西瓜OSCA基因家族全基因組鑒定及脅迫響應(yīng)分析

張瑜 吳才君 蘇文楨 周聰 滕麗姚 涂志偉 朱強(qiáng)龍

摘要：【目的】對(duì)西瓜OSCA基因家族進(jìn)行成員鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析以及脅迫響應(yīng)分析，為揭示西瓜OSCA基因生物學(xué)功能和抗逆分子機(jī)制提供參考依據(jù)?！痉椒ā窟\(yùn)用生物信息學(xué)的方法從西瓜全基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出西瓜OSCA基因家族成員，根據(jù)染色體定位信息進(jìn)行命名。對(duì)基因家族成員染色體位置、基因結(jié)構(gòu)、共線性、啟動(dòng)子、蛋白結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等進(jìn)行全面分析。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR分析西瓜OSCA基因在脅迫條件下的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】西瓜OSCA基因家族有10個(gè)成員，不均等地分布在6條染色體上。西瓜OSCA蛋白分子量變化范圍為24.59～91.97 kD，氨基酸數(shù)量為214～809 aa，多數(shù)定位于質(zhì)膜上。共線性分析結(jié)果表明，西瓜OSCA基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了片段復(fù)制事件。西瓜OSCA基因家族分為三大類群，同一類群成員的外顯子一內(nèi)含子的組成模式、蛋白保守基序排列、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)量比例和蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型均相似。西瓜、水稻、番茄和擬南芥的OSCA基因被分為6個(gè)亞族，每個(gè)亞族均有西瓜OSCA基因分布。西瓜OSCA基因啟動(dòng)子區(qū)域含有厭氧誘導(dǎo)、冷脅迫應(yīng)答、光反應(yīng)和干旱脅迫應(yīng)答等多種非生物脅迫響應(yīng)元件。在干旱、低溫和鹽脅迫下，西瓜OSCA基因家族各成員表達(dá)量均有不同程度變化，其中ClaOSCA3和ClaOSCA5在3種不同脅迫條件下表達(dá)量均有顯著差異（P<0.05）?！窘Y(jié)論】西瓜OSCA基因在進(jìn)化過程中具有一定保守性，與擬南芥、水稻和番茄OSCA基因存在較近親緣關(guān)系。西瓜OSCA基因家族內(nèi)部存在功能分化，ClaOSCA3和ClaOSCA5可能是脅迫響應(yīng)機(jī)制中的重要抗逆基因。

關(guān)鍵詞： 西瓜;OSCA基因;脅迫響應(yīng);生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)： S651? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）12-3330-10

Genome-wide identification and stress response analysis

of OSCA gene family in watermelon

ZHANG Yu， WU Cai-jun， SU Wen-zhen， ZHOU Cong， TENG Li-yao，

TU Zhi-wei， ZHU Qiang-long*

（College of Agronomy， Jiangxi Agricultural University， Nanchang? 330045， China）

Abstract：【Objective】The member identification， phylogenetic analysis and stress response analysis of watermelon OSCA gene family were carried out to provide reference for revealing the biological function and molecular mechanism of stress resistance of watermelon OSCA gene. 【Method】The members of watermelon OSCA gene family were identified by bioinformatics method from watermelon genome database， and named according to chromosome location information. Chromosome position， gene structure， collinearity， promoter， protein structure and phylogeny of gene family members were analyzed comprehensively. Transcriptome data and qRT-PCR were used to analyze OSCA gene expression in watermelon under stress. 【Result】Watermelon OSCA gene family had 10 members， which were unevenly distributed on 6 chromosomes. The molecular weight of watermelon OSCA protein varied from 24.59 to 91.97 kD， and the number of amino acids ranged from 214 to 809 aa， most of which were located in the plasma membrane. The results of collinearity analysis showed that the fragment replication event occurred during the evolution of watermelon OSCA gene. The watermelon OSCA gene family was divided into three groups， and the exon-intron composition pattern， conserved motif arrangement of protein， the number proportion of secondary structure and the tertiary structure model of the members of the same group were similar. The OSCA genes of watermelon， rice， tomato and Arabidopsis thaliana were divided into 6 subgroups， watermelon OSCA gene was distributed in each subgroup. The promoter region of OSCA gene in watermelon contained several abiotic stress response elements such as anaerobic induction， cold stress response， light response and drought stress response. Under drought， low temperature and salt stress， the expression levels of OSCA gene family members in watermelon all changed to different degrees， and the expression levels of ClaOSCA3 and ClaOSCA5 all changed significantly under three different stress conditions（P<0.05）. 【Conclusion】Watermelon OSCA gene is conserved in the evolutionary process， and is closely related to OSCA gene of A. thaliana， rice and tomato. Functional differentiation exists within the OSCA gene family in watermelon， and ClaOSCA3 and ClaOSCA5 may be important stress resistance genes in the stress response mechanism.

Key words： watermelon; OSCA gene; stress response; bioinformatics

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960607）

0 引言

【研究意義】植物OSCA是一種能感知細(xì)胞滲透勢(shì)變化的鈣離子非選擇性陽離子通道蛋白，在感受機(jī)制中調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以應(yīng)對(duì)自然界中各種不利環(huán)境條件（Zhu，2002;Bartels and Sunkar，2005）。西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.） Matsum. et Nakai]是富含多種維生素的夏季水果，市場需求量不斷增加，抗逆育種研究是我國西瓜產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)研究的重要內(nèi)容（王超楠等，2018）。研究西瓜OSCA基因的功能及脅迫響應(yīng)分子機(jī)制對(duì)培育優(yōu)良抗逆西瓜品種有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物在生長發(fā)育過程中，會(huì)受到自然界中許多不良環(huán)境因素的影響。其中干旱、低溫、高溫和鹽等非生物脅迫會(huì)使得植物難以維持正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和離子平衡。在嚴(yán)重的逆境脅迫情況下，植物的生理機(jī)制會(huì)受到嚴(yán)重破壞。在植物應(yīng)對(duì)外界不良環(huán)境條件的保衛(wèi)機(jī)制中，作為第二信使的鈣離子會(huì)在鈣離子通道被激活后濃度快速升高，形成應(yīng)激的鈣離子信號(hào)。鈣離子信號(hào)在下游轉(zhuǎn)移過程中調(diào)控植物細(xì)胞產(chǎn)生一系列的生理變化（李建偉等，2017），誘導(dǎo)出植物的抗逆性來應(yīng)對(duì)外界的非生物脅迫（朱強(qiáng)龍等，2017），使得植物的生命系統(tǒng)繼續(xù)正常運(yùn)轉(zhuǎn)。鈣信號(hào)的傳導(dǎo)與植物體中鈣離子通路蛋白密切相關(guān)，2014年鈣離子通道蛋白OSCA首次在模式植物擬南芥中被發(fā)掘報(bào)道（Yuan et al.，2014）。鈣離子通道蛋白在擬南芥中參與高滲脅迫響應(yīng)（Batistic and Kudla，2012;Hou et al.，2014）。在前人對(duì)擬南芥OSCA基因家族進(jìn)行的系統(tǒng)分析與鑒定中，基因家族分為4個(gè)亞族，15個(gè)家族成員均含DUF221功能結(jié)構(gòu)域，在干旱或高鹽等高滲脅迫下，DUF221作為鈣離子依賴性通道的結(jié)構(gòu)域發(fā)揮著重要作用。此外，OSCA基因被分別在水稻（Li et al.，2015）、梨（顧小雨，2017）等植物中鑒定和分析，驗(yàn)證了OSCA基因在不同脅迫響應(yīng)中的生物學(xué)功能。【本研究切入點(diǎn)】目前為止，尚未見關(guān)于運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)西瓜等葫蘆科植物OSCA基因進(jìn)行分析的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于西瓜全基因組數(shù)據(jù)庫運(yùn)用生物信息學(xué)的方法鑒定出OSCA基因家族成員，對(duì)西瓜OSCA基因的特征進(jìn)行全面分析，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)西瓜OSCA基因在不同脅迫條件下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，篩選出重要抗逆基因并通過qRT-PCR對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，為西瓜OSCA基因生物學(xué)功能研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院保存的LSW-177西瓜品種為試驗(yàn)材料，對(duì)四葉一心的LSW-177西瓜幼苗分別進(jìn)行干旱（20% PEG6000）、低溫（4 ℃）和鹽（3 mmol/L KCl）脅迫處理。在處理后的0和6 h分別對(duì)西瓜幼苗的第2片真葉進(jìn)行采樣，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，將樣品用液氮速凍后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1. 2 西瓜OSCA基因家族成員鑒定

在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫TAIR獲取擬南芥OSCA基因家族的氨基酸序列，并將其作為參考序列，與葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫（http：//cucurbitgenomics.org/）中的西瓜全基因組氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)（E-value小于1e-10，Identity大于60%）（朱強(qiáng)龍等，2017），篩選得到符合標(biāo)準(zhǔn)的西瓜OSCA家族候選基因。運(yùn)用生信軟件TBtools中的Simple HMM Search功能輸出得到西瓜OSCA基因家族候選基因（Chen et al.，2020），與Blast分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì)后篩查矯正，利用PFAM（http：//pfam.xfam.org/）對(duì)候選基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，含完整DUF221結(jié)構(gòu)域的候選基因?yàn)槲鞴螼SCA基因家族成員。利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析西瓜OSCA基因家族成員的蛋白序列，獲取蛋白理化信息，通過Softberry的ProtComp程序?qū)ξ鞴螼SCA蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1. 3 染色體定位、共線性及選擇壓力分析

在西瓜基因組數(shù)據(jù)庫中獲取OSCA基因位置信息后使用MapGene2繪制染色體定位圖，利用TBtools對(duì)西瓜OSCA基因家族進(jìn)行共線性分析，并計(jì)算重復(fù)基因?qū)χg非同義突變率與同義突變率的比值（Ka/Ks）（Wang et al.，2012），以此衡量環(huán)境選擇壓力，根據(jù)同義突變率估算重復(fù)基因?qū)Φ碾x散時(shí)間（Yuan et al.，2015），每年每個(gè)同義位點(diǎn)的替換量T=Ks/2X（X=6.56×10-9）。

1. 4 基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析

將已鑒定出的西瓜OSCA基因的核苷酸序列與編碼序列同時(shí)輸入到GSDS 2.0分析網(wǎng)站（http：//gsds.gao-lab.org/）（趙陽等，2015;Hu et al.，2015），利用MEGA 7.0內(nèi)置的ClustalW（Larkin et al.，2007）程序?qū)⒕幋a區(qū)的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重比對(duì)后（Kumar et al.，2016），采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建西瓜OSCA基因家族同源進(jìn)化樹，重復(fù)運(yùn)算1000次。整理圖形可獲取基因家族成員的內(nèi)含子與外顯子的分布情況，以及OSCA基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化關(guān)系。通過MEME（https：//meme-suite.org/meme/）對(duì)西瓜OSCA基因家族成員蛋白基序類型和排列順序進(jìn)行分析，Motif長度設(shè)置為6～50，查找Motif數(shù)量為20。

1. 5 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過TMPred和TMHMM分析西瓜OSCA蛋白的跨膜區(qū)（雷召雄等，2019），使用SOPMA分析西瓜OSCA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（趙鐘毓等，2020;趙訓(xùn)超等，2021）;通過SWISS-MODEL（https：//www.swissmo-del.expasy.org/interactive）對(duì)西瓜OSCA蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1. 6 OSCA基因系統(tǒng)進(jìn)化和順式元件利用

在Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#）數(shù)據(jù)庫下載已報(bào)道的擬南芥、水稻和番茄的OSCA蛋白序列，并與西瓜OSCA蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Bootstrap值設(shè)定為1000），使用ITOL在線網(wǎng)站（https：//itol.embl.de/）編輯美化進(jìn)化樹。提取西瓜OSCA基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000 bp長度序列，利用PlantCare分析啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件（Lescot et al.，2002）。

1. 7 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的脅迫響應(yīng)分析

從葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫下載轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（PRJNA326331、PRJNA328189和PRJNA209092），以轉(zhuǎn)錄組分析通用的RPKM值作為基因表達(dá)量，分析西瓜OSCA基因家族各成員在干旱、低溫和鹽脅迫條件下的表達(dá)情況，篩選重要抗逆OSCA基因。

1. 8 重要抗逆基因的qRT-PCR檢測(cè)

使用Promega試劑盒提取樣品RNA，cDNA的合成采用TaKaRa試劑盒。利用Primer3 Plus設(shè)計(jì)特異性引物，選擇β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參（表1）。qRT-PCR反應(yīng)體系20.0 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min;熔解曲線65 ℃ to 95 ℃，溫度增量0.5 ℃ 0.05 s，終點(diǎn)讀板。

1. 9 統(tǒng)計(jì)分析

采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，運(yùn)用Excel 2013和SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 西瓜OSCA基因家族鑒定

運(yùn)用生物信息學(xué)的方法鑒定出10個(gè)OSCA基因成員，根據(jù)染色體定位信息分別命名為ClaOSCA1～ ClaOSCA10。西瓜OSCA基因家族10個(gè)成員不均等地分布在6條染色體上，1號(hào)染色體（Chrom1）上4個(gè)，5號(hào)染色體（Chrom5）上2個(gè)。ClaOSCA9編碼氨基酸數(shù)量為214 aa，其余成員氨基酸數(shù)量范圍在714～809 aa。西瓜OSCA蛋白理化性質(zhì)的分析結(jié)果（表2）表明，蛋白分子量變化范圍為24.59～91.97 kD，ClaOSCA10的等電點(diǎn)（PI）最小，10個(gè)OSCA蛋白均為疏水的堿性蛋白，即親水系數(shù)（GRAVY）均大于0、PI均大于7.00。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，西瓜OSCA蛋白多數(shù)定位于質(zhì)膜。

2. 2 西瓜OSCA基因染色體分布及加倍事件分析

10個(gè)OSCA基因分布在1、2、5、8、9和10號(hào)染色體上（圖1），其余染色體上無OSCA基因。ClaOSCA5和ClaOSCA9在1號(hào)染色體上遺傳距離相對(duì)較近，ClaOSCA6和ClaOSCA8在5號(hào)染色體上遺傳距離相對(duì)較近。此外，西瓜OSCA基因在不同染色體組中分布不均等，表明OSCA基因在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了基因的復(fù)制或丟失。通過共線性分析發(fā)現(xiàn)，位于5號(hào)染色體的ClaOSCA6（Cla97C05G102470.1）與位于8號(hào)染色體（Chrom8）的ClaOSCA7（Cla97C08 G160460.1）存在片段重復(fù)事件（圖2），片段重復(fù)基因?qū)Φ腒s值為2.71719，分離時(shí)間在207Mya（Million years ago），Ka/Ks值為0.24741，小于1.00000，則說明西瓜OSCA基因在進(jìn)化過程中受純化選擇作用。

2. 3 西瓜OSCA基因家族基因結(jié)構(gòu)與蛋白保守基序分析

西瓜OSCA基因編碼氨基酸的多重序列比對(duì)結(jié)果（圖3）表明，在編碼序列中含有P、C、F等多個(gè)絕對(duì)保守位點(diǎn)，推測(cè)其在滲透脅迫下受到鈣離子滲透適應(yīng)力作用。此外，對(duì)西瓜OSCA基因家族基因結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果（圖4）表明，10個(gè)ClaOSCA基因主要可分為三大類群，ClaOSCA1、ClaOSCA5、ClaOSCA2、ClaOSCA3、ClaOSCA4和ClaOSCA9這6個(gè)成員為同一類群，ClaOSCA7、ClaOSCA8和ClaOSCA6歸屬同一類群，ClaOSCA10單獨(dú)為一類群。此外，ClaOSCA7、ClaOSCA8和ClaOSCA6屬于同一類群，內(nèi)含子數(shù)目接近，外顯子與內(nèi)含子的組成模式相似，表明基因結(jié)構(gòu)的保守性與基因進(jìn)化關(guān)系是基本一致的。ClaOSCA10所在類群基因的長度較短且無內(nèi)含子，屬于內(nèi)含子缺失，結(jié)合進(jìn)化樹來看ClaOSCA10基因在進(jìn)化過程中可能存在一些非必要功能的丟失。

利用MEME在西瓜OSCA基因中預(yù)測(cè)到20個(gè)基序（圖5），基因同源性越高，基序排列相似性越強(qiáng)。10個(gè)OSCA基因均含有Motif13;除ClaOSCA10外其余9個(gè)基因均含Motif2;除ClaOSCA9和ClaOSCA10外其余8個(gè)ClaOSCA基因均含Motif1;ClaOSCA1、ClaOSCA2、ClaOSCA3、ClaOSCA4、ClaOSCA5和ClaOSCA9均含Motif3;ClaOSCA1、ClaOSCA5、Cla-OSCA2和ClaOSCA4具有相似基序且排列順序相同;ClaOSCA8、ClaOSCA6和ClaOSCA7屬于同源性較高的同一類群，具有相同基序且排列順序相同。

2. 4 西瓜OSCA基因家族蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過TMHMM與TMPred的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除ClaOSCA9蛋白相對(duì)分子質(zhì)量較小外，其余ClaOSCA蛋白均具有7～10個(gè)潛在的跨膜結(jié)構(gòu)域（圖6），且西瓜OSCA蛋白均具有10種潛在的跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，表明西瓜OSCA蛋白均為膜蛋白，進(jìn)化高度保守。西瓜OSCA基因家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（表3）表明，西瓜OSCA家族基因編碼10個(gè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要是無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)和α螺旋結(jié)構(gòu)，此外在西瓜OSCA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中還有一小部分是β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和延伸鏈結(jié)構(gòu);α螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)量比例為36.45%～54.62%，延伸鏈結(jié)構(gòu)數(shù)量比例為12.00%～21.96%，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)數(shù)量比例為1.51.%～7.01%，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)數(shù)量比例為29.69%～36.58%。ClaOSCA6、ClaOSCA7和ClaOSCA8親緣關(guān)系較近，蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型高度相似，ClaOSCA5和ClaOSCA1的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型高度相似（圖7）。

2. 5 西瓜OSCA基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析和啟動(dòng)子順式作用元件分析

西瓜、擬南芥、水稻和番茄的OSCA基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果（圖8）表明，OSCA基因進(jìn)化樹主要分為6個(gè)亞族，分別命名I～Ⅵ。上述4種植物OSCA基因在6個(gè)亞族中均有分布，親緣性較近。西瓜OSCA基因家族中存在5個(gè)明顯的垂直同源基因?qū)?，分別是I亞族的ClaOSCA3與SlOSCA9，II亞族的ClaOSCA10與SIOSCA4，Ⅲ亞族的ClaOSCA6與SIOSCA1，Ⅳ亞族的ClaOSCA8與SlOSCA5，Ⅴ亞族的ClaOSCA2與AtOSCA8，以及Ⅵ亞族的ClaOSCA4與AtOSCA7、ClaOSCA1與SlOSCA8。西瓜OSCA基因家族中平行同源基因?qū)棰鰜喿宓腃laOSCA5和ClaOSCA9。Ⅳ亞族和Ⅵ亞族中OSCA基因數(shù)量較多，表明亞家族Ⅳ和Ⅵ中OSCA基因可能發(fā)生了功能分化。此外系統(tǒng)進(jìn)化樹中亞家族I、II、Ⅲ和Ⅴ中OSCA基因數(shù)量較少，但這部分OSCA基因在進(jìn)化中得以保留，說明在某些生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

順式作用元件對(duì)于旁側(cè)基因的功能調(diào)控具有重要作用，本研究提取西瓜OSCA基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000 bp的序列進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)域分析，發(fā)現(xiàn)存在多個(gè)與脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件（表4）。西瓜OSCA基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件主要包括響應(yīng)植物激素與非生物逆境脅迫的順式元件，其中，響應(yīng)非生物脅迫的順式作用元件主要包括厭氧誘導(dǎo)順式元件（ARE）、冷脅迫應(yīng)答順式元件（LTR）、光反應(yīng)順式元件（G-box）、干旱脅迫應(yīng)答順式元件（MBS）及防衛(wèi)和逆境應(yīng)答順式元件（TC-rich repeats）。西瓜OSCA基因家族中有9個(gè)OSCA基因含厭氧誘導(dǎo)順式元件ClaOSCA1、ClaOSCA4、ClaOSCA5、ClaOSCA6和ClaOSCA8含有涉及低溫誘導(dǎo)性的冷脅迫應(yīng)答順式元件。ClaOSCA4、ClaOSCA5和ClaOSCA7含有順式元件，說明這3個(gè)成員與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

2. 6 西瓜OSCA基因家族基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的脅迫響應(yīng)分析

利用下載的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)西瓜OSCA基因家族的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果（圖9）顯示，在干旱、低溫和鹽脅迫下，西瓜OSCA基因家族各成員表達(dá)量均有不同程度變化，表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。在20% PEG6000脅迫下處理6 h后，ClaOSCA6和ClaOSCA8表達(dá)量上調(diào)，此外ClaOSCA1、ClaOSCA3和ClaOSCA5表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05，下同），而ClaOSCA4和ClaOSCA6表達(dá)量變化較?。▓D9-A），說明ClaOSCA4和ClaOSCA6表達(dá)一般不受干旱脅迫的影響。經(jīng)過4 ℃低溫脅迫條件誘導(dǎo)6 h后ClaOSCA7表達(dá)量上調(diào)（圖9-B），其他9個(gè)基因均下調(diào)表達(dá)，其中，ClaOSCA2、ClaOSCA3和ClaOSCA5表達(dá)量出現(xiàn)顯著下調(diào)。而在3 mmol/L KCl脅迫下處理6 h后ClaOSCA1、ClaOSCA3和ClaOSCA5表達(dá)量顯著上調(diào)，ClaOSCA4表達(dá)量基本不變，ClaOSCA7、ClaOSCA8和ClaOSCA10表達(dá)量下調(diào)（圖9-C）。綜合上述脅迫響應(yīng)情況表明，西瓜OSCA基因家族內(nèi)部在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了功能分化。此外，對(duì)西瓜OSCA基因表達(dá)情況進(jìn)行分析與篩選，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系較近的ClaOSCA3和ClaOSCA5在3種不同脅迫條件下表達(dá)量變化明顯，脅迫響應(yīng)結(jié)果與2.5中2個(gè)基因家族成員的啟動(dòng)子順式作用元件分析相對(duì)應(yīng)，由此推測(cè)ClaOSCA3和ClaOSCA5可能為重要抗逆OSCA基因。

2. 7 重要抗逆基因的表達(dá)分析

運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)對(duì)重要抗逆基因ClaOSCA3和ClaOSCA5進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)，結(jié)果（表5）表明：經(jīng)過20% PEG6000脅迫條件誘導(dǎo)6 h后，ClaOSCA3和ClaOSCA5表達(dá)量顯著下調(diào);在4 ℃下處理6 h后ClaOSCA3和ClaOSCA5表達(dá)量顯著下調(diào);在經(jīng)過3 mmol/L KCl脅迫條件誘導(dǎo)6 h后ClaOSCA3和ClaOSCA5均響應(yīng)強(qiáng)烈。上述結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析結(jié)果基本相符合，進(jìn)一步驗(yàn)證ClaOSCA3和ClaOSCA5在脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。

3 討論

鈣離子在誘導(dǎo)植物抗逆性應(yīng)對(duì)非生物逆境脅迫條件過程中發(fā)揮著重要作用，而鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)與能感知細(xì)胞滲透勢(shì)變化的鈣離子通道蛋白OSCA密切相關(guān)，因此對(duì)西瓜OSCA基因家族的研究為西瓜遺傳改良提供了依據(jù)。本研究基于西瓜基因數(shù)據(jù)庫對(duì)OSCA基因家族進(jìn)行了全面分析，運(yùn)用生物信息學(xué)的方法鑒定出10個(gè)OSCA基因。基因復(fù)制事件對(duì)基因家族拓展尤其重要，對(duì)西瓜OSCA基因家族進(jìn)行共線性分析的結(jié)果表明在基因家族中存在片段重復(fù)，推測(cè)片段復(fù)制事件發(fā)生在單雙子葉分化時(shí)期（200～205 Mya）之后。基于系統(tǒng)發(fā)育分析，西瓜OSCA基因家族被分為3個(gè)類群。從基因結(jié)構(gòu)分析來看同一個(gè)類群的外顯子一內(nèi)含子組成模式相似，與大豆OSCA基因家族的研究報(bào)道（李建偉等，2017）一致，也表明保守的基因復(fù)制現(xiàn)象出現(xiàn)在同一類群的OSCA基因家族拓展中。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，同一類群成員的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)量比例和蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型比較相似。此外，西瓜OSCA基因家族成員均含有完整的DUF221特征結(jié)構(gòu)域，與前人對(duì)擬南芥（Yuan et al.，2014）和番茄（王傲雪等，2019）等植物OSCA基因家族保守結(jié)構(gòu)域的研究報(bào)道相一致。OSCA蛋白此前在被認(rèn)為是跨膜通道蛋白和早期脫水應(yīng)激蛋白（Yuan et al.，2014），本研究中西瓜OSCA蛋白的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果與蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果相符合，表明西瓜OSCA蛋白均為膜蛋白。綜上所述，西瓜OSCA基因在進(jìn)化過程中具有一定保守性。

西瓜、水稻、番茄和擬南芥OSCA基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示西瓜與番茄之間存在4個(gè)垂直同源基因?qū)?，表明西瓜OSCA基因與番茄OSCA基因的親緣關(guān)系相對(duì)更近。此外，在西瓜OSCA基因啟動(dòng)子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了特異且與光反應(yīng)有關(guān)的光反應(yīng)順式作用調(diào)節(jié)元件，但目前沒有在其他植物中發(fā)現(xiàn)，需要進(jìn)一步探究。前人研究表明，OSCA是一種高滲脅迫響應(yīng)通道蛋白，且初步驗(yàn)證了OSCA基因與植物的逆境調(diào)節(jié)相關(guān)（Yuan et al.，2014）。本研究發(fā)現(xiàn)ClaOSCA3的啟動(dòng)子區(qū)域不含冷脅迫應(yīng)答順式作用元件，然而ClaOSCA3表達(dá)量在低溫脅迫下變化明顯，由此可推測(cè)單一脅迫條件誘導(dǎo)下，其他順式元件也能起到關(guān)鍵調(diào)控作用，或者啟動(dòng)子區(qū)域存在未被鑒定出的相關(guān)順式元件。ClaOSCA6和ClaOSCA7存在片段復(fù)制現(xiàn)象，這2個(gè)基因家族成員的啟動(dòng)子區(qū)域包含不同的順式元件，兩者的表達(dá)模式也有差異，說明基因組復(fù)制的過程中也存在功能分化現(xiàn)象。ClaOSCA3和ClaOSCA5在干旱、低溫和鹽脅迫條件下響應(yīng)強(qiáng)烈，由此推測(cè)ClaOSCA3和ClaOSCA5應(yīng)答3種脅迫的反應(yīng)通路中存在交互性。已有研究表明，逆境下植物體內(nèi)鈣信號(hào)會(huì)迅速增加，高滲脅迫感受蛋白ClaOSCA的應(yīng)激反應(yīng)特性需進(jìn)一步研究，而目前鈣信號(hào)調(diào)控下的西瓜OSCA脅迫響應(yīng)分子機(jī)制尚未被解析完整，仍需在今后的研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

西瓜OSCA基因在進(jìn)化過程中具有一定保守性，與擬南芥、番茄和水稻OSCA基因存在較近親緣關(guān)系。西瓜OSCA基因家族內(nèi)部存在功能分化，ClaOSCA3和ClaOSCA5可能是脅迫響應(yīng)機(jī)制中的重要抗逆基因。

參考文獻(xiàn)：

顧小雨. 2017. 梨OSCA基因家族分析及PbrOSCA2.6和PbrOSCA3.2的功能驗(yàn)證[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué). [Gu X Y. 2017. OSCA family analysis and functional validation of PBOSCA2.6 and PBOSCA3.2 in Pyrus[D]. Nanjing：Nanjing Agricultural University.]

雷召雄，柏雪，林亞秋，李健，字向東，熊顯榮，熊燕. 2019. 牦牛Lkb1基因編碼區(qū)克隆及其在骨骼肌的表達(dá)分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，27（1）：71-79. [Lei Z X，Bai X，Lin Y Q，Li J，Zi X D，Xiong X R，Xiong Y. 2019. Cloning region cloning of Yak（Bos grunniens） Lkb1 gene and its expression analysis in skeletal muscle[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，27（1）：71-79.] doi：10.3969/j.issn. 1674-7968.2019.01.008.

李建偉，楊珺凱，賈博為，孫明哲，劉瑀，殷奎德，孫曉麗. 2017. 大豆基因組中OSCA基因家族的進(jìn)化和表達(dá)分析[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)，39（5）：589-599. doi：10.7505/j.issn.1007-9084.2017.05.002. [Li J W，Yang J K，Jia B W，Sun M Z，Liu Y，Yin K D，Sun X L. 2017. Evolution and expression analysis of OSCA gene family in soybean[J]. Chinese Journal of Oil Crops Sciences， 39（5）：589-599.] doi：10.7505/j.issn.1007-9084.2017.05.002.

王傲雪，張可為，張瑤，陳秀玲，劉佳音. 2019. 番茄OSCA基因家族鑒定及不同脅迫條件下表達(dá)分析[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，（1）：19-28. [Wang A X，Zhang K W，Zhang Y，Chen X L，Liu J Y. 2019. Identification of tomato OSCA gene family and expression analysis under different stress conditions[J]. Journal of Northeast Agricultural University，（1）：19-28.] doi：10.19720/j.cnki.issn.1005-9369.2019. 01.003.

王超楠，朱強(qiáng)龍，崔浩楠，崔博銘，王欣，欒非時(shí). 2018. 西瓜CDPK基因家族鑒定與特征分析[J]. 北方園藝，（17）：1-6. [Wang C N，Zhu Q L，Cui H N，Cui B M，Wang X，Luan F S. 2018. Identification and characteristic analysis of CDPK gene family[J]. Northern Horticulture，（17）：1-6.] doi：10.11937/bfyy.20180692.

趙訓(xùn)超，魏玉磊，丁冬，劉夢(mèng)，蓋勝男，張今杰，邵文靜，李嘉欣，徐晶宇. 2021. 甜蕎麥脂肪酸脫氫酶基因（FeFAD）家族的鑒定與分析[J]. 東北農(nóng)業(yè)科學(xué)，46（1）：36-41. [Zhao X C，Wei Y L，Ding D，Liu M，Gai S N，Zhang J J，Shao W J，Li J X，Xu J Y. 2021. Genome-wide identification and bioinformatics analysis of fatty acid desaturase gene （FeFAD） family in common buckwheat[J]. Journal of Northeast Agricultural Sciences， 46（1）：36-41.] doi：10. 16423/j.cnki.1003-8701.2021.01.010.

趙陽，王玉，蔡慧林，程備久，馬慶. 2015. 玉米脫水素基因家族的鑒定與分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，42（5）：657-665. [Zhao Y，Wang Y，Cai H L，Cheng B J，Ma Q. 2015. Identification and characterization of the dehydrin gene family in maize[J]. Journal of Anhui Agricultural University，42（5）：657-665.] doi：10.13610/j.cnki.1672-352x.20150825.028.

趙鐘毓，侯丹，胡秋濤，魏涵天，鄭穎，林新春. 2020. 毛竹PeNAC047基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，28（1）：58-71. [Zhao Z Y，Hou D，Hu Q T，Wei H T，Zheng Y，Lin X C. 2020. Cloning and expression analysis of PeNAC047 gene in Phyllostachys puercens[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，28（1）：58-71.] doi：10. 3969/j.issn.1674-7968.2020.01.006.

朱強(qiáng)龍，趙玉龍，呂慧玲，欒非時(shí)，高鵬. 2017. 西瓜CBL家族基因的鑒定與特征分析[J]. 北方園藝，（15）：18-24. [Zhu Q L，Zhao Y L，Lü H L，Luan F S，Gao P. 2017. Identification and characterization of CBL family genes in watermelon[J]. Northern Horticulture，（15）：18-24.] doi：10. 11937/bfyy.20170580.

Bartels D，Sunkar R. 2005. Drought and salt tolerance in plants[J]. Critical Reviws in Plant Sciences，24（1）：23-58. doi：10.1080/07352680590910410.

Batistic O，Kudla J. 2012. Analysis of calcium signaling pathways in plants[J]. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）- General Subjects，1820（8）：1283-1293. doi：10.1016/j.bbagen.2011.10.012.

Chen C J，Chen H，Zhang Y，Thomas H R，F(xiàn)rank M H，He Y H，Xia R. 2020. TBtools：An integrative toolkit deve-loped for interactive analyses of big biological data[J]. Mollecular Plant，13（8）：1194-1202. doi：10.1016/j.molp. 2020.06.009.

Hou C C，Tian W，Kleist T，He K，Garcia V，Bai F L， Hao Y L，Luan S，Li L G. 2014. DUF221 proteins are a family of omosensitive calcium-permeable cation channels conserved across eukaryotes[J]. Cell Research，24（5）：632-635. doi：10.1038/cr.2014.14.

Hu B，Jin J P，Guo A Y，Zhang H，Luo J C，Gao G. 2015. GSDS 2.0：An upgraded gene feature visualization server[J]. Bioinformatics，31（8）：1296. doi：10.1093/bioinformatics/btu817.

Kumar S，Stecher G，Tamura K. 2016. MEGA7：Molecularevolu-tionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution，33（7）：1870-1874. doi：10.1093/molbev/msw054.

Larkin M A，Blackshields G，Brown N P，Chenna R，McGettigan P A， McWilliam H，Valentin F，Wallence I M， Wilm A，Lopez R，Thompson J D，Gibson T J，Higgins D G. 2007. Clustal W and Clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics，23（21）：2947-2948. doi：10.1093/bioinformatics/btm404.

Lescot M， Déhais P， Thijs G， Marchal K， Moreau Y， Van de Peer Y， Rouzé P， Rombauts S. 2002. PlantCare， a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences[J]. Nucleic Acids Research，30（1）：325-327. doi：10. 1093/nar/30.1.325.

Li Y S，Yuan F，Wen Z H，Li Y H，Wang F，Zhu T，Zhuo W Q，Jin X，Wang Y D，Zhao H P，Pei Z M，Han S C. 2015. Genome-wide survey and expression analysis of the OSCA gene family in rice[J]. BMC Plant Biology， 15：261-273. doi：10.1186/s12870-015-0653-8.

Wang Y P，Tang H B，DeBarry J D，Tan X，Li J P，Wang X Y，Lee T H，Jin H Z，Marler B，Guo H，Kissinger J C，Paterson A H. 2012. MCScanX：A toolkit for detection and evolutionary analysis of gene synteny and collinearity[J]. Nucleic Acids Rescarch，40（7）：e49. doi：10.1093/nar/gkr1293.

Yuan F，Yang H M，Xue Y，Kong D D，Ye R，Li C J，Zhang J Y ，Theprungsirikul L ，Shrift T，Krichilsky B. 2014. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis[J]. Nature，514（7522）：367-367. doi：10.1038/nature13593.

Yuan S X，Xu B，Zhang J，Xie Z N，Cheng Q，Yang Z M，Cai Q S，Huang B R. 2015. Comprehensive analysis of CCCH-type zinc finger family genes facilitates functional gene discovery and reflects recent allopolyploidization event in tetraploid switchgrass[J]. BMC Genomics，16：129-145. doi：10.1186/s12864-015-1328-4.

Zhu J K. 2002. Salt and drought stress siginal transduction in plants[J]. Annual Review of Plant Biology， 53：247-273. doi：10.1146/annurev.arplant.53.091401.143329.

（責(zé)任編輯 鄧慧靈）