一株侵染掌葉半夏的大豆花葉病毒的全基因組序列測定和vsiRNA特征分析

胡逸超 盧曉靜 李璞 廖詠梅 何新華 鄒承武 陳琦

摘要：【目的】探究侵染掌葉半夏（Pinellia pedatisecta）的大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus，SMV）衍生的干擾小RNA（virus-derived small interfering RNA，vsiRNA）序列特征，為掌葉半夏抵御病毒的作用機(jī)制研究提供參考?！痉椒ā恳砸恢陙碜詮V西的具有典型病毒病癥狀的掌葉半夏為材料，取其褪綠斑駁的葉片采用TRIzol法提取總RNA，并進(jìn)行小RNA深度測序（Small RNA Deep Sequencing）;利用快速擴(kuò)增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）和分段克隆技術(shù)獲得病毒的全長基因組序列，利用MEGA 7.0將其與有代表性的病毒序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹并分析親緣關(guān)系;以克隆測序獲得的基因組序列作為參考進(jìn)行vsiRNA特征分析。【結(jié)果】小RNA深度測序共獲得4851249條高質(zhì)量的讀段（reads），長度為21、22和24 nt的reads具有較高的豐度，占比分別為33.4%、13.7%和11.3%。該病毒分離物的基因組全長為9735 nt，編碼3105個(gè)氨基酸，其基因組全序列與SMV HZ1分離物核苷酸序列相似性為86.93%，暫命名為SMV NN;系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，SMV NN與分離自半夏的SMV HZ1分離物的親緣關(guān)系最近。將vsiRNA定位到克隆測序后獲得的SMV NN的基因組上，分析該病毒的vsiRNA特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長度為21和22 nt的vsiRNA具有較高的豐度，病毒全基因組的正鏈和負(fù)鏈均能被vsiRNA覆蓋，且分別在HC-Pro和P3蛋白編碼區(qū)具有最強(qiáng)熱點(diǎn)。【結(jié)論】掌葉半夏主要通過dicer樣核糖核酸酶4（dicer-like ribonuclease 4，DCL4）和Argonaute蛋白1（Argonaute1，AGO1）對SMV的HC-Pro和P3蛋白編碼區(qū)進(jìn)行剪切，主要產(chǎn)生長度為21和22 nt的vsiRNA，從而抑制SMV在植株體內(nèi)的復(fù)制。

關(guān)鍵詞： 掌葉半夏;病毒基因組;大豆花葉病毒;小RNA深度測序;vsiRNA

中圖分類號(hào)： S432? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）12-3392-08

Characterization of virus-derived small interfering RNAs and complete sequence of a strain of Soybean mosaic virus

infected Pinellia pedatisecta

HU Yi-chao1， LU Xiao-jing2，3， LI Pu4， LIAO Yong-mei2， HE Xin-hua2，

ZOU Cheng-wu2*， CHEN Qi4*

（1Technical Center，China Tobacco Guangxi Industrial Co.， Ltd.， Nanning? 530001， China; 2 National Demonstration Center for Experimental Plant Science Education， College of Agriculture， Guangxi University， Nanning? 530004， China; 3Nanning Center for Disease Control and Prevention， Nanning? 530023， China; 4Nanning Gold-tech

Bio-science Co.， Ltd.， Nanning? 530001， China）

Abstract：【Objective】To illuminate the virus silencing mechanism in Pinellia pedatisecta， performed an analysis of the sequence characteristics of virus-derived small interfering RNA （vsiRNA） in a Soybean mosaic virus （SMV） infec-ting P. pedatisecta. 【Method】In this study， a plant of P. pedatisecta， which displayed typical virus infection symptoms， was found in Guangxi. The total RNA of the chlorotic and mottled leaves was extracted using the TRIzol method. A small RNA deep sequencing was employed to identify the vsiRNA. The full-length genome sequence of the virus was obtained by rapid amplification of cDNA ends （RACE） and segmented cloning. The phylogenetic relationships of the assembled virus sequence was analyzed using MEGA 7.0? software. The characterization of vsiRNA was performed using the cloned genome as a reference sequence. 【Result】In total， 4851249 high-quality reads， in which the relatively rich reads were 21， 22， and 24 nt with the percentage of 33.4%， 13.7% and 11.3%， respectively， were obtained by small RNA deep sequencing. According to the small RNA sequencing results， the full-length genome sequence cloning of the virus was carried out. The virus genome was found to be 9735 nt in length， encoding a polyprotein that contained 3105 amino acids. Sequence analysis showed that the nucleotide sequence of the virus isolate genome shared 86.93% identical identity with the SMV HZ1 isolate. This virus isolate was named SMV NN tentatively. The phylogenetic relationship anlysis revealed that the SMV NN shared the closest genetic relation with the SMV HZ1 isolated from P. ternate. The small RNAs of the virus were mapped to the genome of SMV NN for vsiRNA characterization. The results showed that the vsiRNA with lengths of 21 nt and 22 nt was in high abundance; both positive and negative virus vsiRNA could cover the entire virus genome and had the strongest hot spots in the HC-Pro and P3 protein-coding regions， respectively. 【Conclusion】P. pedatisecta mainly uses dicer like ribonuclease 4 （DCL4） and Argonaute1 （AGO1） to cleave the HC-Pro and P3 domain of SMV， and mainly produces vsiRNA with the lengths of 21 nt and 22 nt， resulting in the inhibition of SMV replication in plants.

Key words： Pinellia pedatisecta; rirus genome; Soybean mosaic virus; small RNA deep sequencing; vsiRNA

Foundation item： Guangxi Innovation Driven Development Special Project （Major Science and Technology Proje-cts） （Guike AA17204054）; Project of China Tobacco Guangxi Industrial Company （Keji 20190029）

0 引言

【研究意義】掌葉半夏（Pinellia pedatisecta）是我國特有的天南星科（Araceae）植物，其藥材名為虎掌，具有鎮(zhèn)痛、抗驚厥和治療心血管疾病等多種功效（Lin et al.，2007;劉寨東等，2009;Wang et al.，2019）。掌葉半夏分布于我國大部分地區(qū)，近年來快繁技術(shù)的發(fā)展極大地促進(jìn)了半夏種植面積的快速擴(kuò)大（張庚等，2017）。但隨著掌葉半夏病毒性病害的日益凸現(xiàn)，其產(chǎn)量和質(zhì)量受到不同程度的影響。掌葉半夏以無性繁殖為主，病毒一旦侵染將會(huì)不斷積累，可使葉片出現(xiàn)花葉、褪綠斑駁、皺縮、植株矮化甚至壞死等癥狀，嚴(yán)重影響植株生長，長此以往將會(huì)造成植物種質(zhì)退化（解紅娥等，2005;李會(huì)等，2016）。深入研究掌葉半夏的病原病毒種類和病毒衍生的干擾小RNA（virus-derived small interfering RNA，vsiRNA）特征，將為掌葉半夏沉默病毒的作用機(jī)制研究提供重要參考，為掌葉半夏病毒病防治提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】RNA沉默在植物抵御病毒入侵過程中起著關(guān)鍵作用（Zhao et al.，2020）。RNA病毒是RNA沉默機(jī)制的強(qiáng)烈誘導(dǎo)物，具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的區(qū)域通過病毒編碼的RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）合成，成為復(fù)制中間產(chǎn)物，進(jìn)而作為病毒相關(guān)模式分子被DCL（Plant Dicer-like）與AGO（Argonaute）識(shí)別并剪切成21～24 nt的vsiRNA（Pumplin and Voinnet，2013;Li and Wang，2018）。RNA沉默具有信號(hào)放大的機(jī)制，22 nt的病毒小RNA與單鏈病毒RNA互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，通過宿主編碼的RdRp進(jìn)行RNA延伸，生成可以被剪切為次級vsiRNA的dsRNA（Chen et al.，2010）。2種vsiRNA均可與AGO蛋白結(jié)合通過轉(zhuǎn)錄后途徑（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）引導(dǎo)RNA沉默，但以次級vsiRNA為主通過核酸互補(bǔ)形成貫穿植物體的剪切信號(hào)，為植物提供有效的保護(hù)（Schwach et al.，2005;Ramesh et al.，2021）。在擬南芥中dicer樣核糖核酸酶4（dicer-like ribonuclease 4，DCL4）、DCL2和DCL3分別負(fù)責(zé)生成21、22和24 nt的vsiRNA，DCL4最先起作用，同時(shí)也被認(rèn)為是RNAi中最活躍的作用者，其所生成的21 nt vsiRNA在感染RNA病毒的植物中一般占絕大多數(shù)（Ding and Voinnet，2007）。研究人員對DCL4進(jìn)行突變后，DCL2的作用增強(qiáng)，生成更多22 nt的vsiRNA，說明22 nt vsiRNA在對抗病毒的過程中具有特定作用（Bouché et al.，2006）。但22 nt的vsiRNA并不能引導(dǎo)RNA病毒高效剪切（Wang et al.，2011）。目前認(rèn)為22 nt的vsiRNA主要在次級vsiRNA產(chǎn)生過程中發(fā)揮作用（Chen et al.，2010;Wang et al.，2018）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】小RNA深度測序（Small RNA Deep Sequencing）作為高通量測序技術(shù)的重要應(yīng)用，可同時(shí)獲得病毒和宿主的小RNA序列，是研究RNA沉默機(jī)制的有效工具。隨著小RNA深度測序深度的不斷發(fā)展，小RNA深度測序數(shù)據(jù)高度重疊，并能組裝得到病毒全長，其在病毒的鑒定和新病毒的發(fā)現(xiàn)方面具有廣闊的前景（Wu et al.，2010）。一些模式生物的研究顯示，vsiRNA具有獨(dú)特的特征，是病毒入侵的重要標(biāo)志（Li et al.，2013;Miozzi et al.，2013;Niu et al.，2017）。然而，目前采用小RNA深度測序開展掌葉半夏的研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以一株來自廣西的具有典型病毒病癥狀的掌葉半夏為研究對象，通過小RNA深度測序，對其vsiRNA特征進(jìn)行深入分析，以期為掌葉半夏抵御病毒的作用機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 供試材料

供試的疑似病毒病掌葉半夏（P. pedatisecta）樣品采集自廣西藥用植物園，癥狀表現(xiàn)為葉片褪綠斑駁。主要試劑：TRIzol和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（GeneRulerTM 1 kb Puls DNA ladder）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;TruSeq Small RNA Library Preparation Kits購自Illumina公司;PrimeScriptTM第一鏈cDNA合成試劑盒、Ex TaqTM DNA聚合酶、Clonetech SMARTer RACE 5'/3'試劑盒和pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司;膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本課題組制備保存。引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設(shè)備：5310高速離心機(jī)（Eppendorf，德國）、HiSeq 2500測序儀（Illumina，美國）、ProFlex PCR儀（Thermo Fisher，美國）、PCR儀（杭州博日科技股份有限公司）、電泳系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司）和GBOX-HR全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（Syngene，英國）。

1. 2 總RNA提取和小RNA深度測序分析

采用TRIzol法提取掌葉半夏樣品的總RNA，樣品檢測合格后委托廣西普斐信息科技有限公司進(jìn)行小RNA深度測序和數(shù)據(jù)分析。主要建庫測序和數(shù)據(jù)分析流程包括：參考小RNA文庫制備指南（TruSeq Small RNA Library Preparation Reference Guide，https：//support.illumina.com/sequencing/sequencing_ kits/truseq-small-rna-kit/documentation.html）中描述的方法構(gòu)建小RNA測序文庫，文庫質(zhì)量檢測合格后使用Hiseq 2500平臺(tái)（Illumina，美國）進(jìn)行測序;采用CLC genomic workbench 12.0（Qiagen，德國）中的Trimming程序去除測序結(jié)果中質(zhì)量值低于Q30、含有5'接頭和測序引物及不含有3'接頭的讀段（reads），以及<15 nt和>30 nt的reads;使用CLC geno-mic workbench 12.0中的從頭組裝（Denovo assembly）算法對高質(zhì)量reads進(jìn)行組裝，k-mer值設(shè)為17，使用映射（mapping）reads到參考序列的工具將組裝獲得的鄰接片段（Contigs）定位到病毒參考序列;高質(zhì)量的reads采用RNA-Seq分析工具映射到病毒的基因組上，允許2個(gè)堿基錯(cuò)配;對vsiRNA進(jìn)行長度分布統(tǒng)計(jì)、極性分布分析、5'端起始堿基偏好性分析及熱點(diǎn)區(qū)分布分析。

1. 3 病毒基因組全長序列克隆

參考小RNA測序的組裝結(jié)果與序列一致性最高的病毒參考基因組序列的保守區(qū)，使用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)引物，引物序列如表1所示，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行引物合成。以提取的病樣總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR分段擴(kuò)增病毒基因組。PCR擴(kuò)增體系20 ?L：cDNA模板1 ?L，2×Ex Taq Master Mix 10 ?L，正、反向引物各1 ?L，ddH2O補(bǔ)足至20 ?L。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 15 s，55～65 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行30次循環(huán)。所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用快速擴(kuò)增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)克隆病毒cDNA末端序列，具體操作參考Clonetech SMARTer RACE產(chǎn)品說明書（https：//www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/race-kits/smarter-5-race-and-3-race）。切膠回收符合預(yù)期大小的目標(biāo)PCR產(chǎn)物，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的DNA片段，進(jìn)行TA克隆并將陽性克隆進(jìn)行序列測定。將獲得的病毒序列進(jìn)行拼接獲得病毒的基因組全長序列。

1. 4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

將克隆獲得的侵染掌葉半夏的病毒全長基因組序列在NCBI網(wǎng)站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）利用基本局部對齊搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool）進(jìn)行核苷酸序列比對分析，獲得病毒的核苷酸序列一致性信息，選擇有代表性的病毒序列信息，利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并分析其親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2. 1 小RNA深度測序和病毒種類鑒定結(jié)果

小RNA深度測序共獲得14500000條長度為35 bp左右的reads，使用嚴(yán)格的參數(shù)對測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評估和篩選，獲得4851249條高質(zhì)量的reads，其中長度為21、22和24 nt的reads具有較高的豐度，分別占所有高質(zhì)量序列的33.4%、13.7%和11.3%（圖1-A）。已報(bào)道的植物內(nèi)生小RNA深度測序結(jié)果顯示，芥菜（Brassica juncea）中21 nt的reads最多（Ho et al.，2007），擬南芥（Arabidopsis thaliana）24 nt的reads最多（Wang et al.，2011），而在本氏煙（Nicotiana benthamiana）中22 nt的reads最多（Mitter et al.，2013）。不同的植物所產(chǎn)生的小RNA在長度分布各具特點(diǎn)，其原因可能是自身RNA沉默機(jī)制不同所至。由于目前尚無來源于掌葉半夏的病毒全基因組序列信息，不能直接以基因組序列作為參考提取與其同源的reads。為獲得來源于病毒的reads，本研究將所有高質(zhì)量reads與GenBank的病毒核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)比對上的reads在21和22 nt處具有最高豐度，而24 nt的reads數(shù)量超過22 nt的reads，但大都沒有比對上病毒序列（圖1-B）。

對所有高質(zhì)量reads進(jìn)行組裝，獲得792條長度大于50 bp的Contigs，將這些Contigs與GenBank的病毒核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核苷酸序列比對（BLASTn），結(jié)果發(fā)現(xiàn)有109條Contigs的與大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus，SMV）具有較高的序列一致性，說明SMV是這株掌葉半夏的主要病原病毒。使用SMV G7分離物（登錄號(hào)AY216010.1）的全基因組作為參考序列，將組裝獲得的Contigs定位到參考序列，能不連續(xù)覆蓋G7的73%序列，且在5'末端具有一個(gè)1066的空缺，說明侵染掌葉半夏的SMV在5'可能存在較大變異（圖1-C）。

2. 2 SMV廣西分離物的全長克隆

為獲得侵染掌葉半夏的SMV的全基因組序列，根據(jù)小RNA深度測序組裝得到的病毒序列信息及其在參考基因組上的定位結(jié)果設(shè)計(jì)引物，使用RT-PCR、5' RACE和3' RACE技術(shù)對其全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增和克隆，并采用Sanger法進(jìn)行序列測定。結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)的3對引物分別擴(kuò)增得到長度為2765、2705和2528 bp的3個(gè)片段，末端序列采用5' RACE和3' RACE技術(shù)分別獲得1296和604 bp的片段。組裝獲得其全基因組長度為9735 nt，不包括Poly（A）的長度。該病毒基因組包含一個(gè)長為9315 nt的開放閱讀框架（Open Reading Frame，ORF），編碼一個(gè)包含3105個(gè)氨基酸的多聚蛋白，符合馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的典型特征。

經(jīng)BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其與SMV HZ1分離物（登錄號(hào)AJ628750）的核苷酸序列相似性最高，為86.93%。因此，將侵染掌葉半夏的SMV南寧分離物暫命名為SMV NN，其基因組序列已提交GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫（登錄號(hào)KF982784.1）。使用SMV NN全基因組序列與SMV的其他代表性分離物（表2）一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)其與分離自半夏的SMV HZ1分離物的親緣關(guān)系最近，而且來源于半夏的SMV分離物聚在一個(gè)分支，來源于大豆的SMV分離物聚在另外一個(gè)分支（圖3）。

2. 3 SMV的vsiRNA特征分析

以克隆測序獲得的SMV NN分離物的基因組作為參考序列，將所有高質(zhì)量reads進(jìn)行mapping分析，發(fā)現(xiàn)有237864條reads能mapping到SMV NN的基因組上，占所有高質(zhì)量reads的4.9%。來自于SMV NN的vsiRNA中幾乎都是21和22 nt，分別占所有vsiRNA的75.4%和19.6%（圖4）。

vsiRNAs是通過Dcr-2蛋白處理病毒基因組復(fù)制期間形成的dsRNA所生成，在較小程度上是通過病毒轉(zhuǎn)錄生成（Marques et al.，2013）。為進(jìn)一步明確Dcr-2蛋白對病毒dsRNA的作用方式，本研究對SMV NN 21 nt vsiRNA 5'末端堿基進(jìn)行分析，其中U、A和C分別占43.9%、27.7%、20.6%。對序列分布情況分析發(fā)現(xiàn)，正鏈和負(fù)鏈vsiRNA均能覆蓋SMV NN的基因組，分別占比對上的讀段（Mapped reads）的59.9%和40.1%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)vsiRNA在病毒大部分蛋白編碼區(qū)均具有熱點(diǎn)，而且正鏈和負(fù)鏈vsiRNA分別在HC-Pro與P3蛋白編碼區(qū)內(nèi)具有覆蓋度超過5000倍的熱點(diǎn)。

3 討論

隨著第二代測序技術(shù)的進(jìn)步和測序成本的降低，小RNA深度測序的應(yīng)用越來越廣泛，并在病毒鑒定和新病毒發(fā)現(xiàn)等方面做出了巨大貢獻(xiàn)。多個(gè)研究表明，使用小RNA深度測序可發(fā)現(xiàn)新病毒并組裝出新病毒的全基因組序列（Wu et al.，2010;Niu et al.，2017）。但由于vsiRNA較短，通過Denovo組裝獲取完整病毒基因組序列仍存在挑戰(zhàn)性。同時(shí)，由于病毒變異快和高通量測序的誤差等原因，通過新開發(fā)的專門針對小RNA組裝的算法獲得的組裝結(jié)果也不理想，而且通過比對與組裝等方法所得到的病毒序列還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但是，即使不能組裝出完整的病毒基因組，仍可使用RT-PCR和RACE技術(shù)獲得其全長序列。小RNA深度測序結(jié)合常規(guī)克隆測序的方法不依賴高質(zhì)量組裝，適用性也更廣，降低了獲取病毒基因組全長序列的難度，是鑒定和發(fā)現(xiàn)新病毒的有效途徑。本研究結(jié)合小RNA深度測序及常規(guī)的病毒序列克隆測序技術(shù)，相互完善互補(bǔ)，所獲得的病毒基因組序列較完整，為分析vsiRNA提供了很好的基礎(chǔ)。幾乎全部vsiRNA均能mapped到病毒基因組上也說明所獲序列的完整性。

目前的研究表明，vsiRNA具有的特征是宿主和病毒相互作用的結(jié)果（Pooggin，2018）。不同病毒的vsiRNA特征不同，侵染不同宿主后vsiRNA特征也會(huì)發(fā)生改變，通過vsiRNA特征的研究，可揭示病毒與宿主相互作用深層次的作用機(jī)理（Pooggin，2018）。研究發(fā)現(xiàn)，去除病毒相關(guān)的reads后，其reads分布與未受蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）侵染的芥菜中的reads分布相似，而未去除病毒相關(guān)reads的情況則與芥菜受TuMV侵染后的reads分布類似，但2種分布情況與在大豆受SMV侵染后小RNA的研究中發(fā)現(xiàn)的reads分布情況不符，其原因尚不清楚（Ho et al.，2007;Yin et al.，2013）。但這些宿主侵染馬鈴薯Y病毒后21和22 nt的reads均大幅增加，可能是植物感染馬鈴薯Y病毒的共同特征，同時(shí)21與22 nt reads的顯著增加可能是RNA病毒侵染和植物抗病毒機(jī)制啟動(dòng)的明顯標(biāo)志。

21 ntvsiRNA被認(rèn)為是DCL4與AGO蛋白的產(chǎn)物，而22 nt vsiRNA被認(rèn)為是 DCL2與AGO的產(chǎn)物，同時(shí)21 nt vsiRNA引導(dǎo)RNA病毒的高效剪切（Ho et al.，2007;Wang et al.，2011）。但侵染擬南芥的蘭花環(huán)斑病毒（Cymbidium ringspot virus）和馬鈴薯X病毒（Potato virus X）卻是22 nt的vsiRNA最多，其原因可能是這些病毒具有抵抗RNA剪切的機(jī)制，從而抑制了DCL4的剪切，蘭花環(huán)斑病毒中的P19蛋白被證明通過與vsiRNA結(jié)合而具有抗RNA沉默的作用（Lakatos et al.，2004;Donaire et al.，2009）。SMV NN侵染掌葉半夏所產(chǎn)生的21 nt vsiRNA最多，說明DCL4可能是主要作用者。AGO蛋白具有5'末端的偏好性，與21 nt vsiRNA作用的Argonaute蛋白1（Argonaute1，AGO1）、AGO2和AGO5分別在5'末端具有U、A、C的偏好性（Mi et al.，2008）。對SMV NN 21 nt vsiRNA 5'末端堿基進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)U、A和C 3種堿基均存在，且比例均大于20%，其中U堿基的比例最高，說明掌葉半夏對SMV NN的剪切可能有多種AGO蛋白參與，其中AGO1可能起主要作用。vsiRNA在SMV NN上的分布較廣，涉及病毒大部分蛋白編碼區(qū)，說明掌葉半夏RNA沉默機(jī)制可對SMV大多數(shù)蛋白編碼區(qū)域進(jìn)行剪切。特別在HC-Pro與P3蛋白編碼區(qū)內(nèi)，具有覆蓋度超過5000倍的熱點(diǎn)，表明掌葉半夏對HC-Pro與P3蛋白編碼區(qū)域具有強(qiáng)烈的剪切作用，可能與掌葉半夏對抗SMV反RNA沉默的機(jī)制有關(guān)，與Eggenberger等（2008）報(bào)道的HC-Pro蛋白具有抵抗RNA沉默的功能，而P3和HC-Pro共同對SMV的毒力產(chǎn)生影響的結(jié)論一致。

一些病毒蛋白具有保護(hù)病毒RNA免于RNA剪切的功能，馬鈴薯Y病毒中HC-Pro可抑制RNA沉默，促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)的長距離移動(dòng)，而P3和HC-Pro同時(shí)影響病毒的毒力（Kasschau et al.，2003;Eggenberger et al.，2008）。江彤等（2013）的HC-Pro設(shè)計(jì)RNA干擾載體試驗(yàn)證明了P3和HC-Pro在RNA沉默中的作用。因此，根據(jù)掌葉半夏SMV vsiRNA的熱點(diǎn)可有效設(shè)計(jì)RNA沉默載體，從而對掌葉半夏SMV病進(jìn)行防治。馬鈴薯Y病毒通過衣殼將正鏈RNA包被起來，起到保護(hù)作用，SMV正鏈vsiRNA多于負(fù)鏈，可能在病毒表達(dá)過程中，正鏈具有更重要的作用，因此宿主對其剪切作用更強(qiáng)。然而病毒的負(fù)鏈能作為正鏈復(fù)制的模板，負(fù)鏈的斷裂會(huì)影響病毒的復(fù)制。本研究發(fā)現(xiàn)vsiRNA在SMV負(fù)鏈P3區(qū)域具有非常強(qiáng)的熱點(diǎn)，占所有負(fù)鏈vsiRNA的9.4%。在SMV多樣性研究中，P3區(qū)域的氨基酸序列高度保守（Seo et al.，2009）。推測掌葉半夏可能通過剪切SMV保守的負(fù)鏈P3區(qū)域以抑制SMV的復(fù)制。

4 結(jié)論

利用小RNA深度測序技術(shù)結(jié)合RACE和分段克隆測序技術(shù)獲得侵染掌葉半夏的SMV NN分離物的病毒全基因組序列，分析發(fā)現(xiàn)感染SMV的掌葉半夏在沉默病毒過程中所產(chǎn)生vsiRNA的長度主要為21和22 nt，表明其對病毒起主要剪切作用的為DCL4;vsiRNA的5末端偏好性分析發(fā)現(xiàn)，AGO1可能為掌葉半夏抑制SMV復(fù)制的主要作用蛋白;vsiRNA熱點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)掌葉半夏主要對SMV的HC-Pro和P3蛋白編碼區(qū)起主要剪切作用。研究結(jié)果可為深入認(rèn)識(shí)掌葉半夏沉默病毒的作用機(jī)制提供參考。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）