基于TRPV4通路探討針刀對兔膝骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡的影響

曾維銓，劉 晶，連曉文，林巧璇，盧莉銘，郭澤興，楊金碩，陸潤銘，修忠標，4*

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院，福建 福州350003；2.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建 福州350004；3.福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福建 福州350122；4.中醫(yī)骨傷及運動康復教育部重點實驗室，福建 福州350122）

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是臨床常見骨關節(jié)病，有效延緩軟骨退變進程是臨床防治KOA亟待解決的 難題［1］，調節(jié)骨骼肌功能、恢復膝關節(jié)筋骨平衡是防治KOA有效策略［2］。針刀療法擅長松解慢性損傷肌肉、韌帶粘連、瘢痕和疏通堵塞，具有良好力學調節(jié)作用［3-4］，可有效緩解KOA關節(jié)疼痛和改善關節(jié)功能［5］，然而針刀治療KOA的力學調節(jié)機制尚不明確。研究表明膝關節(jié)筋骨失衡導致的異常軟骨應力能活化香草素受體亞家族4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）通路，促進軟骨細胞凋亡［6］。因此，本研究通過改良Videman法建立KOA兔模型，從TRPV4通路介導軟骨細胞凋亡的角度入手，探討針刀治療KOA可能的作用及機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康雄性6月齡新西蘭大白兔24只，體質量（2.0±0.5）kg，訂購于上海松聯(lián)實驗動物責任有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0008，委托福建省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心代購并飼養(yǎng)，合格證號：SYXK（閩）2016-0005。實驗動物單籠喂養(yǎng)，飼養(yǎng)房溫度20～25℃，濕度30%～60%，自然光照，自由進食、飲水。本實驗已通過福建省中醫(yī)藥研究院動物實驗倫理委員會批準（批件號：FJATCMIAEC2019037），整個實驗過程中對動物的各種處理均遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的有關動物的使用及倫理學規(guī)定。

1.2 實驗試劑HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；TRPV4抗體（美國abcam公司）；Caspase-3抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）；RN54-EASYspin Plus骨組織RNA快速提取試劑盒（北京愛德萊生物科技有限公司）；mRNA逆轉錄試劑盒（中國北京康為世紀有限公司）；戊巴比妥鈉、10%EDTA（上海國藥集團化學試劑有限公司）；4%多聚甲醛、10% EDTA、0.9% NaCl注射液（南京丁貝生物有限公司）。

1.3 實驗儀器 一次性使用0.4 mm×40 mm無菌小針刀（江西老宗醫(yī)醫(yī)療器械有限公司）；光學顯微鏡、自動脫水機、組織包埋機、Leica 2025石蠟切片（德國Leica公司）；高分子石膏（陜西安信醫(yī)學技術開發(fā)有限公司）；普通石膏（浦江健宇衛(wèi)生材料有限公司）；手術刀片及相關器械（上海醫(yī)療器械批發(fā)有限公司）；一次性包埋盒、包埋模具（上海源葉生物技術有限公司）；粘附載玻片、蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 新西蘭大白兔適應性飼養(yǎng)1周后，按照體質量進行編號，采用隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、針刀組，每組各8只。參照本團隊前期研究的改良Videman法［7］，將兔子仰臥于固定架上，膝前放置石膏托，高分子石膏繃帶單層螺旋纏繞，保持膝關節(jié)伸直中立位0°，踝關節(jié)背曲60°，最后使用防啃咬繃帶環(huán)形纏繞高分子石膏表面。造模6周后，膝關節(jié)Lequesne MG行為學評分增高，X線和MRI影像學檢測示關節(jié)間隙變窄、軟骨面欠光滑，則造模成功。

2.2 干預 造模成功1周后，針刀組依據(jù)《中國經(jīng)筋學》［8］膝關節(jié)經(jīng)筋病灶點命名及定位，根據(jù)兔的骨度分寸，選取治療點“鶴頂次”“髕外上”“髕內(nèi)上”“髕外下”“髕內(nèi)下”“陰陵上”。施術部位消毒，鋪無菌洞巾，采用一次性0.4 mm×40 mm無菌小針刀進行松解，刀口線垂直皮膚進針刀，針刀抵達病變處行提插刀法松解，范圍不超過0.5 cm。見圖1。每7 d干預1次，共干預4次?？瞻捉M、模型組常規(guī)飼養(yǎng)，未做其他特殊處理。

圖1 針刀組針刀治療示意圖

2.3 取材 于針刀干預結束后1周，經(jīng)腹腔麻醉后耳緣靜脈空氣栓塞處死，迅速解剖左側膝關節(jié)，取出兔左側膝關節(jié)股骨髁軟骨組織。

2.4 HE染色光鏡觀察及Mankin’s評分 兔左側膝關節(jié)股骨髁軟骨組織粗修后于4%多聚甲醛中固定24 h，10% EDTA脫鈣完全后修切，常規(guī)石蠟包埋后5μm切片。常規(guī)脫蠟后，浸入蘇木精液中染色20 min，10%鹽酸乙醇分色3 s，PBS返藍20 min，入伊紅染料復染30 s，染色完成后用中性樹膠封片。光鏡下對軟骨組織結構進行觀察及圖像采集，按照軟骨部位選取1 024×768像素大小的圖像，每張載玻片選擇3個視野，參照Mankin’s評分［9］進行分數(shù)統(tǒng)計，取其平均值。分級標準：正常0～2分，輕度病變3～7分，中度病變8～11分，重度病變12～14分。2.5 Tunel染色 石蠟組織切片經(jīng)脫蠟水化處理后，PBS漂洗5 min×2次；滴加蛋白酶K工作液，37℃反應30 min，PBS漂洗5 min×2次；浸入封閉液（1 mL 30%H2O2溶于9 mL甲醇）中室溫封閉10 min，PBS漂洗5 min×2次；滴加TdT酶反應液，加蓋玻片37℃避光濕潤反應60 min，PBS漂洗5 min×3次；滴加Streptavidin-HRP工作液，加蓋玻片37℃濕潤避光反應30 min，PBS漂洗5 min×3次；DAB顯色，雙蒸水充分漂洗終止反應；蘇木素復染，逐級乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。通過光學顯微鏡觀察，細胞核呈棕黃色為陽性著色。采用HPIAS 21000圖像分析系統(tǒng)進行分析處理，選擇細胞分布較均勻的高倍視野計數(shù)，根據(jù)公式計算細胞凋亡指數(shù)。

2.6 RT-PCR檢測軟骨組織TRPV4、Caspase-3 mRNA表達 取兔膝關節(jié)軟骨置于研缽中，加入液氮快速研磨，使用骨組織RNA提取試劑盒提取總RNA，核酸紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。采用MMLV-PCR擴增試劑盒反轉錄二步法，cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應體系中含標本體系3μL，引物體系17μL，總體系20μL。引物由上海生物工程股份有限公司設計，GAPDH正向：TGGAATCCA CTGGCGTCTTCAC，反 向：AGGATGCGTTGCTGACA ATCTTGA；TRPV4正 向：AAGTTTGGAGCGGTCTCG TT，反向：GGTAAGGGTATGGCGGAGTG；Caspase-3正向：AGCAAATCAATGGACTCTGGGAA，反向：CCC GAGGTTTGCTGCATTTAC。PCR反 應 條 件：95℃10 min，95℃15 s，72℃30 s，共40個循環(huán)，采用相對定量2-ΔΔCt法分析結果。

2.7 Western blot檢測軟骨組織TRPV4、Caspase-3蛋白表達 組織裂解法提取兔軟骨組織總蛋白，BCA法測定蛋白含量后，SDS-PAGE凝膠電泳，NC膜轉印，一抗、二抗孵育，ECL顯色曝光。Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)成像，Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參照蛋白進行校準，采用目標蛋白條帶灰度值／GAPDH條帶灰度值來表示目的蛋白相對表達水平。

2.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料服從正態(tài)分布采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。不服從正態(tài)分布采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（IQR）］表示，采用秩和檢驗進行比較。

3 結 果

3.1 3組兔實驗情況 實驗期間各組兔精神狀態(tài)良好，體質量、進食量基本一致，實驗過程中動物無死亡。

3.2 3組兔軟骨組織HE染色形態(tài)學觀察 空白組軟骨表面光滑，層次結構清晰，細胞排列規(guī)整，潮線清晰完整；模型組軟骨表面不光滑，部分缺損，細胞分布不均勻，潮線紊亂；針刀組軟骨表面較光滑，層次結構較清楚，細胞排列趨于整齊，潮線較模型組完整。見圖2。

3.3 3組兔軟骨組織Mankin’s評分比較 見表1。

圖2 3組兔軟骨組織HE染色圖（×100）

表1 3組兔軟骨組織Mankin’s評分比較［M（IQR）］

3.4 3組兔軟骨組織Tunel染色觀察 空白組可見少量散在的軟骨細胞凋亡；模型組可見大量的軟骨細胞凋亡，呈片狀分布；針刀組軟骨細胞凋亡數(shù)明顯少于模型組，趨于空白組。見圖3。

圖3 3組兔軟骨TUNEL染色圖

表2 3組關節(jié)軟骨細胞凋亡率比較（±s）

表2 3組關節(jié)軟骨細胞凋亡率比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

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3.5 3組兔軟骨細胞凋亡率比較 見表2。

3.6 3組兔軟骨組 織TRPV4、Caspase-3 mRNA表達比較 見表3。

表3 3組兔軟骨組織TRPV4、Caspase-3 mRNA表達比較（±s）

表3 3組兔軟骨組織TRPV4、Caspase-3 mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

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3.7 3組兔軟骨組織TRPV4、Caspase-3蛋白表達比較 見圖4、表4。

圖4 3組兔軟骨組織TRPV4、Caspase-3蛋白電泳圖

表4 3組兔軟骨組織TRPV4、Caspase-3蛋白表達比較（±s）

表4 3組兔軟骨組織TRPV4、Caspase-3蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

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4 討 論

KOA是生物學因素和力學因素共同作用下以關節(jié)軟骨退變?yōu)橹?，最終導致軟骨結構破壞、滑膜增厚、骨質增生及關節(jié)內(nèi)炎癥反應，嚴重影響患者的生活質量［10］。中醫(yī)學經(jīng)筋理論從氣血和力學角度闡明KOA核心病機為“氣血失和，筋骨失衡”，關鍵治則為“解結橫絡、調和氣血、調衡筋骨”［11］。針刀具有“針刺”和“刀割”雙重功效，擅長對病損軟組織粘連、瘢痕、攣縮進行松解和疏通堵塞，主要功效為改善骨骼肌、韌帶功能，調節(jié)力學平衡［12］。因此，基于經(jīng)筋理論針刀循膝周經(jīng)筋病灶點松解是治療KOA有效途徑［13］。研究表明，“鶴頂次”“髕外上”“髕內(nèi)上”“髕外下”“髕內(nèi)下”和“陰陵上”為KOA高頻經(jīng)筋病灶點和治療點［14-15］，基于此，本團隊選取上述病灶點行針刀松解，以達到調節(jié)膝關節(jié)“氣血和暢、筋骨平衡”目的，從而有效緩解KOA疼痛和功能障礙，延緩軟骨退變。

研究結果顯示，與空白組比較，模型組軟骨表面不光滑，部分缺損，層次結構不清，細胞分布不均勻，可見細胞簇集，潮線紊亂，Mankin’s評分明顯升高。經(jīng)過針刀干預后，軟骨形態(tài)及Mankin’s評分均明顯改善，表明基于經(jīng)筋理論針刀松解能夠有效延緩KOA兔軟骨退變。

KOA主要表現(xiàn)為軟骨細胞凋亡顯著增多，其增殖、凋亡動態(tài)平衡被打破，關節(jié)軟骨細胞大量減少，最終導致關節(jié)軟骨退變［16］。本研究運用Tunel染色檢測軟骨細胞凋亡情況，結果表明模型組軟骨細胞凋亡率顯著高于空白組，而針刀組軟骨細胞凋亡率比模型組明顯降低，這提示基于經(jīng)筋理論針刀松解能夠減少KOA兔軟骨細胞凋亡，延緩軟骨退變。

TRPV4是一種機械敏感離子通道，在軟骨、骨和滑膜等多種肌肉骨骼組織中廣泛表達，介導軟骨細胞對機械應力的反應［17］。膝關節(jié)筋骨失衡過度機械應力可活化TRPV4，引起Ca2＋大量內(nèi)流，激活細胞內(nèi)凋亡分子Caspase-3表達，促進軟骨細胞凋亡，加劇軟骨細胞退變。本研究運用RT-PCR和Western blot檢測軟骨TRPV4、Caspase-3分子表達，結果表明模型組軟骨TRPV4、Caspase-3 mRNA和蛋白的表達較空白組顯著增高，而針刀組軟骨TRPV4、Caspase-3 mRNA和蛋白的表達較模型組顯著降低?？梢?，基于經(jīng)筋理論針刀松解能夠抑制TRPV4信號通路，使TRPV4降低表達，進而下調下游靶點促凋亡蛋白Caspase-3表達，從而有效減少軟骨細胞凋亡，延緩軟骨退變。

綜上所述，基于經(jīng)筋理論運用針刀循膝周常見經(jīng)筋病灶點松解，能有效減少KOA兔軟骨細胞凋亡，延緩軟骨退變，其作用機制可能與抑制TRPV4通路，下調TRPV4、Caspase-3表達有關。