基于UPLC法澤瀉水提液指紋圖譜的建立

羅 山，黃王琛，劉 懿，呂瑩瑩,李改元，唐文強(qiáng),2

(1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥綠色制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712046)

澤瀉作為中藥材，在我國具有非常悠久的歷史，最早出現(xiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是澤瀉科植物澤瀉(Alisma orientale (Sam.) Juzep.)的干燥塊莖，具有利水滲濕、泄熱化濁的功效[1～2]，產(chǎn)地主要集中在四川、福建、江西和廣西等地區(qū)。現(xiàn)代臨床上主要用于降血脂、降血壓、抗炎保肝、利尿、治療糖尿病和抗腫瘤等[3～6]。

澤瀉化學(xué)成分復(fù)雜，在臨床上常作用于多個(gè)靶點(diǎn)，很難通過幾個(gè)特定的成分對其質(zhì)量進(jìn)行整體評價(jià)[7]。指紋圖譜是一種很好的“模糊鑒別”的方式，能夠反映藥材的整體特征[8～9]。張敏娜等[10]采用氣相色譜(GC)，通過控制程序升溫的條件和方法學(xué)考察，建立了具有18個(gè)共有峰的澤瀉乙腈提取液的指紋圖譜。劉小蔓[11]等采用高效液相色譜法-電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-ICP-MS)，指認(rèn)了澤瀉6個(gè)特征峰。陳瑩等[12]采用高效液相色譜法(HPLC)，在208 nm和245 nm波長下，分別建立了含有17個(gè)和10個(gè)共有峰的澤瀉乙腈提取液的指紋圖譜。樊李明等[13]采用超高液相色譜法(UPLC)，建立了含有14個(gè)共有峰的澤瀉乙腈提取液的指紋圖譜。在眾多指紋圖譜檢測技術(shù)中，UPLC法能夠?qū)?fù)雜體系實(shí)現(xiàn)快速檢測，靈敏度高，可以節(jié)約分析時(shí)間，同時(shí)UPLC的檢測溫度低，不會(huì)對被檢測物質(zhì)造成破壞，能夠最大限度的客觀反應(yīng)復(fù)雜體系的特征。此外，目前報(bào)道的關(guān)于澤瀉指紋圖譜的建立，檢測的對象均為澤瀉乙腈的提取液，但是在實(shí)際使用時(shí)，一般采用的是澤瀉的水提液。不同的提取溶劑勢必會(huì)造成澤瀉提取成分的不同，指紋圖譜也會(huì)存在差異，但是關(guān)于澤瀉水提液指紋圖譜的研究尚未見報(bào)道。因此筆者研究采用UPLC法，對來自四川、福建、廣西、江西4個(gè)澤瀉主要產(chǎn)地不同批號(hào)的20批澤瀉水提液建立指紋圖譜，并指認(rèn)澤瀉醇A、澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇醇B這三個(gè)澤瀉的關(guān)鍵成分，為提高澤瀉飲片質(zhì)量控制方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器、試劑與藥材

采用美國waters公司生產(chǎn)的ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜儀；昆山舒美超聲儀器生產(chǎn)的KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗器；瑞士梅特勒公司生產(chǎn)的Mettler AE240電子分析天平；德國MAYZUN公司生產(chǎn)的TE124S電子分析天平；四川優(yōu)普生產(chǎn)的UPT-I-10T反滲透超純水機(jī)。

對照品：澤瀉醇A(批號(hào)：R02N6F5398)、澤瀉醇B(批號(hào)：M15A7S13161)購自上海源葉生物有限公司；23-乙酰澤瀉醇B(批號(hào)：F0711AS)，購自大連美侖生物有限公司。乙腈(色譜純)購自美國天地公司；其它試劑均為分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為UPT-I-10T反滲透超純水機(jī)過濾所得。

20批澤瀉樣品產(chǎn)地分別四川、福建、廣西、江西，均購自市售的各大藥店，符合2015版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，樣品留存于陜西國際商貿(mào)學(xué)院中藥研究院科研實(shí)驗(yàn)室201室。樣品信息如下S1(190101)購自亳州市華云中藥飲片有限公司(四川)，S2(180401)、S3(180701)、S4(170101)、S5(170701)來自安國祁安藥業(yè)有限公司(四川)，S6(170701)來自四川省天府神龍中藥飲片有限公司(四川)，S7(20180801)購自陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司(福建)，S8(160908031)、S9(160800471)、S10(160904381)購自康美藥業(yè)股份有限公司(福建)，S11(171001)、S12(171003)、S13(171204)來自福建承天藥業(yè)有限公司(福建)，S14(180401)、S15(180404)、S16(180407)、S17(180409)購自廣西，S18(P201605118)購自江西宏潔中藥飲片有限公司(江西)、S19(1612011)購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司(江西)、S20(20170101)購自江西青春康康源中藥飲片有限公司(江西)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對照品溶液的制備 精確稱取0.0037 g澤瀉醇A，0.0035 g澤瀉醇B和0.0024g乙酰澤瀉醇B-23分別加入到5mL容量瓶中，加入適量甲醇完全溶解，然后用甲醇定容得單組分對照品溶液；精確量取上述各單組分溶液1 mL，加入到5 mL容量瓶中，用甲醇定容得混合對照品溶液。

1.2.2 澤瀉水提液供試品制備 稱取澤瀉80 g，加水200 mL，浸泡30 min，先大火至沸騰，再小火煎煮2 h，紗布過濾，冷卻，離心，取上清液即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×50 mm，1.7 μm )色譜柱；流動(dòng)相為乙腈( A) -水( B) ；梯度洗脫條件：0～4 min，5%～55%A；4～6 min，55%～70%A；6～10 min，70%～90%A；10～14 min，90%～5%A；14～15 min，5%～5%A；流 速 0.3 m L·min-1；柱溫35 ℃；全波長掃描(190～400 nm) ；進(jìn)樣量 10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

在190～400 nm范圍內(nèi)，采用3D通道，對澤瀉水提液進(jìn)行全波長掃描測試，結(jié)果表明208 nm為最佳測試波長，在208 nm下基線平穩(wěn)，共有峰數(shù)量多，且分離度符合檢測要求，部分峰具有較高響應(yīng)值，因此選擇208 nm作為澤瀉水提液后續(xù)檢測波長。澤瀉主要化學(xué)成分為三萜類、二萜類、倍半萜類類等化合物[21～22]，采用乙腈-水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行澤瀉水提液的UPLC檢測，基線平穩(wěn)，色譜峰峰形好，各化合物之間分離度高。因此選擇乙腈-水作為流動(dòng)相，并采用梯度洗脫的方法對澤瀉水提液進(jìn)行分析。當(dāng)柱溫為35℃C時(shí)，澤瀉水提液的UPLC譜圖分離效果最好，因此確定柱溫為35 ℃。

2.2 澤瀉水提液指紋圖譜的建立

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取S1 批澤瀉水提液供試品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄譜圖。以14號(hào)峰澤瀉醇B為參照峰，各特征共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于 1% ，相對峰面積的RSD均小于4.88%，表明所用儀器精密度良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取S1批澤瀉水提液供試品溶液6 份，按“1.2.3”項(xiàng)色譜條件依次進(jìn)樣，記錄譜圖。以14號(hào)峰澤瀉醇B為參照峰，各特征共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于 1%，相對峰面積的RSD均小于 4.45%，表明本方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取S1批澤瀉水提液供試品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)所述的色譜條件，分別在0，4，8，12，16，24 h 測定UPLC色譜圖，以14號(hào)峰澤瀉醇B為參照峰。結(jié)果顯示，各特征共有峰相對保留時(shí)間的RSD 均小于 1% ，相對峰面積的RSD均小于 4.84%，表明供試品溶液在 24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 專屬性考察 按照“1.2.3”項(xiàng)所述的色譜條件進(jìn)樣溶劑甲醇，得溶劑甲醇的空白 UPLC 色譜圖，結(jié)果見圖1，由圖1可見空白溶劑甲醇中沒有明顯的色譜峰，表明溶劑甲醇不會(huì)對澤瀉水提液的色譜圖產(chǎn)生干擾，所有的色譜峰均來自于澤瀉水提液。

圖1 空白溶劑甲醇的UPLC色譜

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)對照品UPLC色譜圖的測定 按照1.2.3色譜條件分別進(jìn)樣澤瀉醇A，澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B以及混合對照品溶液得對照品UPLC色譜圖，結(jié)果見圖2。

圖2 對照品的UPLC色譜(1:澤瀉醇A;2:澤瀉醇B;3:23-乙酰澤瀉醇B)

由圖2可見，澤瀉醇A的保留時(shí)間為8.892 min，澤瀉醇B的保留時(shí)間為10.804 min，23-乙酰澤瀉醇B的保留時(shí)間為11.956 min，三個(gè)對照品的分離度高，峰型好，無拖尾現(xiàn)象。

2.2.6 指紋圖譜建立 按“1.2.2”項(xiàng)方法制備20 批澤瀉水提液供試品溶液，采用1.2.3色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)生成指紋圖譜，見圖3。

(1)參照峰的選擇。對比20 批供試品指紋圖譜和標(biāo)準(zhǔn)品對照譜圖，可確定14號(hào)峰為澤瀉醇B，其峰與其它物質(zhì)的分離度高，峰型好且穩(wěn)定，故確定14號(hào)澤瀉醇B色譜峰為參照峰。

(2)共有峰標(biāo)定。由圖3可見，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)處理，20批澤瀉水提液共有19個(gè)共有峰(見圖3 A)，分別為1號(hào)峰(4.717 min)，2號(hào)峰(5.642 min)，3號(hào)峰(6.684 min)，4號(hào)峰(7.0334 min)，5號(hào)峰(7.239 min)，6號(hào)峰(7.884 min)，7號(hào)峰(8.254 min)，8號(hào)峰(8.460)，9號(hào)峰(8.665)，10號(hào)峰(8.891)，11號(hào)峰(9.241)，12號(hào)峰(9.488)，13號(hào)峰(10.441)，14號(hào)峰(10.801)，15號(hào)峰(11.951)，16號(hào)峰(12.223)，17號(hào)峰(12.6211)，18號(hào)峰(12.2772)，19號(hào)峰(13.7930)，其中10號(hào)峰為澤瀉醇A，14號(hào)峰為澤瀉醇B，15號(hào)峰為23-乙酰澤瀉醇B，這3個(gè)色譜峰的分離度高，分型好，而且穩(wěn)定，能夠作為澤瀉水提液質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

圖3 澤瀉水提液UPLC色譜(A)和20批澤瀉水提液指紋圖譜(B)

(3)相似度評價(jià)。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”2004A 版軟件計(jì)算分析，20批澤瀉供試品色譜圖中特征共有峰的相對保留時(shí)間的RSD 均小于1%，相對峰面積的 RSD均小于 5% ，色譜圖相似度大于0.924(見表1)，表明批次間存在差異，但差異性較小，制備工藝穩(wěn)定，方法準(zhǔn)確可靠。

表1 20批澤瀉水提液與對照指紋圖譜的相似度

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用超高液相色譜法對20批澤瀉水提液進(jìn)行了分析，建立了澤瀉水提液的指紋圖譜，共標(biāo)定了19個(gè)共有峰，同時(shí)指認(rèn)了澤瀉醇A，澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B三個(gè)澤瀉主要化學(xué)成分的色譜峰，建議這3個(gè)成分為可作為澤瀉水提液質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。不同產(chǎn)地不同批號(hào)澤瀉水提液之間存在一定的差異，但差異性較小。該方法快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，特征性強(qiáng)，能夠?yàn)樘岣邼蔀a水提液的質(zhì)量控制提供參考。