螃蟹腳可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其促生活性研究

賈顏 傅培龍 李茜 李文祥 張?zhí)熘{ 黃美娟 黃海泉

摘要：【目的】揭示螃蟹腳可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及其產(chǎn)IAA、鐵載體及解磷、解鉀能力，篩選具促生活性菌株，為后續(xù)植物內(nèi)生細(xì)菌資源的開(kāi)發(fā)與利用提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。【方法】以寄生植物螃蟹腳為研究材料，采用4種分離方法和5種不同培養(yǎng)基分離其內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)16S rRNA基因序列對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)確定內(nèi)生細(xì)菌的分類(lèi)地位;從分離獲得的螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌中篩選具有ACC脫氨酶活性菌株，并對(duì)含ACC脫氨酶內(nèi)生菌株的產(chǎn)IAA、鐵載體及解磷、解鉀能力進(jìn)行測(cè)定?！窘Y(jié)果】從螃蟹腳中共分離純化獲得60株內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)16S rRNA測(cè)序及比對(duì)分析，去重復(fù)后共獲得52株螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌，分屬于15科22屬，其中以懸浮法（Z法）和纖維素—脯氨酸培養(yǎng)基（4號(hào)）的分離效果最佳，分別獲得16和17個(gè)菌屬，且以短小桿菌屬（Curtobacterium）為優(yōu)勢(shì)菌屬，占23.08%。促生能力測(cè)定結(jié)果表明，12株具ACC脫氨酶活性的內(nèi)生細(xì)菌中7株菌（占58.33%）具有產(chǎn)IAA能力，其中菌株SWFU34產(chǎn)IAA能力最強(qiáng)，為4.95 mg/mL;10株菌（占83.33%）具有產(chǎn)鐵載體能力;8株菌（占66.67%）具解磷和解鉀能力，其中有4株菌株（占33.33%）同時(shí)具有產(chǎn) IAA、鐵載體及解磷、解鉀能力?！窘Y(jié)論】螃蟹腳蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源及具促生活性的菌株，其中短小桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，假單胞菌屬菌株SWFU34的促生活性最突出，具有農(nóng)業(yè)應(yīng)用的潛力。

關(guān)鍵詞： 螃蟹腳;植物內(nèi)生細(xì)菌;多樣性;促生活性

中圖分類(lèi)號(hào)： S182;Q939.96? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）12-3415-10

Diversity of culturable endophytic bacteria from Viscum liquidambaricolum and its survival promotion

JIA Yan， FU Pei-long， LI Qian， LI Wen-xiang， ZHANG Tian-yao，

HUANG Mei-juan*， HUANG Hai-quan*

（College of Landscape Architecture and Horticulture Sciences， Southwest Forestry University/Southwest Research Center for Engineering Technology of Landscape Architecture（State Forestry and Grassland Administration）/Yunnan Engineering Research Center for Functional Flower Resources and Industrialization/Research and Development Center of Landscape Plants and Horticulture Flowers，Southwest Forestry University， Kunming? 650224， China）

Abstract：【Objective】The diversity of cultured endophytic bacteria and their IAA and siderophore production as well as their phosphate and potassium solubilizing abilities were revealed in Viscum liquidambaricolum， and the life-promoting strains were screened， which would provide some basic data and theoretical basis for the subsequent development and utilization of plant endophytic bacteria. 【Method】The endophytic bacteria were isolated from the parasitic plant V. liquidambaricolum by four isolation methods and five different media. The endophytic bacteria were identified by 16S rRNA gene sequence， and the phylogenetic tree was constructed to determine the taxonomic status of endophytic bacteria. Strains with ACC deaminase activity were screened from endophytic bacteria， which was isolated from V. liquidambaricolum， and the IAA-producing， siderophore-producing， phosphorus-dissolving and potassium-dissolving abilities of endophytic strains containing ACC deaminase were determined. 【Result】60 strains of endophytic bacteria were isolated and purified from V. liquidambaricolum. Through 16S rRNA sequencing and comparative analysis， 52 strains of endophytic bacteria from V. liquidambaricolum were obtained after deduplication， which belonged to 22 genera and 15 families. Among them， suspension method （Z method） and cellulose-proline medium （No.4） had the best separation effect， with 16 and 17 genera were obtained respectively， and Curtobacterium was the dominant genus， accounting for 23.08%. The test results of growth-promoting ability showed that among 12 endophytic bacteria with ACC deaminase activity， 7 bacteria （58.33%） had IAA-producing ability， among which SWFU34 had the strongest IAA-producing ability， which was 4.95 mg/mL. 10 strains （83.33%） had the ability to produce siderophore; 8 strains （66.67%） had the ability of dissolving phosphorus and potassium， among which 4 strains（33.33%） had the ability of? producing IAA and siderophore and dissolving phosphorus and potassium at the same time. 【Conclusion】V. liquidambaricolum is rich in microbial resources and life-promoting strains， among which Curtobacterium is the dominant genus， Pseudomonas strain SWFU34 is the most prominent one in promoting activity， which has the potential of agricultural application.

Key words： Viscum liquidambaricolum; endophytic bacteria; diversity; growth promoting activity

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31760001）; Technology Extension Project of the National Forestry and Grassland Administration of China（2020133126）; Program for Innovative Research Team （in Scien-ce and Technology） in University of Yunnan （51700204）; Reserve Talents Fund for Young and Middle-Aged Academic and Technological Leaders in Yunnan （2018HB024）

0 引言

【研究意義】螃蟹腳（Viscum liquidambaricolum Hayata.）又名楓香槲寄生，桑寄生科槲寄生屬植物，為多年生草本植物，主要分布于西南地區(qū)海拔1100～2500 m的山地闊葉林或常綠闊葉林中，寄生于古喬木茶樹(shù)以及楓香、油桐、柿樹(shù)或殼斗科等多種植物上（Mrinmoy et al.，2020）。螃蟹腳顏色為綠色，因形似小珊瑚，如同蟹腳，因此也被稱(chēng)為螃蟹腳，曾是景邁地區(qū)普洱茶出口外銷(xiāo)和進(jìn)貢的特殊標(biāo)記（應(yīng)劍等，2016），在云南部分地區(qū)被認(rèn)為是較珍貴的可食用植物，通常與普洱茶一起飲用（關(guān)玥等，2016）。螃蟹腳作為槲寄生屬植物，與其他槲寄生植物有許多相似功能，如具有抗氧化、清除自由基及提高免疫力等作用，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值（Wang et al.，2019），故而螃蟹腳開(kāi)發(fā)潛力巨大，但目前關(guān)于螃蟹腳微生物資源方面的相關(guān)研究較薄弱，螃蟹腳菌種資源的合理開(kāi)發(fā)利用成為目前關(guān)鍵問(wèn)題（Ruchi et al.，2018）。因此，開(kāi)展螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其促生活性研究，對(duì)后續(xù)菌肥資源的開(kāi)發(fā)與利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前對(duì)螃蟹腳的研究主要在化合物提取工藝、藥理學(xué)研究及化學(xué)成分含量分析等方面（李娟等，2017）。蘇馳等（2012）采用紙片擴(kuò)散法和微孔板稀釋法從螃蟹腳中提取出具有抗菌特性的提取物;曹朵等（2015）對(duì)文獻(xiàn)資料進(jìn)行系統(tǒng)整理后發(fā)現(xiàn)，槲寄生屬植物中化學(xué)成分及藥理學(xué)成分具有抗腫瘤、降血糖等藥理活性;Wang等（2019）使用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)螃蟹腳中含有66種化學(xué)成分具有抗氧化等能力，一些香氣成分和營(yíng)養(yǎng)成分未來(lái)可代替類(lèi)似于茶的飲料。Yu等（2016）研究表明，從寄生植物中分離出的一些內(nèi)生細(xì)菌可產(chǎn)生與寄主植物相同或相似的功能，因此，進(jìn)一步探究螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌在抗衰老、抗病性等方面的作用具有重要意義。目前在植物內(nèi)生細(xì)菌的研究中，不同學(xué)者根據(jù)不同的植物材料選用不同的分離方法及分離培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，由于不同培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不同，導(dǎo)致不同培養(yǎng)基對(duì)所分離出的微生物數(shù)量有較大影響（李蜜等，2020）。Heindl等（2012）從苔蘚中進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離時(shí)使用4種不同的分離培養(yǎng)基并根據(jù)細(xì)菌16S rRNA基因序列分析對(duì)所有分離菌株進(jìn)行分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)得到的菌屬數(shù)量存在一定差異;陳澤斌等（2014）用1種分離方法及4種分離培養(yǎng)基從煙草中進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離，發(fā)現(xiàn)TSA和NA培養(yǎng)基與其他培養(yǎng)基相比所分離的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量較多;石松標(biāo)等（2018）用3種分離培養(yǎng)基并基于分子生物學(xué)鑒定方法從紅樹(shù)林中分離放線(xiàn)菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)椰子汁—海藻糖培養(yǎng)基所分離到的菌屬數(shù)量最多，為最佳分離培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中所含的營(yíng)養(yǎng)成分是植物內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的主要養(yǎng)分來(lái)源，選擇不同成分的培養(yǎng)基，可對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)及多樣性產(chǎn)生重要影響，使用不同種類(lèi)的培養(yǎng)基有利于得到豐富的菌屬（柴曉蕾，2017），同時(shí)具促生作用的內(nèi)生細(xì)菌在農(nóng)業(yè)和工業(yè)方面的研究應(yīng)用越來(lái)越多，正逐步成為研究熱點(diǎn)（Heindl et al.，2012;Danish et al.，2019）。付思遠(yuǎn)等（2020）采用IS-PCR指紋圖譜技術(shù)將分離得到的菌株進(jìn)行聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)其中有多株菌株具有固氮、解磷、解鉀以及產(chǎn)IAA能力;錢(qián)婷和葉建仁（2020）使用NBRIP培養(yǎng)基從樟樹(shù)中分離獲得1株芽孢桿菌，采用稀釋涂布法等方法檢測(cè)出該菌株具有較高的溶磷量，對(duì)樟樹(shù)具有明顯的促生能力;李慧穎等（2021）采用6種分離培養(yǎng)基以及通過(guò)稀釋涂布法從互花米草植物中分離內(nèi)生細(xì)菌，并篩選出多株具有產(chǎn)IAA、容磷及固氮能力的內(nèi)生細(xì)菌。因此，植物內(nèi)生細(xì)菌在抑制病原菌、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性及促進(jìn)植物生長(zhǎng)等方面發(fā)揮著重要作用（李章雷等，2021;Angélique et al.，2021），植物內(nèi)生細(xì)菌是一種廣泛存在的微生物資源，已成為新的研究熱點(diǎn)。目前，對(duì)于獨(dú)特的植物在內(nèi)生細(xì)菌方面的研究較少甚至稀缺，如人參、刺五加及寄生植物等，但隨著對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌廣泛的研究，涉及的植物種類(lèi)也會(huì)越來(lái)越豐富（劉迎雪等，2020）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】植物內(nèi)生細(xì)菌是一個(gè)龐大的群體，其中蘊(yùn)含著豐富的資源，且有研究表明植物內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的促生功能，但螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌的研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以螃蟹腳為試驗(yàn)材料，采用4種分離方法及5種不同分離培養(yǎng)基對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離，結(jié)合16S rRNA序列比對(duì)分析螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌多樣性，探究螃蟹腳中微生物資源的豐富性;采用比色定量法從螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌中篩選含ACC脫氨酶內(nèi)生菌株，進(jìn)而對(duì)含ACC脫氨酶內(nèi)生菌株的產(chǎn)IAA、鐵載體及解磷、解鉀能力進(jìn)行測(cè)定，以期篩選具有促生潛力的植物生長(zhǎng)促生菌（PGPB），為后續(xù)植物內(nèi)生細(xì)菌資源的開(kāi)發(fā)與利用提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

隨機(jī)選用云南省西南部勐海地區(qū)10株健康百年喬木型茶樹(shù)上的寄生植物螃蟹腳。

1. 2 螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定

1. 2. 1 內(nèi)生細(xì)菌的分離及純化

1. 2. 1. 1 樣品預(yù)處理 將螃蟹腳在自來(lái)水下清洗表面的灰塵后置于超聲波清洗器中進(jìn)行反復(fù)清洗，直至清洗材料的水變得極清澈。

1. 2. 1. 2 樣品消毒 消毒程序：0.1% Tween 1 min→70%酒精30 s→5%次氯酸鈉溶液處理4 min→2.5%硫代硫酸鈉溶液處理10 min→10% NaHCO3 10 min→無(wú)菌水清洗4～5次。將消毒后的樣品放在無(wú)菌的組培瓶中（培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)裝有無(wú)菌硅膠），置于30 ℃干燥箱中使其干燥。參照黃美娟（2016）的方法檢測(cè)消毒是否徹底。

1. 2. 1. 3 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化 使用本課題組多年研究效果較好的5種分離培養(yǎng)基及4種分離方法進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離。

分離培養(yǎng)基：P3培養(yǎng)基（1號(hào)）（微量鹽1 mL，燕麥20.0 g，瓊脂12.0 g）、TWYE培養(yǎng)基（2號(hào)）（酵母膏20.25 g，磷酸氫二鉀0.5 g，瓊脂12.0 g）、海藻糖—脯氨酸培養(yǎng)基（3號(hào)）（脯氨酸1.0 g，海藻糖6.0 g，硝酸鉀0.5 g，磷酸氫二鈉0.3 g，七水硫酸鎂0.2 g，氯化鈣0.5 g，瓊脂12.0 g）、纖維素—脯氨酸培養(yǎng)基（4號(hào)）（纖維素2.5 g，丙酮酸鈉2.0 g，脯氨酸1.0 g，硝酸鉀0.25 g，七水硫酸鎂0.2 g，磷酸氫二鉀0.2 g，氯化鈣0.5 g，硫酸亞鐵10 mg，瓊脂12.0 g）和木聚糖—天門(mén)冬酰胺培養(yǎng)基（5號(hào)）（木聚糖2.5 g，天冬酰胺10 mg，磷酸氫二鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.2 g，氯化鈣0.5 g，硫酸亞鐵10 mg，瓊脂12.0 g）。純化培養(yǎng)基采用YIM 38#培養(yǎng)基（麥芽粉5.0 g，酵母浸粉4.0 g，葡萄糖4.0 g，瓊脂14.0 g）。

分離方法：（1）粉狀干撒（S法）：將研磨好的部分材料干撒在5種分離培養(yǎng)基上;（2）懸浮法：取1.0 g粉狀材料放入裝有9 mL 0.1% Na4P2O7·10H2O緩沖溶液的錐形瓶中，于37 ℃、200 r/min的振蕩器上振蕩10次，每次20 s，靜置1 min，直接取上清液（X法）或?qū)⑸锨逡合♂?0倍（Z法）涂布于5種分離培養(yǎng)基;（3）離心法（L法）：取1.0 g粉狀材料放入裝有9 mL 0.1% Na4P2O7·10H2O緩沖溶液的離心管中，低溫離心取其沉淀，稀釋100倍涂布于5種分離培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～15 d，根據(jù)菌株菌落形態(tài)、顏色等特征挑取單菌落于YIM 38#培養(yǎng)基上純化獲得純培養(yǎng)物。

1. 2. 2 內(nèi)生細(xì)菌DNA提取及16S rRNA擴(kuò)增及測(cè)序 參考Li等（2007）的方法進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌DNA提取。參照Ayuso-Sacido和Genilloud（2005）的方法對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)序獲得的16S rRNA序列在NCBI的BLAST進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)選取同源性高的已有分類(lèi)地位的菌株序列，運(yùn)用MEGA 7.0以Neighbour-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1. 3 具ACC脫氨酶的內(nèi)生細(xì)菌促生活性測(cè)定

參考Misra等（2017）的方法從分離獲得的螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌中篩選含ACC脫氨酶內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)篩選獲得的含ACC脫氨酶內(nèi)生菌進(jìn)行產(chǎn)IAA、鐵載體及解磷、解鉀能力測(cè)定。產(chǎn)IAA能力測(cè)定參照Santoyo等（2019）的方法;產(chǎn)鐵載體及解磷、解鉀能力測(cè)定參考Abbamondi等（2016）的方法。

2 結(jié)果與分析

2. 1 螃蟹腳可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

用4種分離方法及5種分離培養(yǎng)基從螃蟹腳中分離得到60株內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)，去除重復(fù)后共獲得52株螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌，分屬于15科22屬。如圖1所示，52株菌株分別歸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、馬賽菌屬（Massilia）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、腸桿菌屬（Enterobacter）和泛菌屬（Pantoea），均占總菌株數(shù)的3.85%（2株）;藤黃色桿菌屬（Luteibacter）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假蒼白桿菌屬（Pseudochrobactrum）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、陰性葡萄球菌屬（Mammaliicoccus）、歐文氏菌屬（Erwinia）、克雷伯氏菌屬（Klebsie-lla）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、細(xì)桿菌屬（Microbacterium）和代爾夫特菌屬（Delftia），分別占總菌株數(shù)的1.92%（1株）;寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、克呂沃爾氏菌屬（Kluyvera）和葡萄球菌屬（Staphylococcus），分別占總菌株數(shù)的5.77%（3株）、5.77%（3株）、9.62%（5株）和11.54%（6株）;短小桿菌屬（Curtobacterium）占比最高，達(dá)23.08%（12株），為優(yōu)勢(shì)菌屬。結(jié)果表明螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌種屬間存在豐富的多樣性。運(yùn)用NCBI的BLAST選取各個(gè)屬中同源性高的27株模式菌株，以脆弱擬桿菌（Bacteroides frugilis）為外群與螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖1）。

2. 2 不同分離方法對(duì)螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌資源分離的影響

從表1可知，不同的分離方法對(duì)螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌的分離效果具有明顯影響，分離效果從高到低依次為Z法（55.77%）>L法（17.31%）>S法（15.38%）>X法（11.54%）。綜合不同分離方法分析獲得的菌屬，短小桿菌屬（23.08%）為此次分離內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬，且在每種分離方法中均能獲得。陰性葡萄球菌屬、諾卡氏菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、馬賽菌屬、代爾夫特菌屬、土壤桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬僅從Z分離法中獲得，Z法獲得的菌株數(shù)和菌屬數(shù)分別占總菌株數(shù)和總菌屬數(shù)的55.77%和72.73%，Z法為本研究螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌最佳分離方法。

2. 3 不同分離培養(yǎng)基對(duì)螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌資源分離的影響

不同分離培養(yǎng)基對(duì)螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌的分離效果具有明顯影響。如表2所示，綜合不同分離培養(yǎng)基獲得的螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌菌株和菌屬數(shù)量，4號(hào)和5號(hào)培養(yǎng)基的分離效果更理想，獲得較好的內(nèi)生細(xì)菌類(lèi)群多樣性，主要分離獲得的菌屬有短小桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬和克呂沃爾氏菌屬，其中短小桿菌屬（23.08%）為此次分離內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬，且在每種分離培養(yǎng)基中均能獲得，與不同分離方法分離螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌得到的結(jié)果一致。其特殊菌屬陰性葡萄球菌屬、細(xì)桿菌屬、諾卡氏菌屬、克雷伯氏菌屬、藤黃色桿菌屬、假蒼白桿菌屬和土壤桿菌屬等菌屬僅在4號(hào)培養(yǎng)基中獲得，4號(hào)培養(yǎng)基分離的菌株數(shù)和菌屬數(shù)分別占總菌株數(shù)和總菌屬數(shù)的50.00%和77.27%，為本研究分離效果最佳的培養(yǎng)基。

2. 4 具ACC脫氨酶螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌促生活性測(cè)定結(jié)果

2. 4. 1 具ACC脫氨酶螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌篩選結(jié)果

從52株螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌中篩選得到12株含ACC脫氨酶的內(nèi)生菌菌株，菌株信息見(jiàn)表3。

2. 4. 2 螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)IAA能力測(cè)定結(jié)果 測(cè)定結(jié)果（表4）顯示，12株內(nèi)生細(xì)菌中有7株（占58.33%）5個(gè)屬的內(nèi)生細(xì)菌具有產(chǎn)IAA能力，分別為假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、細(xì)桿菌屬、甲基桿菌屬和馬賽菌屬。其中假單胞菌屬菌株SWFU34的IAA濃度最高，為4.95 mg/mL，馬賽菌屬菌株SWFU112的IAA濃度最低，為1.04 mg/mL，前者是后者的4.76倍（圖2）;其他5株菌的IAA活性在1.18～4.62 mg/mL。

2. 4. 3 螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定結(jié)果

表4結(jié)果顯示，12株內(nèi)生細(xì)菌中除細(xì)桿菌屬菌株SWFU49和馬賽菌屬菌株SWFU112外，其余10株（占83.33%）內(nèi)生細(xì)菌菌落邊緣均產(chǎn)生淡黃色光暈，說(shuō)明具有產(chǎn)鐵載體能力，其中假單胞菌屬和短小桿菌屬分別篩選到2株產(chǎn)鐵載體菌株，占總菌株數(shù)的16.67%。12株內(nèi)生細(xì)菌中有5株同時(shí)兼具產(chǎn)IAA和鐵載體能力，占總菌株數(shù)的41.67%。

2. 4. 4 螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌解磷和解鉀能力測(cè)定結(jié)果

從表4可知，12株內(nèi)生細(xì)菌中有8株（占66.67%）7個(gè)屬的內(nèi)生細(xì)菌具有解磷和解鉀能力，分別是假單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、土壤桿菌屬、短小桿菌屬、代爾夫特菌屬、甲基桿菌屬和馬賽菌屬，其中有2株假單胞菌屬，占總菌株數(shù)的16.67%。12株內(nèi)生細(xì)菌中有4株同時(shí)兼具產(chǎn)IAA、鐵載體及解磷、解鉀能力，占總菌株數(shù)的33.33%，其中菌株SWFU12和SWFU34不僅具有4種促生活性且產(chǎn)IAA能力較強(qiáng)。

3 討論

3. 1 螃蟹腳可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌多樣性

植物體內(nèi)微生物資源豐富，微生物與植物存在著互利共生關(guān)系。本研究以螃蟹腳為材料，選用4種分離方法、5種分離培養(yǎng)基對(duì)螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌資源多樣性進(jìn)行研究，經(jīng)篩選后共得到52株螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌，分屬于15科22屬，表明螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌資源具有豐富的多樣性，其中短小桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，與閆曉睿等（2018）、龐發(fā)虎等（2020）在藥用植物及芒草中分離篩選出的優(yōu)勢(shì)菌屬結(jié)果一致。有研究表明不同的植物間分離出的菌群既有相似性又存在差異，且優(yōu)勢(shì)菌屬也有所不同，Su等（2011）從煙草葉片中篩選出50株內(nèi)生細(xì)菌，分別屬于9個(gè)菌屬，其中假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬;張珣等（2017）從葡萄葉片中篩選出43株內(nèi)生細(xì)菌，分屬于5個(gè)菌屬，其優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬，可能與材料本身、生長(zhǎng)環(huán)境及氣候特點(diǎn)存在一定的相關(guān)性。此外，植物內(nèi)環(huán)境的不同也會(huì)影響其體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)而對(duì)微生物群落變化有較大影響（Nelson，2004），因此，螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌菌屬多樣性的影響因素還有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，采用不同的培養(yǎng)基和不同的分離方法從螃蟹腳中分離的內(nèi)生細(xì)菌菌屬數(shù)表現(xiàn)為4號(hào)培養(yǎng)基>5號(hào)培養(yǎng)基>2號(hào)培養(yǎng)基>1號(hào)培養(yǎng)基= 3號(hào)培養(yǎng)基，菌株數(shù)為4號(hào)培養(yǎng)基>5號(hào)培養(yǎng)基>1號(hào)培養(yǎng)基>2號(hào)培養(yǎng)基>3號(hào)培養(yǎng)基，菌屬數(shù)為Z法>S法>L法=X法，菌株數(shù)為Z法>L法>S法>X法，與吳慶珊等（2018）在金釵石斛中采用不同分離培養(yǎng)基及分離方法的研究結(jié)果有所差異，可能是由于不同植物的菌種資源具有差異性。吳慶珊等（2018）發(fā)現(xiàn)碳源豐富的培養(yǎng)基能更好地提高金釵石斛內(nèi)生細(xì)菌分離的多樣性;而孫磊等（2009）發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)貧乏的R2A培養(yǎng)基對(duì)春蘭根的內(nèi)生細(xì)菌分離效果較好，這主要是由于春蘭根生長(zhǎng)的環(huán)境營(yíng)養(yǎng)相對(duì)貧乏，貧營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基更適合其內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)（Aagot et al.，2001），說(shuō)明不同的分離培養(yǎng)基對(duì)分離所得菌屬的多樣性也存在一定影響。本研究中所分離出的代爾夫特菌屬、腸桿菌屬和藤黃色桿菌屬等特殊菌屬僅能從部分分離方法和分離培養(yǎng)基中獲得，可能是由于懸浮法采用稀釋10倍上清以及4號(hào)和5號(hào)培養(yǎng)基中含有豐富的碳源成分，更加符合螃蟹腳原生態(tài)生長(zhǎng)環(huán)境（金玉潔和何國(guó)慶，2020），適宜其內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)。因此，針對(duì)不同的材料進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離時(shí)，應(yīng)根據(jù)材料生長(zhǎng)環(huán)境有針對(duì)性地選擇適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，以此可獲得豐富的內(nèi)生細(xì)菌。

3. 2 螃蟹腳可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌促生活性

植物內(nèi)生菌長(zhǎng)期與宿主植物生活在一起，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有直接或間接的促進(jìn)作用以及促進(jìn)植物產(chǎn)生抗逆性等，目前探究?jī)?nèi)生細(xì)菌的促生能力已成為研究熱點(diǎn)之一（Khan et al.，2020）。本研究對(duì)12株具ACC脫氨酶活性的螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行產(chǎn)IAA、鐵載體及解磷、解鉀能力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)具有促生活性的菌株所占比例較高，其中以假單胞菌屬菌株SWFU12和SWFU34相對(duì)其他菌株具有更高的促生活性，與張鵬等（2020）從七葉一枝花根中分離出的具促生活性高的菌屬研究結(jié)果一致。此外，促生活性最好的假單胞菌屬SWFU34菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中近緣菌株康氏假單胞菌（Pseudomonas costantinii）（NR025164.1）16S rRNA序列的相似性為99%，且已有研究表明康氏假單胞菌具有抗病性等作用（Munsch et al.，2002），據(jù)此推測(cè)菌株SWFU34可能具有相似的功能，可為后續(xù)螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌抗病方面的研究打下基礎(chǔ)。

據(jù)報(bào)道，一些假單胞屬菌株具有很好的促進(jìn)植物生長(zhǎng)和防治病害等作用，現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)（Jordan et al.，2016），如Babu等（2015）從芒草根部分離的促生細(xì)菌假單胞菌能提高芒草的生物量;陽(yáng)湖榮等（2019）從藥用植物白術(shù)中分離的內(nèi)生細(xì)菌中分別有25、19和35株具有解磷、解鉀及產(chǎn)IAA能力，其中假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，能促進(jìn)組培苗的生長(zhǎng)。研究表明部分植物內(nèi)生細(xì)菌具有與寄主相同或相似的代謝產(chǎn)物（楊鎮(zhèn)和曹君，2016），螃蟹腳因其獨(dú)特的寄生生境，其根部伸入寄主體內(nèi)，其內(nèi)生細(xì)菌可能大部分來(lái)自寄主古茶樹(shù)，螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌具體功能與作用還有待深入探究

綜上所述，從螃蟹腳中分離的內(nèi)生細(xì)菌短小桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，假單胞菌屬的促生活性綜合表現(xiàn)較好，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、產(chǎn)生抗病性等潛力。本研究初步分離鑒定了螃蟹腳的內(nèi)生細(xì)菌及測(cè)定其促生活性，為下一步內(nèi)生細(xì)菌與植物互作關(guān)系及抗病機(jī)理方面的研究打下理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

螃蟹腳內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的種屬多樣性及具促生活性微生物，其中短小桿菌屬為本研究分離篩選的優(yōu)勢(shì)菌屬，假單胞菌屬菌株SWFU34的促生活性最突出，具有農(nóng)業(yè)應(yīng)用的潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）