有限公司）；升華硫（天津大茂試劑）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批號：171110）；Trizon Reagent，Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒，CW0581M；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒UltraSYBR Mixture：CWBIO CW0957M（康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）；Rat IL-4、Rat IFN-γELISA檢測試劑盒（武漢酶免生物科技有限公司，批號：MM-0191R2、MM-0198R2）；蘇木素染液、伊紅染色液（武漢博士德生物有限公司，批號：AR11800-1、AR11800-2）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器Neofuge13R臺式冷凍離心機(jī)、HFSafe-1800生物安全柜（美國HeaL Force公司）；T100TM PCR儀（美國Bio-Rad公司）；TU-100C干式恒溫儀（上海一恒科技）；IX51熒光顯微鏡、CKX31顯微鏡（日本Olympus公司）；CFX ConnectTM熒光PCR儀（上海伯樂）；2xGoLdStar Taq MasterMix實(shí)時(shí)定量PCR儀（康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）；-80℃冰箱（山東博科）；XH-C旋渦混合器（常州越新）；干式電加熱器（海門市其林貝爾儀器）；RT-6100酶標(biāo)儀（美國Rayto公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)共分為4組：對照組、AR組、AR＋肺氣虛組、AR＋肺氣虛治療組。AR組以0.3 mg卵清蛋白做抗原，30 mg氫氧化鋁作為佐劑，加1 mL生理鹽水形成混懸液，腹腔注射，隔日1次，共7次，為基礎(chǔ)致敏，再以0.25 mg／mL的卵清蛋白的生理鹽水2 mL超聲霧化吸入，每日1次，連續(xù)3 d，為強(qiáng)化致敏。霧化吸入完后的第2天，行被動(dòng)皮膚過敏（PCA）試驗(yàn)確定OVIgE抗體效價(jià)升高后，用5%卵白蛋白的生理鹽水噴滴雙鼻腔，每側(cè)0.5 mL，每日1次，共7次。AR＋肺氣虛組按AR組方法致敏后再建立肺氣虛證模型：備好特制玻璃煙熏造模箱（體積60 cm×40 cm×40 cm），特制煙熏艾條（長120 mm，內(nèi)含7 g硫磺粉、30 g艾絨），將致敏后的大鼠放入煙熏箱，點(diǎn)燃艾條，煙熏30 min，每天2次，連續(xù)熏煙15 d。AR＋肺氣虛治療組在AR＋肺氣虛組基礎(chǔ)上按4 g／（kg·d）給予玉屏風(fēng)散水煎劑灌胃，上、下午各1次，連續(xù)干預(yù)7 d。對照組注射等量的生理鹽水。

2.2 ELISA法檢測IFN-γ與IL-4表達(dá) 將試劑盒中所有試劑和組分取出恢復(fù)到室溫，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。分別設(shè)空白孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL。每孔加入酶標(biāo)試劑100μL，空白孔除外，用封板膜封板后置37℃溫育60 min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干洗滌，拍干。每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)，450 nm波長測量各孔的OD值。

2.3 QRT-PCR法檢測T-bet、GATA-3 mRNA表達(dá)

將組織樣品用研缽在液氮下研磨至粉末狀，加入對應(yīng)量的TRlzon Reagent，提取總RNA，防止降解。引物序列T-bet F：CCTGGGGTCGTCCTATTCT，R：TCCGTCCTTGCTTAGTGATG；GATA-3 F：AGCCC ACCACCCCATTA，R：GGTTCTGCCCATTCATTTTA；GAPDHF：GCAAGTTCAACGGCACAG，R：CGCCAGT AGACTCCACGAC。反應(yīng)體系：RNase Free d H2O 9.5μL，cDNA／DNA 1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2xULtraSYBR Mixture 12.5μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10 min，變性95℃10 s，退火56℃30 s，延伸72℃30 s，行40次循環(huán)。

2.4 HE染色觀察 取出組織流水沖洗數(shù)小時(shí)，經(jīng)70%、80%、90%乙醇脫水3 min，無水乙醇、二甲苯混合液（等比例混合）浸泡15 min，二甲苯浸泡至透明為止。放入二甲苯和石蠟各半的混合液15 min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50～60 min。石蠟包埋，切片。將石蠟切片進(jìn)行烤片，然后脫蠟，水化。將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，返藍(lán)液返藍(lán)15 s，流水沖洗，伊紅染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，中性樹脂封片，鏡檢。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用多因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 PCA實(shí)驗(yàn) 如圖1所示，被動(dòng)致敏后按1 mL／100 g體質(zhì)量靜脈注射0.2%卵清蛋白（以0.5%伊文思蘭配制）進(jìn)行激發(fā)，測量皮膚內(nèi)層的藍(lán)斑大小。直徑大于5 mm的藍(lán)斑為陽性，如不規(guī)則將長軸與短軸長度的平均值作為直徑?？梢钥吹剿{(lán)斑很明顯，說明致敏成功。

圖1 PCA驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

3.2 HE染色 對照組鼻竇黏膜假復(fù)層纖毛上皮結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，黏膜下層無明顯炎性細(xì)胞浸潤；AR組呈慢性炎癥表現(xiàn)，黏膜上皮排列紊亂，部分區(qū)域壞死脫落；AR＋肺氣虛組呈嚴(yán)重的炎癥表現(xiàn)，黏膜上皮排列紊亂，許多區(qū)域壞死，脫落，炎癥程度重于AR組；AR＋肺氣虛治療組黏膜上皮細(xì)胞修復(fù)較好，炎癥程度輕于AR組和AR＋氣虛組。見圖2。

3.3 4組IFN-γ、IL-4表達(dá)比較 見圖3。

3.4 4組GATA-3、T-Bet mRNA表達(dá)比較 見圖4。

4 討 論

玉屏風(fēng)散是由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)組成的中醫(yī)經(jīng)典方劑，它出自元代名醫(yī)危亦林的《世醫(yī)得效方》，其因具益氣固表之功，臨床多用于治療肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎。對于玉屏風(fēng)散一直有“玉屏組合少而精，芪術(shù)防風(fēng)鼎足行”的說法，方中黃芪益氣固表為君；白術(shù)補(bǔ)氣健脾為臣；佐以防風(fēng)走表而散風(fēng)邪，合黃芪、白術(shù)以益氣祛邪。且黃芪得防風(fēng)，固表而不致留邪；防風(fēng)得黃芪，祛邪而不傷正，有補(bǔ)中寓疏，散中寓補(bǔ)之意。三藥合用共奏益氣固表、扶正祛邪之功。許多現(xiàn)代藥理學(xué)研究亦表明玉屏風(fēng)散能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫。洪敏等［4］發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)散不同提取物能夠抑制IFN-γ、促進(jìn)IL-4分泌，從而影響Th1／Th2細(xì)胞因子水平；許洲斌［5］研究發(fā)現(xiàn)在免疫狀態(tài)下，玉屏風(fēng)散有利于轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3的表達(dá)，從而增強(qiáng)Th1／Th2細(xì)胞亞群的分化，保證了機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的正常水平。

本研究通過建立AR動(dòng)物模型，以卵清蛋白為抗原，腹腔注射致敏2周、超聲霧化強(qiáng)化致敏3 d，建立AR模型。利用PCA反應(yīng)，伊文思蘭顯色，測定皮膚內(nèi)層藍(lán)斑直徑大于5 mm說明AR模型造模成功。在此基礎(chǔ)上再用特制艾條熏蒸的方法建立肺氣虛AR模型。最后通過對各組鼻黏膜HE染色觀察其組織結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示AR組及AR＋肺氣虛組炎癥表現(xiàn)明顯，黏膜上皮細(xì)胞破壞嚴(yán)重，經(jīng)玉屏風(fēng)散治療后炎癥程度減輕，黏膜上皮細(xì)胞修復(fù)良好。

圖2 4組大鼠鼻黏膜組織HE染色圖（×400）

圖3 4組IFN-γ、IL-4表達(dá)比較

圖4 4組GATA-3、T-bet mRNA表達(dá)比較

變應(yīng)性鼻炎是體外環(huán)境因素作用于機(jī)體導(dǎo)致異常免疫反應(yīng)，產(chǎn)生以鼻腔黏膜Th2免疫反應(yīng)為主的變應(yīng)性炎癥反應(yīng)［6］。IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌，與IgE合成、嗜酸細(xì)胞的浸潤和激活密切相關(guān)，參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展［7］。本研究結(jié)果顯示，AR組和AR＋肺氣虛組IL-4濃度較對照組明顯升高，經(jīng)玉屏風(fēng)散治療后明顯降低，提示玉屏風(fēng)散能夠通過抑制IL-4對肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎產(chǎn)生治療作用。

近幾年大量研究表明，GATA-3能促使Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子的釋放，是Th2細(xì)胞的標(biāo)記分子［8］。T-bet是一種Th1及INF-γ特異性的轉(zhuǎn)錄因子，不僅能促使IFN-γ產(chǎn)生，而且能將Th2細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為Th1［9］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)玉屏風(fēng)散治療后轉(zhuǎn)錄因子T-bet表達(dá)明顯增高，而GATA-3表達(dá)明顯降低，表現(xiàn)為抑制Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，促進(jìn)其向Th1分化，糾正了Th1、Th2細(xì)胞因子表達(dá)的免疫失衡，從而對肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎起到治療效果。

綜上所述，變應(yīng)性鼻炎表現(xiàn)為GATA-3表達(dá)增強(qiáng)，T-bet表達(dá)下降，從而導(dǎo)致Th1細(xì)胞分化嚴(yán)重受阻，使機(jī)體處于以Th2為優(yōu)勢免疫應(yīng)答的變態(tài)炎癥反應(yīng)，從而引起變應(yīng)性鼻炎。玉屏風(fēng)散應(yīng)用非常廣泛，具有多重功效，對呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等均有不同程度的療效，究其原因，可能與其治療作用主要體現(xiàn)在對免疫功能的調(diào)節(jié)方面，其藥理作用研究也主要集中在對機(jī)體免疫功能的影響方面［9］。玉屏風(fēng)散通過抑制GATA-3，上調(diào)T-bet，糾正了Th1、Th2細(xì)胞的免疫失衡狀態(tài)，從而起到治療作用。